JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта работа представляет собой протокол для создания культуры клеточной подвески, полученной из чая(Camellia sinensis L.) листья, которые могут быть использованы для изучения метаболизма внешних соединений, которые могут быть рассмотрены всего растения, такие как инсектициды.

Аннотация

Разработана платформа для изучения метаболизма инсектицидов с использованием тканей в пробирке чайного растения. Листья из стерильных чайных растений были индуцированы, чтобы сформировать свободные каллусы на Мурашиге и Skoog (MS) базальных носителей с растительными гормонами 2,4-dichlorophenoxyacetic кислоты (2,4-D, 1,0 мг L-1) и kinetin (KT, 0,1 мг L-1). Каллус формируется после 3 или 4 раундов субкультирования, каждый из которых длится 28 дней. Свободный каллуса (около 3 г) затем прививался в В5 жидких носителей, содержащих те же растительные гормоны и культивировался в дрожащий инкубатор (120 об/мин) в темноте при 25 и 1 градус цельсия. После субкультуры, 3х4, клеточная суспензия, полученная из листьев чая, была установлена в соотношении субкультуры в диапазоне от 1:1 до 1:2 (жидкость для матери подвески: свежая среда). Используя эту платформу, шесть инсектицидов (5 мкг мл мл-1 каждый тиаметоксам, имидаклоприд, ацетамиприд, имидаботиз, диметоат и ометоят) были добавлены в культуру клеточной суспензии, полученной из чайного листа. Метаболизм инсектицидов отслеживался с помощью жидкой хроматографии и газовой хроматографии. Для проверки полезности культуры суспензии чайных клеток метаболиты тиаметоксана и диметоата, присутствующие в обработанных клеточных культурах и нетронутых растениях, были сравнены с помощью масс-спектрометрии. В обработанных культурах чайных клеток было обнаружено семь метаболитов тиаметоксана и два метаболита диметоата, в то время как в обработанных нетронутых растениях были обнаружены только два метаболита тиаметоксама и один диметоат. Использование клеточной суспензии упростило метаболический анализ по сравнению с использованием нетронутых чайных растений, особенно для сложной матрицы, такой как чай.

Введение

Чай является одним из наиболее широко потребляемых безалкогольных напитков в мире1,2. Чай производится из листьев и почек древесных многолетних Camellia sinensis L. Чай растения выращиваются на обширных плантациях и восприимчивы к многочисленным насекомым-вредителям3,4. Органофосфор и неоникотиноидные инсектициды часто используются в качестве системных инсектицидов5 для защиты чайных растений от вредителей, таких как белокрылки, листовые бункеры, и некоторые виды лепидоптеран6,7. После применения эти инсектициды поглощаются или перемещаются в растение. Внутри растения эти системные инсектициды могут трансформироваться путем гидролизов, окисления или снижения реакций растительных ферментов. Эти продукты преобразования могут быть более полярными и менее токсичными, чем родительские соединения. Однако, для некоторых органофосфатов, биоактивность некоторых продуктов выше. Например, ацефат метаболизируется в более токсичные метамидофос8,9,и диметоат в ометоате10,11. Таким образом, метаболические исследования растений имеют важное значение для определения судьбы пестицида в пределах завода12.

Культуры тканей растений оказались полезной платформой для исследования метаболизма пестицидов, с выявленными метаболитами, аналогичными тем, которые содержатся в нетронутых растениях13,14,15. Использование культур тканей, особенно культур суспензии клеток, имеет ряд преимуществ. Во-первых, эксперименты могут проводиться без микроорганизмов, избегая тем самым вмешательства в трансформацию пестицидов или деградацию микробов. Во-вторых, культура тканей обеспечивает последовательные материалы для использования в любое время. В-третьих, метаболиты легче извлекать из культур тканей, чем из нетронутых растений, и ткани культур часто имеют меньше интершеринговых соединений и более низкой сложности соединений. Наконец, культуры тканей могут быть более легко использованы для сравнения серии метаболизма пестицидов в одном эксперименте16.

В этом исследовании была успешно установлена клеточная суспензия, полученная из листьев выращенного стерильным чайного растения. Культура подвески чайных клеток была затем использована для сравнения поведения рассеяния шести системных инсектицидов.

Этот подробный протокол предназначен для обеспечения некоторых указаний, так что исследователи могут установить платформу культуры тканей растений полезно для изучения метаболических судьба ксенобиотики в чае.

протокол

1. Культура чайного каллуса

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные листья были получены из витровых растительных линий, впервые разработанных в исследовательской группе17. Все процедуры до раздела 5 проводились в стерильном ламинарном капюшоне, за исключением культурного времени в инкубаторе.

  1. Отрегулируйте рН двух носителей (Мурашиге и Скуг «MS» базальная среда и Гамборг B5 жидкой среды) до 5,8 до автоклавирования (121 КС, 20 мин).
  2. Нарежьте вдоль средней вены стерильного листа ножницами, а затем разделите каждую половину на мелкие кусочки около 0,3 см х 0,3 см в чашке Петри.
  3. Поместите стерильные экспланты (мелкие кусочки листьев) на базальные носители MS, содержащие растительные гормоны 2,4-D (1,0 мг Л-1) и КТ (0,1 мг Л-1). Шесть эксламов могут быть помещены в колбу 300 мл, содержащую 100 мл базальных носителей MS.
  4. Культура выше листа explants при постоянной температуре 25 градусов по Цельсию в темноте. После 28 дней, выберите первое поколение индуцированного каллуса и перенести на свежую колбу (субкультуру). Приобретайте рыхлый и рыхлый каллуса после субкультур ы 3х4.

2. Культура подвески клетки чая

  1. Разрежьте энергичные, рыхлые и рыхлые мозоли из твердой среды на мелкие кусочки (диапазон здесь 0,5-2 мм) с помощью стерильного хирургического лезвия в стерильных условиях.
  2. Вес около 3 г маленьких кусочков каллуса. Поместите каллус в колбу 150 мл, содержащую 20 мл жидких носителей B5, дополненных 2,4-D (1,0 мг L-1) и KT (0,1 мг L-1).
  3. Культура жидкой подвески клеток при постоянной температуре (25 и 1 кВ) в встряхивая инкубатор при 120 об/мин в темноте.
  4. После 7 до 10 дней культивирования, удалить культуры фляги и дайте им постоять в течение нескольких минут.
  5. Возьмите все супернатанта в качестве семенного материала для субкультуры в свежую среду (субкультуры соотношение подвесной материнской жидкости к свежей средней диапазоне между 1:1 и 1:2). Удалите осажданные, большие мозоли.
  6. Получите окончательную хорошо выращенную культуру подвески клеток после 3-4 циклов субкультуры по 28 дней каждый.

3. Трифенил тетразолий хлорид асссид жизнеспособности клеток

  1. Убейте образец живых клеток при 100 градусах По Цельсия в течение 10 минут в качестве контрольной ячейки до окрашивания жизнеспособности.
  2. Центрифуга все культуры подвески клеток в течение 8 мин при 6000 х г. Удалите супернатант перед приостановкой клеток в 2,5 мл фосфатно-буферного соленого (PBS) буфера (pH 7.3), и встряхните его в течение 1 мин вручную.
  3. Добавьте 2,5 мл раствора хлорида трифенил тетразолий (ТТК) и снова пожмите рукой.
  4. Инкубировать смесь в течение 1 ч в стоящем инкубаторе (30 градусов по Цельсию).

4. Обработка и отбор проб суспензии чайных клеток культур с инсектицидами

  1. Добавьте аликот в 400 л фильтростеризованного стокового раствора (500 мкг млл .1) четырех неоникотиноидов (тиаметоксам, ацетамиприд, имидаклоприд и имидаботиз) или два органофосфата (диметоат и ометоат) в клеточную суспензию, Соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если цель состоит в том, чтобы сравнить ксенобиотповедения, используйте ту же мать партии клеточных суспензий для тестирования различных соединений.
  2. Культура образцы клеточных суспензий с инсектицидами при постоянной температуре (25 и 1 кС) и скорость встряхивания инкубатора (120 об/мин). Возьмите пробы (см. шаг 4.3 или 4.4) на 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 и 75 дней.
  3. Чтобы проверить образец, содержащий неоникотиноид, удалите 1 мл аликот однородной клеточной культуры, поместите его в пластиковую центрифугу мощностью 1,5 мл и центрифугу на 4000 х г в течение 2 мин.
    1. Передайте супернатанты через 0,22-мкм пор-размер фильтра мембраны перед анализом высокопроизводительной жидкой хроматографии-ультрафиолетового (HPLC-UV) и сверхвысокой производительности жидкой хроматографии-квадруполь время полета (UPLC-TOF) массы спектрометрия (Таблица материалов).
  4. Чтобы проверить образец, содержащий органофосфат, удалите 500-й аликот клеточной культуры и поместите в центрифугу мощностью 35 мл или пластиковую центрифугу мощностью 1,5 мл (подготовьте последний образец, как у неоникотиноидной).
    1. Добавьте 0,1 г хлорида натрия и 5 мл ацетона/этилового ацетата (3:7, v/v) в центрифугу 35 мл из 500 образцов л.
    2. Vortex смеси в течение 1 мин, а затем дать им отдохнуть в течение 10 мин.
    3. Возьмите 2,5 мл супернатанта в стеклянную трубку 10 мл и испаряйтесь до почти сухости с помощью азотного испарителя при 40 градусах Цельсия.
    4. Растворите остатки с 1 мл ацетона, вихрем в течение 1 мин, пройдите его через мембрану фильтра 0,22 мкм перед анализом с помощью газовой хроматографии-пламенного фотометрического детектора (GC-FPD).

5. Образцовая подготовка нетронутого чайного растения с инсектицидами

ПРИМЕЧАНИЕ: Нетронутые испытания чай завода было проведено в гидропонной системе с использованием чайныхсаженцев, выращенных в 50 мл питательного раствора (30 NH 4, 10 NO3-, 3,1 PO4-, 40 K,20 Ca2", 25 Mg2 "0,35 Fe2 "0,1 B 3", 1,0 млн.т 2", 0,1 "n2", 0,025 Cu2", 0,05 М,и 10 Al3", в мг L-1)18. Экспериментальная теплица находилась под светлым циклом (12 ч света и 12 ч темноты) при 20 градусах Цельсия в Аграрном университете Аньхой.

  1. Положите пять растений в 4 l пластиковый горшок в течение 15 дней.
  2. Добавьте 0 промилле (контроль) или 100 промилле тиаметоксама или диметоата в пластиковые горшки, соответственно.
  3. Подготовьте нетронутый образец растения по предыдущему методу, за исключением предварительного замачивания19,а затем проанализируйте с масс-спектрометрией для точного массового спектра.

6. Анализ инструментов

  1. HPLC анализ метаболического поведения неоникотиноидов
    1. Используйте HPLC-УФ(Таблица материалов) для обнаружения содержания и метаболических продуктов тиаметоксам и ацетамиприда на длине волны 254 нм, а также имидаклоприд и имидатотриз на 270 нм в образцах из раздела 4.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние HPLC-UV было таким же, как и предыдущее исследование19.
  2. ГК-анализ метаболического поведения органофосфатов
    1. Обнаружение содержания диметоата и ометоата в образцах из раздела 4.4 с помощью GC-FPD с помощью хиральной колонки(Таблицаматериалов).
    2. Используйте азот в качестве переносица газа и установите скорость потока на уровне 1,0 мл мин-1.
    3. Установите начальную температуру до 120 градусов по Цельсию, и удерживайте ее в течение 5 мин. Увеличьте температуру до 150 градусов по Цельсию при температуре 30 градусов по Цельсию-1 и удерживайте в течение 3 мин. Увеличьте до 170 градусов по Цельсию при температуре 10 градусов по Цельсию-1 и удерживайте в течение 7 мин. Окончательно увеличивайте до 210 градусов по Цельсию при 30 градусах по Цельсиюмин -1, а затем удерживайте в течение 5 мин.
    4. Установите температуру впрыска до 200 градусов по Цельсию в режиме без сплита; Установите температуру детектора до 250 градусов по Цельсию.
    5. Установите объем инъекции до 1 зл.
  3. Анализ уПЛК-ТОФ метаболитов инсектицидов в клеточной культуре
    1. Обнаружение метаболитов инсектицидов в клеточной культуре (образцы из раздела 4.3) с помощью UPLC-TOF с колонкой C18 (Таблицаматериалов).
    2. Установите скорость потока до 0,2 мл мин-1. Установите объем инъекции до 10 зл.
    3. Для неоникотиноидных проб установите начальную мобильную фазу до 85% А (5 мМ аммония для воды) и 15% B (ацетонитрил). Более 10 мин, увеличить мобильный этап B до 38% и вернуться к 15% в течение 1 мин, удерживайте в течение 9 мин.
    4. Для обработанных органофосфатами образцов установите начальную подвижную фазу до 55% А (0,1% для воды с использованием кислоты) и 45% В (ацетонитрил). Более 5 мин, увеличить мобильную фазу B до 70%, затем вернуться к 45% B в течение 0,5 мин, удерживайте в течение 2,5 мин.
    5. Установите параметры операции ВТОО: температура газа, 325 градусов по Цельсию; сушки газа (азот), 10 л мин-1; температура оболочки газа, 350 градусов по Цельсию; поток оболочки газа, 11 л мин-1; капиллярное напряжение, 4000 В; напряжение сопла, 1000 В; напряжение фрагменторов, 100 V для неоникотиноидных инсектицидов или 110 В для инсектицидов органофосфора; скиммер напряжение, 65 В; работает в положительном ионном режиме.
    6. Установите инструмент в полный спектр сканирования и целевой режим MS/MS.
    7. Обработка данных с помощью точных средств массовой информации; Вывод метаболитов без стандартных продуктов из MS / MS аннотации, а также литературы12,15,20,21,22.
  4. UPLC-Orbitrap анализ метаболитов инсектицидов в нетронутом растительном экстракте
    1. Обнаружение метаболитов инсектицидов в нетронутом растительном экстракте с помощью масс-спектрометрии UPLC-Orbitrap(Таблицаматериалов).
    2. Установите параметры работы масс-спектрометрии(Таблицаматериалов) следующим образом: давление газового оболочки, 35 арб; температура газа, 300 градусов по Цельсию; напряжение сопла, 3,5 кВ; температура капилляров, 350 градусов по Цельсию.
    3. Установите программы elution в качестве выше (шаги 6.3.3 и 6.3.4) для анализа upLC-TOF клеточной культуры.

Результаты

Индукция каллуса из листьев, собранных из выращенных на местах чайных деревьев и из листьев, вырезанных из чайных растений, выращенных в пробирке в стерильной среде, сравнивалась путем измерения загрязнения, подрумянивания и индукции после 28 дней выращивания на MS media (...

Обсуждение

В этой статье представлен подробный процесс создания модели метаболизма пестицидов в тканях чайного растения, включая выбор эксплантаторов, определение жизнеспособности клеток, а также создание культуры суспензии чайных клеток с высоким метаболизмом Деятельности. Любые части расти?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и развития (2016YFD0200900) Китая, Национальным фондом естественных наук Китая (No 31772076 и No 31270728), Китайским фондом постдокторской науки (2018M630700) и Открытым фондом Государственная ключевая лаборатория биологии и утилизации чайных растений (SKLTOF20180111).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetamiprid (99.8%)Dr. Ehrenstorfer46717CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%)TediaAS1122-801CAS No: 75-05-8
AgarSolarbio Science & TechnologyA8190CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%)Dr. Ehrenstorfer525CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%)Dr. Ehrenstorfer109217CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%)Dr. Ehrenstorfer91029CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%)Toronto Research ChemicalI275000CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%)Solarbio Science & TechnologyK8010CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%)Dr. Ehrenstorfer105491CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)Solarbio Science & TechnologyP8070CAS No: 25249-54-1
SucroseTocris Bioscience5511CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%)Dr. Ehrenstorfer20625CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%)Solarbio Science & TechnologyT8170CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%)Guangzhou Saiguo BiotechD8100CAS No: 94-75-7
chiral columnAgilent CYCLOSIL-B112-6632Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC)Shimadu2010-PlusPaired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC)Agilent1260Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 columnWaters186003539Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)Agilent1290-6545Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)Thermo ScientificUltimate 3000-Q Exactive FocusConnected to a Orbitrap mass spectrometer

Ссылки

  1. Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
  2. Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
  3. Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
  4. Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
  5. Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
  6. Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
  7. Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
  8. Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
  9. Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
  10. Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
  11. Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
  12. Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
  13. Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
  14. Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
  15. Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
  16. Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
  17. Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
  18. Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
  19. Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
  20. Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
  21. Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
  22. Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
  23. Yang, G. W. . Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).
  24. Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
  25. Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
  26. Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
  27. Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
  28. Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
  29. Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
  30. Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены