Дифференциация способности человека аорты периваскулярной жировой клетки-предшественники

Резюме

Цель настоящего Протокола заключается в проверить способность прародитель клетки, полученные из жировой ткани человека периваскулярной дифференцироваться в несколько линий клеток. Дифференциация была по сравнению с мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека, который известен дифференцироваться в Адипоцит, остеоциты и хондроцитов линий.

Аннотация

Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном родов. Адипогенном дифференцировки клеток-предшественников является механизмом основных вождения расширения жировой ткани и дисфункции в ответ на ожирение. Таким образом, понимание изменения периваскулярной жировой ткани (PVAT) является клинически значимых метаболических заболеваний. Однако, предыдущие исследования были преимущественно в мыши и других животных моделей. Этот протокол использует человеческой грудной PVAT пробах из пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Жировой ткани от восходящей части аорты был собирается и используется для эксплантация стромальные сосудистой дроби. Мы ранее подтвердил наличие жировых прогениторных клеток в человека PVAT мощностью дифференцироваться в содержащих липидов адипоцитов. В этом исследовании мы дополнительно проанализировать потенциал дифференцировки клеток стромы сосудистой фракции, предположительно содержащих несколькими мощными прогениторных клеток. Мы сравнили PVAT-производные клеток костного мозга человека MSC для дифференциации в адипогенном, остеогенные и хондрогенном родов. После 14 дней дифференциации, конкретные пятна были использованы для выявления накопление липидов в адипоцитов (масло красный O), calcific месторождения в Остеогенные клетки (ализарин красный), или гликозаминогликанов и коллагена в клетках хондрогенном (Массон в Trichrome). Хотя костного MSC эффективно продифференцировано во всех трех линий, PVAT-производные клетки были адипогенном и хондрогенном потенциал, но не хватает надежных Остеогенные потенциал.

Введение

Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном линий¹. Эта ткань расширяет через гипертрофия адипоцитов зрелой и de novo дифференциация резидентов КБМ адипоцитов. Периваскулярной жировой ткани (PVAT) окружает кровеносных сосудов и регулирует функции сосудистого^2,3. Ожирение индуцированной PVAT расширения усугубляет сердечно-сосудистой патологии. Хотя Multipotent с потенциал MSC от человека подкожных жировых депо были хорошо изучены^4,5, исследования не описаны и оценены возможности дифференцировки клеток-предшественников человека PVAT-производные, вероятно, из-за инвазивность закупок. Таким образом цель этой работы заключается в обеспечивают методологию для explant и распространять клетки-предшественники из человека PVAT аорты у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и проверки их склонность различать на остеогенные, хондрогенном и адипогенном линий. Наш источник PVAT — сайт анастомоза шунтирования на восходящей аорты ожирением пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Свеже изолированные PVAT ферментативно отделить и стромы сосудистой фракции изолированных и распространяются в пробирке, позволяя нам в первый раз проверить возможности дифференциации клеток-предшественников человека PVAT-производные.

С помощью первичных искусственного человека PVAT стромальные сосудистой дроби, мы проверили три анализов, призванных побудить стволовых/прогениторных клеток дифференцировать сторону адипогенном, остеогенные, или хондрогенном линий. Наши предыдущие исследования определили населения CD73 +, CD105 + и PDGFRa + (CD140a) клеток, которые могут надежно дифференцировать в адипоцитов⁶, хотя их multipotency не был протестирован. PVAT непосредственно регулирует сосудистый тонус и воспаление⁷. Обоснование для тестирования потенциал дифференциации населения этот роман клеток является чтобы начать понимать специализированные влияние PVAT на сосудистой функции и механизмы расширения PVAT при ожирении. Эта методология расширяет наше понимание функций производным прародителя жировой клетки и позволяет нам определить и сравнить сходства и различия клетки-предшественники из источников различных тканей. Мы строим на установленные и проверенные подходы для изоляции и дифференциации MSC направлении различных линий и оптимизировать процедуры для обеспечения максимальной жизнеспособности клеток-предшественников человека PVAT-производные. Эти методы имеют широкое применение в области стволовых и прогениторных клеток жировой ткани и исследования развития.

протокол

Использование человеческих тканей в этом исследовании был оценены и одобрены организационного обзора Совет от Мэн медицинский центр, и все сотрудники получили соответствующую подготовку до экспериментов.

1. Подготовка

1. Сделать диссоциации буфера путем воссоздания 50 мг животных бесплатно коллагеназы/dispase смесь я решение с 1 мл раствора рабочего 1 мг/мл nanopure H₂O. подготовка, добавив 49 мл высокой глюкозы DMEM, содержащие 1% w/v BSA восстановленный коллагеназы / dispase решение. Хранить 5 мл аликвоты рабочих при-20 ° C и тепло до 37 ° C, с использованием предварительного Ванна воды для использования.
2. Сделать, добавив 1 мл раствора 100 x антибиотик/противогрибковое (конечная концентрация-200 единиц/мл пенициллин, 200 единиц/мл стрептомицина и 0,5 мкг/мл fungizone) 49 мл HBSS Антибиотик раствор и хранить на льду.
3. Готовят раствор желатина (0,2% w/v) путем растворения желатина 200 мг из кожи крупного рогатого скота в 100 мл nanopure H₂O. автоклава решение для 20 мин и хранить при 4 ° C.
4. Подготовка 500 мл PVAT роста СМИ: высокие глюкоза DMEM/F12 с глютамин добавки, пируват натрия, бикарбонат натрия, дополненная 10% FBS и антимикробное средство 100 мкг/мл (см. Таблицу материалы).
5. Подготовка 50 мл адипогенном индукции СМИ: 40,8 мл высокий глюкозы DMEM, дополнена 7,5 мл PVAT роста СМИ, 500 мкл, 100 x антибиотик/противогрибковое решения (конечная концентрация 100 единиц/мл пенициллин, 100 единиц/мл стрептомицина и fungizone 0,25 мкг/мл), 0,5 мм IBMX (500 мм сток в 0,1 М NaOH), дексаметазона 1 мкм (1 мм сток в этиловом спирте), 5 мкм Росиглитазон (5 мм сток в ДМСО), 33 мкм биотин (66 мм сток в ДМСО), 100 Нм инсулина (200 µM сток в 0,1% уксусной кислоты) и 20 мкм пантотеновой кислоты (100 мм складе H₂ O).
6. Подготовка 50 мл управления индукции СМИ для линии адипогенном: 40,8 мл высокий глюкозы DMEM, дополненная 7,5 мл PVAT роста СМИ и 500 мкл перо стрептококк (100 x акций).
7. Подготовка 50 мл адипогенном обслуживание СМИ: 41,5 мл высокий глюкозы DMEM дополнена 7,5 мл PVAT роста средств массовой информации из шага 1.3, 500 мкл перо стрептококк (100 x бульон), дексаметазона 1 мкм (1 мм складе EtOH), 33 мкм биотин (66 мм сток в ДМСО), 100 Нм инсулина (200 µM складе переменного тока 0,1% этический кислота) и 20 мкм пантотеновой кислоты (100 мм складе H₂O).
8. Подготовка 500 мл питательных сред для Остеогенные и хондрогенном линий: высокие глюкоза αMEM дополнена 10% FBS, 1 x глютамина дополнение (см. Таблицу материалы) и 5 мл перо стрептококк (100 x акций).
9. Подготовка 50 мл индукции СМИ для линии Остеогенные: 50 мл костного MSC питательных сред с 10 Нм дексаметазона и 10 мм β-метронидазол.
10. Подготовка 50 мл индукции СМИ для линии хондрогенном: 50 мл костного MSC питательных сред с 100 Нм дексаметазон, 50 мкг/мл натрия аскорбат-2-фосфат и 10 нг/мл TGFβ1. Остеогенные и хондрогенном условий базальный костного MSC роста СМИ будет служить средства массовой информации не индукции.

2. Протокол 1: Культура человека PVAT клетки стромы сосудистой дроби

Примечание: PVAT резецируется от сайта трансплантата анастомоза на восходящей части аорты наркотизированных пациентов, перенесших процедур трансплантата обхода коронарной артерии. Аорты PVAT размещается в 15 мл конические содержащий 10 мл лед холодной высокой глюкозы DMEM F12 и передается от операционной комнате в лабораторию в течение 2 ч резекции. Аорты PVAT отбрасываются ткани во время обхода процедуры и был признан как не человеческого субъектов исследования Мэн медицинский центр внутреннего обзора Советом.

1. Этот протокол предназначен для ~ 500 мг кусок человеческого PVAT (примерно 3 x 1 x 0.5 см³). Передать свежие человека PVAT от DMEM конические Тюбик 50 мл, содержащие Антибиотик раствор 25 мл. Инкубировать с качалки для 20 мин при 4 ° C. В то время как PVAT является антибиотиком решения, оттепель Алиготе диссоциации буфера при 37 ° C.
2. 50 мкл антибиотик/противогрибковое раствора 100 x 5 мл диссоциации буфер и стерилизовать, используя фильтр шприц 0,22 мкм. Добавьте 1 мл раствора желатина 1 о 24-ну пластины хорошо. В Ламинарный шкаф используйте стерильные щипцами и ножницы передать стерильных Петри PVAT от антибиотиков решения. Добавьте 1 mL подогретым диссоциации буфера на ткани и мелко фарш всей ткани в суспензии (куски размером более ~ 2 x 2 мм²) с помощью стерильных щипцы и Рассечение ножницами.
3. Передать буфер диссоциации 4 мл 1 мл суспензии и инкубировать трубку на его стороне в орбитальный шейкер подогретым 37 ° C при 200 об/мин на 1 ч. Через 1 ч без видимых ткани штук будет присутствовать, и решение будет отображаться как подвеска облачно ячейки.
4. Фильтр решение через 70 мкм клеток стрейнер набор на вершине 50 мл Конические трубки. Промойте ситечко с еще 10 мл антибиотик решение захватить как много клеток как можно скорее. Не выжимать ситечко.
5. Пелле клетки для 12 мин на 300 x g в центрифугу размахивая ведро.
   Примечание: После центрифугирования трубы будут разделены на жирные верхний слой адипоциты, межфазные и Пелле. Гранулы является стромальные сосудистой дроби, содержащие эндотелиальные клетки, клетки иммунной системы, клетки крови и клетки-предшественники.
6. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл HBSS и центрифуги для 5 мин на 300 x g. Повторите этот шаг для в общей сложности 2 стирок в HBSS. После окончательной стирки не лизируют красных кровяных клеток. Неоднократные попытки с несколькими коммерчески доступные буферы и инкубации раз привели к заметному сокращению прогениторных клеток привязанность и жизнеспособности.
7. Аспирационная желатин от 24-ну пластины. Осторожно промойте хорошо 1 x с HBSS удалить несвязанные желатина.
8. Ресуспензируйте стромальные сосудистой фракция гранул с нетронутыми красных кровяных клеток в 1 мл средства роста и семян на желатин покрытием хорошо. Добавьте человека FGF2 (высокомобильна в PBS с BSA 0,01% w/v) до конечной концентрации 25 нг/мл в культурной среде. Проинкубируйте 24 ч при 37 ° C с 5% CO₂.
9. На следующий день удалить роста средств массовой информации и мыть скважин 5 x с HBSS для удаления красных кровяных клеток и мертвые клетки. Добавьте в 1 мл свежих питательных сред с 25 нг/мл FGF2.
10. Изменить СМИ каждые 48 ч, убедившись в том дополнить с 25 нг/мл свежего FGF2 каждый раз.
11. Клетки обычно достигают 100% слияния 7-10 дней после экспланта; проход клетки затем:
    1. Аспирационная роста средств массовой информации и мыть монослоя 2 x в 1 мл HBSS. Аспирационная все HBSS из скважин и добавить несколько капель раствора диссоциации клеток.
    2. Коснитесь и вихрем пластину несколько раз и инкубировать при 37 ° C с 5% CO₂ для 5-7 мин снять клетки. Добавить ~ 1 мл свежей питательной среды на отдельные ячейки и распространять 500 мкл до 2 скважин 24-ну плиты, каждый содержащий 500 мкл концентрированного роста средств массовой информации и 25 нг FGF2.
12. Продолжать расширять человеческие клетки PVAT-производные, как указано на предыдущем шаге. Каждый проход должен быть не больше, чем 1:2 Сплит. Клетки пассированные 5 – 7 раз до выделения для дифференциации анализов.

3. Протокол 2: Культура костного мозга человека MSC колонии

Примечание: Костного мозга человека MSC изолированы как описано⁸ и хранятся как замороженные запасы начале проход заморозить СМИ (70% FBS 20% базального DMEM и 10% ДМСО) на ~ 100000 клеток/мл жидкого N₂.

1. Быстро разморозить флакон костного MSC от жидкости N₂ в ванну воды 37 ° C и пластины для одной скважиной 6-ну культуры пластины, содержащий 3 мл MSC питательных сред и инкубировать на ночь при 37 ° C и 5% CO₂.
2. На следующий день, аспирационная MSC культуры средств массовой информации и вымыть клетки 3 x в 2 мл HBSS. При впадении в 100%, аспирационная питательных сред и вымыть клетки 3 x в 2 мл HBSS. Добавьте 500 мкл/хорошо клеток отряд решение и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂ на 5 мин крана, выбили пластину для обеспечения всех клеток и равномерно распределять содержимое 2 скважин 6-ну пластины, содержащий 2 мл MSC роста средств массовой информации.
3. Разверните костного мозга человека и PVAT-производные MSC параллельно для приблизительно 5 – 7 места или до тех пор, пока был достигнут достаточных количествах для тестирования.

4. Протокол 3: Пластины и побудить адипогенном, остеогенные и хондрогенном линий

1. Соответствующие госномера костного мозга и PVAT-производные ячеек на 12-ну плиты и соответствующие реплицирует для каждого экспериментальные условия. Для адипогенном и остеогенном условий, ~ 200, 000 – 225 000 клеток/также необходимы, для хондрогенном условий, 150 000 – 175 000 клеток/также необходимы.
   Примечание: Мы побежали как минимум N = 3 реплицировать скважины для управления и индуцированных условия для каждой экспериментальной линии для в общей сложности 2 независимых работает (N = 6 реплицирует всего).
2. Отделить клеток от PVAT прогениторных клеток населения и населения MSC костного мозга человека, используя мобильный отряд решение и инкубации при 37 ° C и 5% CO₂ для 5 минут бассейн населения в отдельных 15 мл конические флаконов. Спиновые флакон вниз на 500 x g 7 мин для пеллет клетки. Ресуспензируйте в 1 мл PBS и использовать Горяева для оценки количества клеток.
3. Пластина клетки в 12-ну блюда, как указано в шаге 4.1. Обеспечить отдельные блюда индуцированных и -индуцированной адипогенном, остеогенные, и условия и состояние-индуцированной может устанавливаться на более ранней точке времени без ущерба для продолжения культуры индуцированных состояния.
4. Добавьте 1,5 мл адипогенном и остеогенном индукции СМИ в каждой скважине индуцированных состояния. Добавьте 1,5 мл адипогенном и остеогенном СМИ не индукции в каждой скважине-индуцированной состояния. Начните инкубации адипогенном и остеогенном индуцированных и -индуцированных клеточных популяций при 37 ° C и 5% CO₂.
5. Уменьшается объем оставшихся прогениторных клеток человека PVAT и костного мозга человека MSCs для 7 мин на 500 x g.
6. Определите объем необходимых для Ресуспензируйте оставшихся костного мозга и PVAT-производные ячейки гранулы для достижения плотности 100000 клеток/10 мкл (10⁶ клеток/мл). Ресуспензируйте окатышей в рассчитанном объеме MSC питательных сред для хондрогенном линии индукции. Аккуратно переместите объем клеток вверх и вниз с помощью пипетки, чтобы обеспечить равномерное распределение.
7. Пипетка капельку 10 мкл концентрированного ячейки решения в центр каждой скважины, сформировать micromass 100000 клеток. Место 1 мл стерильного H₂O в прилегающих хорошо для предотвращения испарения. Инкубировать micromass культур на 2 ч при 37 ° C и 5% CO₂ разрешить micromass для статистической обработки.
8. После 2 часов, осторожно добавить хондрогенном дифференциация СМИ шипами с 10 нг/мл человека TGFβ1 к каждому из индуцированных состояния скважин. Тщательно добавьте 1,5 мл не индукции СМИ (костного MSC роста СМИ)-индуцированной состояния скважин. Использование отдельных 12-ну плит для индуцированных и -индуцированной условий так что-индуцированной условие может устанавливаться на более ранний момент времени.

5. Протокол 4: Культура адипогенном, остеогенные и хондрогенном линий на 14 дней

1. Культура индуцированных и -индуцированной условий всех трех линий для 4 дней при 37 ° C и 5% CO₂, освежающий СМИ каждые 2 дня. День 4 Измените условие линии индуцированных адипогенном от индукции СМИ для обслуживания средств массовой информации на оставшуюся часть assay.
2. Вымойте все фиксированные скважин 2 x в PBS, чтобы удалить все следы формалина и исправить все условия-индуцированной формалина 10% за 12 ч Dispose формалина. Хранить пластины в PBS на 4 ° C до обработки.
3. Культура индуцированных условия для всего 14 дней, освежающий СМИ каждые 2 дня. Добавьте свежие TGFβ1 на 10 нг/мл конечной концентрации с каждым обновлением СМИ индукции хондрогенном. Продолжать культура адипогенном линии в адипогенном обслуживания массовой информации и остеогенном линии индукции, обновление каждые 2 дня. На 14 день исправьте все индуцированных условия для 12 h в формалина 10% для окрашивания.
4. Царапина, или налить micromass в состоянии индуцированных хондрогенном в кассету для встраивания. Обезвоживанию micromass в серии все более концентрированный алкоголя ванны для 5 мин, начиная с 70%, то 80%, дважды в 95% и вдвое больше в абсолютном спирте. Установите кассету в dealcoholization агент и наконец внедрить кассету в парафин для разрезания и пятнать.

6. Протокол 5: Пятнать адипогенном условие с маслом красный O

1. Подготовьте раствор нефти красный O, растворяя 350 мг в 100 мл 100% изопропиловый спирт Красного о нефти. Смешать 2 h с баром перемешать и вакуума через фильтр 0.2 мкм. Стоковый раствор может храниться в темноте при комнатной температуре на 1 год.
2. Подготовка нефти красный O рабочего раствора, смешивая 3 частей Стоковый раствор 2 части diH₂0 (например, 60 мл Стоковый раствор 40 мл diH₂0). Окончательный концентрация O Красного масла в рабочем растворе составляет 2,1 мг/мл.
3. Удалите все жидкости из скважины. Мыть каждый хорошо 2 x с 60% изопропиловый спирт, убедившись в том, чтобы полностью удалить всю воду из сторон скважин. Аспирационная 60% изопропиловый спирт и быстро добавить масло красный O рабочий раствор не касаясь стенок скважин для покрытия нижней. Важно, что этот шаг делается быстро, поэтому не сушите скважин.
4. После добавления масла O красный, Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре с плавное покачивание.
5. Удалите все O Красного масла и сразу же добавить дистиллированной H₂O. мыть с дистиллированной H₂O для 10 m начать удаление несвязанных нефти красный O. После 10 минут, аспирационная O Красного масла и повторите процедуру Стиральная 3 x.
6. После завершения стирки добавьте PBS и изображения клетки. Хранить окрашенных клеток в PBS на 4 ° C.

7. Протокол 6: Пятнать Остеогенные состояние с ализарин красный

1. Удалите все жидкости из каждой скважины. Добавьте соответствующий объем 2% раствора ализарин красный краситель для каждой скважины (1,5 мл на хорошо для 12-ну плиты) и нежно наклона пластины стороны в сторону, до тех пор, пока решение полностью покрывает в нижней части скважины.
2. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Удаление ализарин красный из скважин. Осторожно промойте дистиллированной H₂O, принимая осторожностью, чтобы не вытеснить кристаллов кальция каждый хорошо четыре раза. Дайте высохнуть.

8. Протокол 7: Окрашивание хондрогенном состояния с Массон в Trichrome

1. Выпекать слайды в сухой печи 60 ° C на 30 мин Deparaffinize и гидрат разделы в дистиллированной воде.
   1. Увлажняет, место слайды в трех инкубаций 5 мин с dealcoholization агентами, следуют инкубаций 5 мин в порядке убывания концентрации алкоголя следующим образом: два на 100% (абсолютного этанола), два в 95% спирте, две на 80%, два на 70% и, наконец, два в дистиллированной H₂O. слайды могут оставаться в H₂O фиксатор Буэна готовится.
2. Место 40 мл фиксатор Буэна в пластиковых микроволновой печи coplin банку (непокрытый). Микроволновая печь на высоких довести темп до 55 ° C. Место слайда в подогревом раствора для 20 мин; пусть стоять на прилавке охвачены. Промыть струей воды за 10 мин, или до тех пор, пока все желтого цвета исчезает.
3. Пятно разделы по Вейгерту гематоксилином 10 мин мыть в струей воды за 10 мин.
4. Пятно секций в Beibrich в Скарлет кислоты фуксин решение для 10 минут Вымойте 3 x 10 мин в водопроводной воде. Морилка слайды в кислотного раствора фосфорвольфрамовой/phosphomolybdic за 10 мин. Не ополаскивайте.
5. Место слайды непосредственно в анилиновый голубой решение для 10 минут промыть с двумя краткий провалы в водопроводной воде.
6. Место слайды в растворе уксусной кислоты 1% для 3-5 мин мыть в проточной воде в течение 1 мин место в 95% этаноле за 1 мин Dehydrate, как указано в шаге 5.4 и горе с синтетической смолой.

Результаты

Изоляция стромальные сосудистой дроби от человека PVAT

На рисунке 1A показана схема анатомического региона, где был получен PVAT, обволакивающие восходящей части аорты. Ранее мы описали популяциях пациентов, прохо...

Обсуждение

Жировой прогениторных клеток с разных складов различаются в фенотип и дифференциации потенциальных⁹. Выращивание PVAT-производные прародителей от одного пациента донора в одновременной индукционной вниз три различных линий, адипогенном, остеогенные и хондрогенном, позвол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
Antibiotic/antimycotic	ThermoFisher	15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glycerophosphate	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotin	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Bouin's fixative	NewComerSupply	1020A
Bovine serum albumin	Calbiochem	12659	stored at 4 °C
Cell detachment solution	Accutase	AT104
Bell strainer (70 mm)	Corning	352350
Dexamethasone	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	10565-042	high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalin	NewComerSupply	1090
Gelatin, bovine skin	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	glutamine supplement
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Insulin solution	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Oil red O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Pantothenic acid	Millipore-Sigma	P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Weigert's hematoxylin	EKI	4880-100G