Онкогенный гепатоцит индуцированной ортотопической мыши Модель гепатоцеллюлярного рака, возникающих в настройке воспаления печеночного и фиброза

Резюме

Здесь мы описываем разработку клинически релевантной модели рака печени, подражая типичные иммунные особенности гепатоцеллюлячного рака (HCC).

Аннотация

Отсутствие клинически релевантной модели животных, касающейся типичных иммунных характеристик гепатоцеллюлярного рака (HCC), значительно затрудняет разъяснение основных механизмов и разработку инновационных иммунотерапевтических стратегий. Для разработки идеальной модели животных recapitulating человека HCC, иммунокомпетентных мужчин C57BL/6J мышей сначала получить углеродный тетрахлорид (CCl₄) инъекции, чтобы вызвать фиброз печени, а затем получить гистологически нормальные онкогенные гепатоциты от молодого мужчины SV40 T антиген (TAg)-трансгенных мышей (MTD2) путем внутриселекционной (ISPL) прививки. Андроген, генерируемый у мышей-реципиентов в период полового созревания, инициирует экспрессию TAg под контролем фиченного промоутера. В результате передаваемые гепатоциты становятся раковыми клетками и образуют опухолевые массы в условиях фиброза/цирроза печени. Эта новая модель имитирует инициацию и прогрессирование HCC человека в контексте фиброза печени / цирроза и отражает наиболее типичные особенности человеческого HCC, включая иммунную дисфункцию.

Введение

Гепатоцеллюлярный рак (HCC) является наиболее быстро растущим типом рака в Соединенных Штатах (США)^1,2,3. Каждый год, около 850000 новых случаев диагностируется^4,5 и 700000 пациентов умирают от этого смертельного заболевания^6,7,8,9,10 , что делает его второй по значимости причиной смерти, связанной с раком во всем мире. Управление HCC включает в себя хирургическую резекцию, трансплантацию, абляцию, химиоэмболизацию или системную терапию, такую как sorafenib^11. Ранняя диагностика и управление хирургической резекцией или трансплантацией имеют самое высокое общее преимущество выживания^4. К сожалению, большинство пациентов, присутствующих на более поздней стадии и требуют управления с абляцией, химиоэмболизацией или сорафениб¹². Sorafenib, ингибитор тирозина киназы рецептора (RTKI), был одобрен Пищевых продуктов и медикаментов в 2008 году в качестве единственной системной медикаментозной терапии для лечения нерезектационных HCC. Хотя препарат обеспечивает лишь незначительное увеличение общей выживаемости, с 7,9 до 10,7 месяцев¹³, он предоставил новую терапевтическую стратегию, которая может быть использована для управления HCC.

Манипулирование иммунной системой для устранения установленных раковых заболеваний является быстро растущей области в исследовании рака¹⁴. Иммунные контрольные исследования имеют значительно продвинутые иммунотерапевтические разработки лекарств в лечении рака^15,16. FDA одобрило использование антител (Abs) против цитотоксического T-лимфоцита антиген айген 4 (CTLA-4), запрограммированный белок смерти клеток 1 (PD-1), и его лиганд PD-L1 для лечения меланомы, рака легких, головы и рака шеи, и рака мочевого пузыря^{17, 18 лет , 19 лет , 20}. Клинические испытания монотерапии или комбинированной терапии с использованием одного или нескольких антител против PD-1, PD-L1, или CTLA-4 для лечения передовых HCC продолжаются^21,22,23, и некоторые испытания показали положительные результаты. В 2017 году FDA предоставило ускоренное одобрение антител против PD-1 для лечения пациентов HCC, которые сопротивляются сорафенибу, но общий процент ответов на эту терапию составляет всего 14,3%. Другие стратегии не были переведены в клиническую практику в это время^24,25. Преодоление опухоли индуцированной глубокой иммунной толерантности для улучшения иммунной терапии контрольно-пропускной пункт²⁶; прогнозирование эффективности иммунной контрольно-пропускной терапии; предотвращение побочных явлений, связанных с иммунитетом; оптимизация маршрута администрирования, дозировки и частоты; и найти эффективные комбинации терапии^27,28^,29все остаются чрезвычайно сложными задачами.

Есть несколько обычных подходов, используемых для индуцирования HCC в мышиных моделях в настоящее время и используются в зависимости от конкретного исследовательского вопроса следователя³⁰. Химически индуцированных моделей мыши HCC с генотоксическими соединениями имитируют злокачественность, вызванную травмами. Модели xenograft через эктопическую или ортотопическую имплантацию клеточных линий HCC подходят для скрининга наркотиков. Ряд генетически модифицированных мышей были разработаны для исследования патофизиологии HCC. Трансгенные мыши, выражающие вирусные гены, онкогены и/или факторы роста, позволяют выявлять пути, участвующие в гепатокарциногенезе. Из-за присущих им ограничений, эти модели не резюмируют типичные иммунные характеристики, наблюдаемые в HCC человека, что значительно препятствует разъяснению основных механизмов и разработке инновационных иммунотерапевтических стратегий^{14 ,15}. Недавно мы создали клинически актуальную модель мурина. Эта новая модель не только имитирует инициации и прогрессирование HCC человека, но и отражает наиболее типичные особенности болезни человека, включая иммунную дисфункцию. Мы охарактеризовали его биологические и иммунологические характеристики. Используя эту новую модель, мы изучили различные иммунотерапевтические стратегии для лечения HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. Эта уникальная платформа позволяет нам изучать механизмы иммунопереносимости, вызванной опухолью, и разрабатывать доказательства концепции терапевтических стратегий для HCC в направлении возможного клинического перевода.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, включая животных субъектов были одобрены IACUC в Университете Миссури. Все мыши получали гуманную помощь в соответствии с критериями, изложенными в "Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных". Следующая процедура клеточной изоляции и прививки должна быть выполнена в капюшоне. Все исполнители должны носить стандартное индивидуальное защитное оборудование для обработки мышей и тканей.

1. Индукция фиброза печени и цирроза с инъекцией IP-изгоя углеродного тетрахлорида (CCl₄)

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1. (CCl₄ является очень опасным реагентом, с ним следует обращаться осторожно и носить химически устойчивые перчатки)

1. Получить мужчин C57BL/6J мышей, которые от шести до восьми недель (см. Таблица материалов).
2. Приготовьте 10% раствор CCl₄ (v/v) в кукурузном масле в центрифуге. Определить общий объем на основе количества мышей, которые будут введены (см. шаг 1.6).
3. Используйте соответствующий метод обработки мышей, чтобы выбрать одну мышь для инъекций.
4. Вручную удерживать мышь с ее псом (абдомина) стороной вверх.
5. Очистите место инъекции на брюшной стенке мыши путем очистки с 70% алкоголя.
6. Впрысните мужских мышей C57BL/6J с 160 л раствора CCl₄ путем интраперитонеальной (IP) инъекции с использованием 25-калиберной одноразовой иглы.
7. Убедитесь, что игла проникает только через брюшную стенку (примерно 4-5 мм) с скотобойней вверх и слегка наклонной при 15-20 градусах.
8. Вводить мышей два раза в неделю в общей сложности четыре недели каждая мышь будет получать в общей сложности восемь инъекций.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Через две недели после последней инъекции, обработанные мыши готовы к прививке ISPL онкогенных гепатоцитов от мышей MTD2.

2. Изолирование тегов-трансгенных гепатоцитов от мышей Line MTD2

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для рецептов решений.

10x Эрл сбалансированное решение соли без Ca или Mg (EBSS без Ca или Mg)	4 г KCl 68 г NaCl 1,4 г NaH2PO4 H2o 10 г декстроза Добавить воду до 1 литра, рН до 4,32 Пройдите через фильтр
Решение 1	20 мл 10x EBSS без Ca или Mg 44 г NaHCO3 1,33 мл 1,5 м гепс 10 мл 10 мл EGTA Добавить воду до 200 мл
Решение 2	100 мл 10x EBSS 2,2 г NaHCO3 6,67 мл 1,5 м хепс Добавить воду до 1 литра
0,75% коллагенеза раствор	15 мг коллагеназа типа 1 20 мл раствора 2
Полная средняя	2 РПМИ 50 мл FBS 5 мл 100x пенициллин-стрептомицин

Таблица 1: Рецепты решений.

1. Получить линии MTD2 мышей³⁸ в качестве источника онкогенных гепатоцитов.
2. Анестезия 5-недельных MTD2 мышей с помощью 2,5% изолюран.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная анестезия будет проверена методом щепотки. Вкратце, используя 2 перста, дайте носу/ноге мыши хорошее сжатие. Если нет реакции на вывод, животное оценивается достаточно глубоко, чтобы начать операцию.
3. При адекватном успокоительном положении, место мышей в положении на спине и исправить конечности с лентой, чтобы обеспечить адекватное воздействие брюшной поверхности.
4. Выполните разрез лапаротомии средней линии с помощью ножниц по длине linea alba достаточно большой, чтобы обеспечить адекватное воздействие печени.
5. Смещение кишечника влево, чтобы обеспечить лучшее воздействие печени и портал триады.
6. Рассекать над печенью, чтобы разоблачить нижнюю поливу вену (IVC).
7. Ligate IVC над печенью с помощью зажима артерии.
8. Возвращаясь к нижней границе печени, используйте иглу бабочки (см. материалы), чтобы получить IV доступ к вене портала. Исправьте катетер вручную.
9. Последовательно пронизываете печень мыши с помощью инъекционного шприца на уровне 8,9 мл/мин с 15 мл раствора 1, 15 мл коллагеназе раствор 2 и 15 мл раствора 2 через катетер.
10. Урожай пронизывает печень путем резки и принятия опухолевой массы от MTD2 мышей в 50 мл конической трубки с 10-15 мл PBS.
11. Удалить PBS и мыть дополнительное время с PBS; не центрифуги на этом этапе.
12. Разрежьте печень на более мелкие кусочки с помощью ножниц, а затем снова мыть с PBS 2x, чтобы удалить оставшуюся кровь.
13. Добавьте 5 мл полной среды RPMI к конической трубке и непрерывно фарш печени ножницами на мелкие кусочки (Злт;3 мм) ткань должна плавно пройти через 5 мл пипетки.
14. Добавьте полный RPMI к окончательному объему 30 мл и приостановите печень с помощью пипетки 5 мл.
15. Фильтр смешанный раствор с 70 мкм ситечко в 50 мл конической трубки.
16. Вымойте ситечко несколько раз с полным RPMI и настроить окончательный объем до 50 мл, добавив дополнительные rpMI среды.
17. Быстро закрутите подвеску центрифугой до максимум 500 об/мин; как только скорость ускоряется до 50 х г,центрифуга должна быть остановлена.
18. Декант супернатант и приостановить гранулы в 20 мл PBS.
19. Подсчитайте клетки, используя трипан синий исключение и гемоцитометр, а затем настроить концентрацию клеток до 2,5 х 10⁶/мл для следующей прививки клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый выход из 5 граммов опухолевой ткани составляет 80 миллионов гепатоцитов с жизнеспособностью

3. Прививание гепатоцитов из мышей MTD2 в печень диких мышей типа C57BL/6J путем инъекций ISPL

1. Асептический метод следует использовать во всех процедурах
2. Анестезия CCl_{4-обработанных}мужчин C57BL/6J мышей с 2,5% изофруран, мышей следует лечить с помощью смазки глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз.
3. Приготовьте шприцы с 200 йл гепатоцитов для инъекций.
4. При адекватном успокоительном положении мышей с левой стороны вверх.
5. Бритье весь левый фланг мышей, а затем скраб области, чередуя между 70% алкоголя и бетадин в три раза.
6. Администрирование 5 мг/кг карпрофена субкутано до хирургического разреза.
7. Сделайте разрез 1 см на левом фланге параллельно^13-му ребро от верхнего экстремального начала чуть ниже мышцы позвоночника.
8. Определите селезенку, а затем испределите ее с помощью тупых щипцы.
9. Закрепите селезенку двумя титановыми зажимами среднего размера. Поместите оба клипа между селезенки артерии и вены, оставьте место между клипами, чтобы сократить позже после прививки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы изолировать нижний полюс селезенки, чтобы уменьшить риск посева.
10. Введите 200 кЛ (0,5 миллиона) подготовленных гепатоцитов в нижний полюс селезенки с помощью иглы 27 G.
11. Закрепите нижнюю ветвь педиклы (нижние сосуды с селезенки) одним зажимом среднего размера.
12. Вырежьте селезенку между двумя первоначально размещенными клипами.
13. Удалить нижний полюс селезенки, которая была непосредственно введена с опухолевыми клетками.
14. Используйте 3-0 полиглактина 910 прерванных зашивания, чтобы закрыть внутренний мышечный слой.
15. Используйте стерилизованные стальные зажимы для закрытия наружного слоя кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стальные зажимы предпочтительнее над швами, чтобы избежать животных жевать швы, оставляя зияющую рану.
16. Администрирование 5 мг/кг карпрофена подкожно после шва.
17. Поместите всех выздоравливающих животных на температурно-контролируемой грелке и внимательно следите до полного восстановления после наркоза.
18. Дайте мышам свободный доступ к воде после операции. Если мышь обезвоживается во время операции, вводят подкожные жидкости (1 мл).
19. Удалите зажимы для кожи на 7-10 дней после операции.

Результаты

Онкогенные гепатоциты, изолированные от TAg-трансгенных мышей(рисунок 2) были посеяны в печени диких мышей типа внутриселективной инъекцией(рисунок 3). Пересаженные гепатоциты успешно и надежно росли ортотопические опухоли HCC(Рисунок 4) с опухолевым специфичес...

Обсуждение

С помощью этого протокола мы создали надежную и воспроизводимую модель моверина HCC, которая имитирует инициацию и прогрессирование hCC человека. Клинически, многие факторы риска последовательно вызывают травмы печени, фиброз печени, цирроз печени и заключительной стадии HCC. В нашем прот...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close