JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Библиотеку ТРИФОСФАТЫ/sgRNA был применен для допроса белка кодирование генов. Однако возможности библиотеки sgRNA раскрыть функцию CTCF границы в регуляции генов остается неизведанной. Здесь мы описываем библиотеки конкретных sgRNA Гомеозисных локусов для выяснения функцию CTCF границ в Гомеозисных локусов.

Аннотация

Фактор CCCTC-привязки (CTCF)-опосредованной, стабильной, топологически связывания доменов (ТЗЖ) играют важную роль в ограничение взаимодействия элементов ДНК, которые находятся в соседних TADs. CTCF играет важную роль в регулировании пространственных и временных выражение Гомеозисных генов, которые контролируют эмбрионального развития, патронирования тела, кроветворения и leukemogenesis. Однако остается неизвестным, ли и как HOX локусов связанные CTCF границы регулирования организации хроматина и экспрессии Гомеозисных генов. В текущем протоколе конкретные sgRNA пула библиотека ориентации всех сайтов связывания CTCF в HOXA/B/C/D локусов был создан для изучения последствий нарушения границ связанного CTCF хроматина на TAD формирования и Гомеозисные гены выражение. Через ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генетический скрининг, сайт связывания CTCF, расположенный между HOXA7/HOXA9 генов (CBS7/9) были определены как критические регулятор онкогенных хроматина домена, а также имеет важное значение для поддержания внематочная Гомеозисные гены шаблоны выражений в переставить MLL острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Таким образом, эта библиотека sgRNA, скрининг подход обеспечивает новые идеи в CTCF при посредничестве Организации генома в определенных генных локусов и также обеспечивает основу для функциональных характеристик аннотированный генетических нормативных элементов, как кодирование и ««некодирующей, во время обычных биологических процессов в эпоху пост человеческого генома проекта.

Введение

Недавние исследования взаимодействия генома показали, что форм ядерного генома человека стабильные топологически связывая доменов (ТЗЖ), которые сохраняются в различных видов и типов клеток. Организация генома в отдельные домены облегчает и ограничивает взаимодействие между регуляторных элементов (например, усилители и промоутеров). Коэффициент CCCTC-привязки (CTCF) связывается с TAD границ и играет решающую роль в ограничение взаимодействия элементов ДНК, которые находятся в соседних TADs1. Однако, генома широкий CTCF привязки данных показал, что, хотя CTCF главным образом взаимодействует с же ДНК сайтов в различных типов клеток, он часто функционирует как хроматина барьер на определенном сайте в одну ячейку типа, но не в другом, предлагая что CTCF функции Вместе с другими мероприятиями в формировании хроматина границы2. Что остается неизвестным является ли граничных элементов (CTCF-привязки сайтов) напрямую связаны с биологической функции CTCF, и как эти ссылки встречаются. Таким образом мы предполагаем, что конкретных сайтов связывания CTCF в геноме непосредственно регулировать образование TADs и промоутер/усилитель взаимодействия в рамках этих доменов или между соседними доменами. Завершение проектов секвенирования генома мыши и последующий анализ эпигеномные человека и обнаружили новых молекулярных и генетических подписей генома. Однако роль конкретных подписей/изменения в регулирование гена и клеточную функцию, а также их молекулярные механизмы, еще не в полной мере понять.

Несколько строк доказательства поддержки, что CTCF-опосредованной TADs представляют функциональные хроматина домены3,4,5. Хотя CTCF главным образом взаимодействует с же ДНК сайтов в различных типов клеток, генома широкий CTCF чип seq данные показали, что CTCF часто действует как барьер хроматина в одной ячейке тип, но не в других2. CTCF играет важную роль в процессе разработки путем посредничества генома организации4,6,7. Нарушение границ CTCF нарушениями усилитель/промоутер взаимодействий и экспрессии генов, приводит к закупорке развития. Это свидетельствует о том, что CTCF при посредничестве TADs являются не только структурные компоненты, но и регулирования подразделений, необходимых для надлежащего enhancer действий и Джин транскрипции5,8,9.

Гомеозисные гены играют решающую роль в ходе эмбрионального развития и они височно и пространственно ограничены в их шаблоны выражений. Локус HOXA образует два стабильных TADs разделения генов передней и задней границы CTCF-связанный элемент в ЭСК и IMR90 клетки1. Последние доклады свидетельствуют, что HoxBlinc, HoxB lncRNA Локус связанные, опосредует формирования CTCF направлены TADs и усилитель/промоутер взаимодействий в локусе HOXB . Это приводит к передней HOXB генов активации во время ESC приверженность и дифференциации10. Кроме того в определенных генов локусов, включая HOXA локус, переоборудование CTCF опосредованной TAD доменов изменил линии конкретный ген выражение профили и был связан с развитием болезни государства11,12. Доказательства поддерживает основную функцию CTCF в координации транскрипции гена и определения личности клетки путем организации генома в функциональных областях.

Несмотря на свою роль в развитии эмбриона, кроветворения HOX гены регулируют функции кроветворных стволовых и прогениторных клеток (HS/PC). Это делается путем контроля баланса между пролиферации и дифференцировки10,13,14,15. Экспрессии Гомеозисных генов жестко регулируется в спецификации и дифференциации кроветворных клеток, с высшим выражением в HS / экспрессии шт. Гомеозисных генов постепенно уменьшается во время созревания, с ее низким уровнем происходящие в дифференцированной гемопоэтические клетки16. Регуляции генов HOX является доминирующей механизмом лейкозных трансформации свойствами самообновления и дифференциации dysregulating HS/ПК, ведущих к лейкозных преобразования17,18. Однако механизм установления и поддержания нормальной против онкогенных выражение модели Гомеозисных генов, а также связанные с ними нормативных сети остается неясным.

ТРИФОСФАТЫ-Cas9 sgRNA библиотека скрининг широко использовался допросить белка кодирование генов19 как гены, также как не кодирования, например lncRNA20 и Мирна21 в разных видов. Однако стоимость использования библиотеки ТРИФОСФАТЫ-Cas9 sgRNA для выявления новых геномных целей остается высокой, потому что высок объём генома часто применяется для проверки проверки библиотеки sgRNA. Наши sgRNA скрининг системы сосредоточена на конкретных генома локусов и оценивает таргетинга sgRNAs через Одношаговая RT-PCR согласно маркер экспрессии генов, например HOXA9. Кроме того Сэнгер, секвенирование подтвердил, что sgRNA была интегрирована в геноме и Indel мутации могут быть обнаружены для определения ориентации сайта sgRNA. Посредством конкретных локусов ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генетический скрининг, границы хроматина CBS7/9 была определена в качестве критического регулятор для создания домена онкогенных хроматина и поддержания внематочная HOX картин выражения гена в патогенезе бод 12. метод может широко применяется для определения не только конкретные функции CTCF границы в эмбриональное развитие, кроветворения, leukemogenesis, но и CTCF границы как потенциальных терапевтических целей для будущих эпигеномные терапии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. CTCF sgRNALibrary дизайн с использованием онлайн инструмент

  1. Дизайн sgRNA ориентации сайтов связывания CTCF в человека HOX локусов в конструкторе генетических возмущений платформы (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Синтезировать в общей сложности 1070 sgRNAs, состоящий из sgRNAs ориентации 303 случайные ориентации генов, 60 позитивные элементы, 500 человека ненацеливания контроля и 207 CTCF элементы или lncRNA ориентации генов (рис. 1, Таблица 1). Каждый элемент нацеленности ДНК является мишенью для 5-10 различных sgRNAs.

2. sgRNA библиотека клонирование

  1. Клон синтезированные олигонуклеотиды в вектор лентивирусные позвоночника ТРИФОСФАТЫ (lentiCRISPRv2).
    1. Дайджест LentiCRISPRv2 вектор с BsmBI энзима ограничения при 37 ° C на 2 ч.
    2. Посмотрите на наличие более крупные группы (около 12873 bp) на гель после BsmBI пищеварение и затем очистить его с комплектом извлечения геля.
      Примечание: 2 часть малых наполнитель КБ присутствует также на геле, после переваривания, но это должны быть проигнорированы.
    3. Перевязать синтезированные олигонуклеотиды и переваривается LentiCRISPR вектор с 150 нг переваривается LentiCRISPR ДНК, 1 мкл 10 мкм oligos, 2 мкл 10 x T4 лигаза буфера, 1 мкл лигаза T4 и затем инкубировать их в 16 ° C на ночь.
  2. Трансформировать лентивирусные ТРИФОСФАТЫ/sgRNA библиотеки в электро компетентных клеток для амплификации.
    1. Подготовка electroporator в 1,8 кв, 200 Ω и 25 МКФ. Затем предварительно теплой восстановления SOC СМИ в ванну воды 37 ° C и предварительно теплой LB ампициллин антибиотик пластин при 37 ° C.
    2. Оттепель сведущие клетки на льду за 10 мин.
    3. Подготовьте микро-пробирок 1.5 мл и 1 мм электропорации кюветы на льду.
    4. Смешайте 1 мкл 10 нг/мкл библиотека плазмидной ДНК в 25 мкл компетентных клеток в микро пластиковых пробирок 1.5 мл и осторожно перемешать, стряхивая в нижней части трубки несколько раз вручную.
    5. После кювет достаточно холодно, передача ДНК/компетентных клеток смеси на него. Нажмите дважды на столешницу и уничтожить любые капли воды от наружной поверхности кювета с папиросной бумаги. Затем поместите кювету в модуле электропорации и нажмите пульс.
    6. Сразу же 975 мкл 37 ° C подогретым SOC СМИ. Mix закупорить вверх и вниз и передачи 15 мл.
    7. Поворот и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
    8. Разбавляют 100 мкл клеток в 900 мкл SOC СМИ и место 100 мкл на пластины агар антибиотик ампициллин фунтов. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  3. Экстракт плазмидной ДНК из комбинированных колоний, с помощью столбца макси prep как подробно указано в протоколе производителя.
    1. Очистите все колонии от плиты агара LB и прививать закваски по 2 мл среды антибиотик ампициллин LB и инкубировать на ночь при 37 ° C с энергичной встряхивания (~ 200 x g).
    2. Разбавить 1: 500 Культура стартера в 100 мл LB ампициллин среды и инкубировать при 37 ° C для 12-16 h с энергичной встряхивания (~ 200 x g).
    3. Урожай Пелле бактериальной клетки центрифугированием при 6000 x g 15 мин при 4 ° C.
    4. Вновь приостановите бактериальных Пелле в 10 мл подвеска буфера.
    5. Лизировать приостановлено лепешка с 10 мл буфера lysis и энергично инвертировать 4 - 6 раз. Инкубируйте lysate 5 мин при комнатной температуре.
    6. Нейтрализовать lysate с 10 мл охлажденного нейтрализации буфера. Смешайте нежно инвертирование трубы 4 - 6 раз и проинкубируйте втечение 20 мин на льду.
    7. Спин вниз на 13500 x г за 30 мин при 4 ° C. Незамедлительно перенесите супернатанта, содержащий плазмида ДНК к новой пробке.
    8. Повторите шаг 2.3.7 и незамедлительно передавать супернатанта, содержащий плазмида ДНК к новой пробке.
    9. Сбалансировать столбце путем применения 10 мл буфера уравновешивания и разрешить столбец пустой, самотечный поток.
    10. Добавить супернатант в столбце и позволить ему войти смолы самотечный поток.
    11. Промойте колонку с 2 x 30 мл отмывающего буфера.
    12. Элюировать ДНК с 15 мл буфера.
    13. Осадок ДНК с 10,5 мл-комнатной изопропанола eluted ДНК. Mix и спин вниз сразу на 15000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C и осторожно декантируют супернатант.
    14. Помыть лепешка ДНК с 5 мл 70% этанола, центрифуги ДНК гранул на 15000 x g 10 мин и отбросить ясно супернатант.
    15. Повторите шаг 2.5.14 вдвое больше.
    16. Центрифуга Пелле ДНК на 15000 x g за 10 мин и осторожно декантируют супернатант не нарушая Пелле ДНК.
    17. Просушите Пелле за 5-10 мин и распустить ДНК в необходимый объем буфера (TE буфера, pH 8.0).

3 высокий титр sgRNA библиотека человека поколения

  1. Сотовый подготовка: HEK293T культуры клеток в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% (vol/vol) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% (vol/vol) пенициллин стрептомицином (Л.С.) антибиотик в колбах, T-25. Поместите их в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
  2. Пакет Лентивирусы: совместное transfect HEK293T клетки с 20 мкг очищенный библиотека векторов из шага 2, 15 мкг пакет плазмида (psPAX2) и 10 мкг конверт плазмида (pMD2.G) за 48 ч до уборки вирусов.
  3. Вирусной коллекции: после 48 ч, collectthe вирус супернатанта и фильтровать вирус супернатанта через 0.45 мкм низкопротеиновое привязки PVDF мембрану.
  4. Концентрация вируса: концентрат лентивирусные супернатант производится используя концентратор и тестовый вирус МВД на шаге 5.
  5. Вирус хранения: Алиготе концентрированного вирусов и хранить в холодильнике-80 ° С.

4. оптимизированный Puromycin концентрация

  1. Культура клеток лейкемии: Культура MOLM13 бод клетки в RPMI 1640 с 10% (vol/vol) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 x антибиотики пенициллин стрептомицином (PS) в T-125 колбу. Поместите их в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
    Примечание: Клетки обычно передаются каждые 4-5 d на Сплит соотношение 1:4 или 1:6, никогда не позволяя клеток для достижения более 70% confluency.
  2. Настройка ячейки MOLM13 в 12-ну тарелку с плотностью 1,0 x 104 клеток/мл, в общем объеме 2 мл в колодец (2,0 х 104 клетки).
  3. Время курс пробирного: лечить MOLM13 клетки с puromycin для 7 дней в повышении концентрации (0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл и 2,0 мкг/мл)
    1. Настройка MOLM13 клетки без лечения puromycin в день 0 и 3 реплицировать скважины без лечения puromycin как элемент управления от дня 0 для 7 день.
    2. Лечить MOLM13 клетки с 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл и 2,0 мкг/мл, отдельно, с каждого экспериментальные условия, содержащие 3 реплицировать скважин.
    3. Подсчитать соотношение живой клетки и сделать выживание кривой от дня 0 день 7, содержащий все условия.
  4. Кривая выживания: пятно клетки с Трипановый синий и количество жизнеспособности ежедневно для получения кривых выживания для каждого puromycin концентрации.
  5. Оптимизация puromycin минимальная концентрация: определить минимальный puromycin концентрацию через Трипановый синий окрашивания, в котором все MOLM13 клетки погибают между 5-7 дней.

5. титрование лентивирусные библиотеки в MOLM13 лейкозных клеток

  1. AML клетки подготовка: собрать клетки MOLM13 бод с трансдукции среднего (RPMI 1640, 10% FBS, Л.С. 1% и 8.0 среднего покрытие мкг/мл) при плотности 1,5 х 106 клеток/мл.
  2. Место MOLM13 клетки в 12-ну пластины с 1,5 х 106 клеток в каждой скважине.
  3. Оттепель человека: удалить сосредоточены человека из морозильной камеры-80 ° C и оттаивания на льду.
  4. Смесь MOLM13 клетки с различными дозы человека сконцентрированы в отдельных скважинах, включая 0, 1, 2.5, 5, 7,5 и 10 мкл (всего 6 групп).
  5. Немедленно центрифуга эти смеси на 1000 x g 2 h на 33 ° C и передать инкубатора при 37 ° C и 5% CO2 для 4 h 12-ну пластины.
  6. После 4 ч спина вниз инфицированных клеток на 400 x g 5 мин при комнатной температуре.
  7. Аккуратно аспирационная супернатант не нарушая ячейки Пелле и вновь приостановить transduced клетки с свежими СМИ (RPMI 1640, PS FBS и 1% 10%) и затем перенести их в T-25 колб и инкубировать при 37 ° C в течение 48 часов без puromycin.
  8. После 48 ч, разделить эти клетки на 2 фляги (2 группы): экспериментальная группа лечение с 1 мкг/мл puromycin на 5 дней и контрольной группы без лечения puromycin на 5 дней.
  9. Осуществлять выбор puromycin на 5 дней с 1 мкг/мл puromycin согласно шаг 4 до тех пор, пока все ячейки не преобразованы управления мертвы. Обмен на свежие СМИ каждые 2 дня.
  10. Измерьте значение оптимизированной MOI для трансдукции путем деления количества живых клеток, лечение с puromycin с количество клеток без puromycin лечения.

6. трансдукции библиотеки KO пуле ТРИФОСФАТЫ Cas9

  1. Трансдукция с человека: заразить 1,5 x 10-6 MOLM13 клеток с 0,3 MOI sgRNA объединили человека в среде (RPMI 1640, 10% FBS, Л.С. 1% и 8 мкг/мл покрытия средних) в 6-ну пластины и использовать клетки без инфекции человека как элемент управления.
  2. Немедленно центрифуга 6-ну пластины на 1000 x g 2 h на 33 ° C до spinfect клетки и передать пластины обратно в инкубатор при 37 ° C и 5% CO2 на 4 ч.
  3. Спин вниз инфицированных клеток на 400 x g 5 мин при комнатной температуре.
  4. Аккуратно аспирационная супернатант не нарушая ячейки Пелле и вновь приостановить transduced клетки с свежими СМИ (RPMI 1640, 10% FBS и 1% PS) и затем перенести их в T-25 колб и инкубировать при 37 ° C в течение 48 часов без puromycin.
  5. После 48 ч лечить клетки с 1 мкг/мл puromycin на 5 дней. Обмен на свежие СМИ после 2 дней и держать на плотность оптимального клеток.
  6. Семян одного клона в 96-луночных пластины с предельной методы разрежения и инкубировать эти один клонов при 37 ° C и 5% CO2. Их культура для 3-4 недели.
  7. После того, как одна ячейка растет вверх в население, передача половина клеток в 24-ну пластины для дальнейшего культуры под puromycin выбор и проверить эти клоны в следующем шаге. Храните остальные клетки.

7. Скрининг пуле ТРИФОСФАТЫ Cas9 KO библиотеки с одношаговый RT-ПЦР

  1. Определите эффективность комплексных клон sgRNA, скрининг путем вычисления выражения гена маркер HOXA9 с один шаг транскриптазы полимеразной цепной реакции (Одношаговая RT-ПЦР).
    Примечание: HOXA9 высоко выражаются в клетках MOLM13 бод в leukemogenesis22,23.
  2. Фото sgRNA комплексного MOLM13 клеток и передачи 1 x 104 клетки на хорошо 96-луночных ПЦР-планшете.
  3. Центрифуга трубки на 1000 x g 5 минут и затем тщательно снимите и выбросьте супернатант с пипетки не нарушая Пелле ячейки.
  4. Вымыть клетки с 125 мкл буфера PBS и центрифуги трубки на 1000 x g за 5 мин. Затем удалите 120 мкл супернатанта, с помощью пипетки и удерживать приблизительно 5 мкл PBS в каждой скважине.
  5. 50 мкл смеси мастер лизис клеток содержащих 48 мкл буфера lysis клетки, 1 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы K и 1 мкл раствора DNase (1 мг/мл) для каждой скважины. А затем накапайте вверх и вниз 5 раз вновь приостановить Пелле ячейки.
  6. Инкубировать смесь для 10 мин при комнатной температуре, затем 5 минут при 37 ° C, а затем 75 ° C за 5 мин.
  7. Храните lysate клетки в морозильник-80 ° С.
  8. Подготовка одношаговый RT-ПЦР-реакции: оттепель одношаговый реакция смеси и другие реакции компонентов до 4 ° C. То спина вниз кратко собирать решения в нижней части трубы, и место на льду без света. Смешать и спина аккуратно.
  9. 1 мкл lysate клетки для ПЦР скважин с RT-ПЦР реакция смеси, в том числе 1 мкл вперед праймер Джин маркер (300 Нм) и обратить вспять грунтовка (300 Нм), 0,125 мкл обратной транскриптазы (10 U/мкл) и 5 мкл одношаговый реакция смеси (2 x).
  10. Печать скважин с оптически прозрачная пленка и аккуратно водоворот и смешивать компоненты реакции.
  11. Место пластину 96-луночных ПЦР в реальном масштабе времени PCR инструмента.
  12. Запустите реакция обратной транскрипции для 10 мин при 50 ° C, а затем инактивирование полимеразы и ДНК денатурации за 1 мин на 95 ° C.
  13. Выполнять ПЦР-с 40 циклов реакции PCR: денатурация 15 s на 95 ° C, отжиг/расширение и пластины флуоресценции, чтение для 20 s 60 ° C, а затем анализа кривой расплава на 65-95 ° C через 0,5 ° C с шагом в 2-5 s/шаг.
  14. Настройка upregulated, downregulated и без изменения групп согласно уровни выражения гена HOXA9 в сравнении к элементу управления, отдельно. Используйте гена β-актина как элемент управления гена уборки.

8. Проверка комплексной sgRNAs положительные клоны через генотипирования и Сэнгер последовательности

  1. Проверьте HOXA9 снизилась выражение клоны через Сэнгер секвенирования и выполнять ПЦР с 50-100 нг MOLM13 генома ДНК, 5 мкл полимеразной реакции буфера (10 x), 1 мкл вперед грунт (10 мкм) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) и 1 мкл обратный Грунтовки (10 мкм) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 мкл dNTP (10 мм), 1 единица полимеразы (5 U µл). Выполните реакции PCR с первоначального Денатурация при 94 ° C за 30 s, а затем более денатурации на 94 ° C для 20 s, отжиг на 56 ° C для 20 s, расширение на 68 ° C для 20 s (всего 30 циклов), окончательное расширение на 68 ° C в течение 10 мин , а затем проведение при 4 ° C.
  2. Извлечь и очистить продукты PCR (размер 285 bp) с комплектом очистки ПЦР.
  3. Перевязать очищенных продуктов ПЦР в T вектор с 2 мкл T4 лигирование буфера (10 x), 50 нг T вектор ДНК (50 нг/мкл), 25 нг очищенного ПЦР ДНК (285 bp), 1 мкл T4 лигаза (3 единицы/мкл) и место лигирование смешать в инкубаторе на 16 ° C на ночь.
  4. Передача смеси перевязка в компетентных клеток DH5α, растут на тарелку антибиотик агар ампициллин LB и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  5. Выбрать один клоны от плиты LB и проверить их, Генотипирование и Сэнгер последовательности.

9. Обнаружение sgRNAs индуцированные мутации Indel от нуклеиназы пищеварение Assay

  1. Обнаружить интегрированный один клон sgRNA индуцированных пробирного тест нуклеиназы Indel ставки.
  2. Отдельно готовить ампликонов ПЦР с 50-100 нг Indel мутант (тест) и одичал тип (WT, ссылка) ДНК как шаблон ПЦР, 5 мкл полимеразной реакции буфера (10 x), 1 мкл dNTP (10 мм), 1 единица полимеразы (5 U/мкл), 1 мкл вперед грунтовка (10 мкм) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') и 1 мкг L отменить грунтовка (10 мкм) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). Реакции PCR была выполнена с первоначальных Денатурация при 98 ° C за 30 сек, а затем денатурации 98 ° с в течение 20 сек, отжиг на 56 ° C для 20 s, расширение на 72 ° C для 30 s (всего 30 циклов), а окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин и проведение при 4 ° C.
  3. Гетеродуплексного смесь группу с 200 нг «ссылку» (20 нг/мкл) и 200 нг «тест» (20 нг/мкл) ПЦР ампликонов в 0.2 мл ПЦР-пробирку, homoduplex смесь группы и с только 400 нг «ссылку» ПЦР ампликонов как элемент управления.
  4. Отдельно Инкубируйте смесь гетеродуплексного и homoduplex на 95 ° C за 5 минут в 1 Л стакан наполнен 800 мл воды и затем остыть постепенно до комнатной температуры отжига и образуют гетеродуплексного или homoduplexes.
  5. Отдельно дайджест 400 нг отожженная смеси гетеродуплексного и homoduplex с 1 мкл indel мутации обнаружения нуклеиназы (2,5 U/мкл) и 2 мкл нуклеиназы реакции буфера (10 x) при 42 ° C 60 мин.
  6. Анализировать переваривается образцы с геля агарозы, гетеродуплексного ДНК смесь следует разрезать на небольшие фрагменты (70-250 bp) и homoduplex ДНК (320 bp) не должны быть сокращены.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технология является мощным исследовательского инструмента для функциональных геномных исследований. Он быстро заменить обычные генов, изменения методов и имеет высокую полезность для генома широкий и отдельных приложений, ориентированных на ген. Здес...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Белок кодирование гена, связанные с sgRNA библиотеки были применены в системе функциональной скрининг для выявления генов и сетей регулирования конкретных клеточных функций через sgRNA обогащения24,25,26 ,27,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У нас нет конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.

Благодарности

Авторы также поблагодарить Николая Cesari для редактирования рукопись. Работа была поддержана субсидии от национального института здравоохранения (с.х., R01DK110108, R01CA204044).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 3000 reagentThermo Fisher ScientificL3000-008
Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
PuromycinThermo Fisher ScientificA1113802
Stbl3 cells Life Technologies C737303
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM®-T Easy Vector Systems PromegaA137A
T4 ligase New England Biolabs M0202S
QIAquick Gel Extract kitQIAGEN28706
QIAuick PCR purification kitQIAGEN28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step KitBio-Rad Laboratories1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965084
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific11875093
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine Life Technologies 10378016
Lenti-X Concentrator Clontech631232
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genessee Scientific 25-507
TAE buffer Thermo Fisher Scientific FERB49
Surveyor® Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc SystemBio-Rad170-8126
Centrifuge 5424 REppendorf5404000138
Digital Dry Baths/Block HeatersThermo Fisher Scientific88870002
TSX Series Ultra-Low FreezersThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 IncubatorsThermo Fisher Scientific3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety CabinetThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water BathsThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box SystemsThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855195
MiniAmp™ Thermal CyclerApplied Biosystems technologyA37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power SupplyThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis SystemsThermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® Tube Rotator and RotisseriesVWR International10136-084
VWR® Incubating Mini ShakerVWR International12620-942
Analytical Balance MS104TS/00METTLER TOLEDO30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ SpectrophotometerDeNovix Inc.DS-11 FX

Ссылки

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524(2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

145Cas9sgRNACTCFHOXRTIndel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены