Допрос зародышевых центров отдельных аутореактивная по Photoactivation в модели смешанного химерных аутоиммунитета

Резюме

Этот протокол описывает поколения смешанных костного мозга мышиных химер с спонтанное аутоиммунных зародышевых центров, в которых аутореактивная лимфоцитов нести репортер Зеленый флуоресцентный белок (ПА-GFP) photoactivatable. Это обеспечивает возможность связывать сотовой местоположение в тканях с вниз по течению молекулярной и функционального анализа.

Аннотация

Аутоиммунные заболевания представляют значительный здоровья бремени. Основные вопросы, касающиеся развития и прогрессирования аутоиммунного заболевания остаются без ответа. Одним из требований для выдвижения в наше понимание основных механизмов болезни и клеточных динамики является точное муфта microanatomical расположение подмножества ячеек с течению молекулярной или функционального анализа; Цель, которая традиционно была трудно достичь. Развитие стабильного photoactivatable биологических флуорофоров и их интеграции в репортер штаммов позволило недавно точные microanatomical маркировки и отслеживания сотовых подмножеств в мышиных моделях. Здесь мы описываем, как способность анализировать аутореактивная лимфоцитов из одного зародышевых центров может помочь обеспечить новые идеи в аутоиммунных заболеваний, используя комбинацию модель Роман химерных аутоиммунитета с репортером photoactivatable качестве примера . Мы демонстрируем, что процедура создания смешанной химер с спонтанное аутореактивная зародышевых центров, населенная лимфоцитов, перевозящих репортером Зеленый флуоресцирующий белок photoactivatable. Используя в естественных условиях маркировки стратегии, одного зародышевых центров могут быть визуализированы в описаны лимфоидных тканей и их клеточных компонентов photoactivated по двух Фотон микроскопии. Photoactivated лимфоцитов из одного зародышевых центров могут быть проанализированы или отсортированный поток cytometrically, как отдельные клетки или навалом и может быть подвергнут дополнительные течению молекулярной и функциональный анализ. Этот подход может применяться непосредственно предоставлять новые идеи в области аутоиммунные заболевания, но процедура создания химер костного мозга и photoactivation процедура дополнительно может найти широкое применение в исследованиях по вопросам инфекционных заболеваний и метастазы опухоли.

Введение

Распространенность аутоиммунных заболеваний резко возросла в последние десятилетия, особенно в западных обществах. Сегодня, аутоиммунные заболевания ряды третьим в списке самых распространенных причин заболеваемости и смертности в западном мире¹. Основные вопросы, касающиеся развития и прогрессирования аутоиммунного заболевания остаются без ответа. Одним из требований для выдвижения в наше понимание основных механизмов болезни и клеточных динамики является точное муфты microanatomical расположения клеток подмножеств с течению молекулярной или функционального анализа. В последнее десятилетие развитие целого ряда стабильной photoconvertible, photoactivatable или фотопереключаемых биологических флуорофоров и их интеграции в репортер штаммов позволило точно microanatomical маркировки и отслеживания сотовых подмножества в мышиных моделях.

Каэдэ, флуоресцентный белок photoconvertible, возникая от Стони коралловым, претерпевает необратимые photoconversion от зеленой флуоресценцией на красной флуоресценции под воздействием фиолетовый или ультрафиолетового света². Первоначально заняты следовать динамического поведения отдельных клеток в развитии organotypic мозга ломтики³, поколения Каэдэ стук в мыши впоследствии позволила мониторинг клеточного движения в естественных условиях и система была применена к анализ и из лимфатических узлов⁴миграция иммунных клеток. Этот подход был впоследствии доработан с второго поколения репортер⁵. Дендра⁶, который был недавно использован для отслеживания лимфатических узлов метастазы в vivo⁷аналогичных репортер.

Первый photoactivatable белка разработан был Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) спроектированы с одной Точечная мутация (T203H), приводит к очень низкой оптической плотности в регионе волны от 450 до 550 Нм⁸. После photoactivation фиолетовый свет, этот photoactivatable Зеленый флуоресцентный белок (ПА-GFP) переключает максимума поглощения от ~ 400 до ~ 500 Нм, уступая приблизительной интенсивностью 100-кратного увеличения при возбуждении с длиной волны 488 нм. Поколение трансгенных мышей, в которых все гемопоэтических клеток выразить ПА-GFP допускается, в первый раз, углубленный анализ B клеточной селекции в анатомически определены светлых и темных зон зародышевого центра⁹.

В то время как photoactivation является необратимого преобразования из состояния не люминесцентные флуоресцентный состояние, и photoconversion является односторонним переход от одной волны на другую, белки фотопереключаемых могла попеременные оба условия¹⁰ . Этот последний потенциала недавно была использована для инженер оптический контроль активности белков¹¹.

Используя ПА-GFP репортер, мы недавно охарактеризовал клетки B репертуар одного зародышевых центров в Роман модели спонтанного аутоиммунные заболевания волчанка как¹². Эта модель основана на смешанные химер с 1 часть костного укрывательство аутореактивная клетки B рецепторов забивные со спецификой для ribonuclear белковых комплексов (564Igi^13,14) в сочетании с 2 части костного мозга от любого желаемого доноров. На примерно 6 недель пост растворения гомеостатических условия достигаются в котором спонтанное аутореактивная зародышевых центров присутствуют в селезенке и кожные лимфатические узлы. В частности, зародышевого центра клетки B население составляет почти исключительно (~ 95%) состоит из клеток, полученных из отсека не 564Igi, и эти клетки B производного диких тип стали аутореактивная. Таким образом модель позволяет «plug-and-play» подход к анализу аутореактивная зародышевого центра B клеток с использованием различных трансгенов, стук аутов и репортеры. Здесь мы описываем процедуры для создания смешанных химер с спонтанное аутореактивная зародышевых центров, населенная лимфоцитов, перевозящих ПА-GFP репортер. Использование в естественных условиях маркировки стратегии, одного зародышевых центров могут быть визуализированы в описаны лимфоидной ткани и photoactivated их клеточных компонентов, с помощью двух Фотон микроскопа. Photoactivated лимфоцитов из одного зародышевых центров может впоследствии проанализированы проточной цитометрии или Сортировка по флюрохром активации клеток, сортируя (FACS) и подвергается дополнительные течению молекулярной и функциональный анализ. Способность анализировать аутореактивная лимфоцитов из одного зародышевых центров могут быть применены непосредственно предоставлять новые идеи в области аутоиммунные заболевания, но методов и подходов, описанных может дополнительно найти соответствующие приложения в исследованиях инфекционные заболевания и метастазов опухоли.

протокол

Использование всех животных соответствовал руководящим принципам Европейского сообщества и был одобрен в датской инспекции исследования животных (2017-15-0201-01348).

1. Общие мыши животноводства и подготовка буферов и инструменты

1. Дом мыши линии условиях конкретного возбудителя бесплатно (SPF), с периодический контроль состояния здоровья согласно стандартных руководящих принципов.
2. Дополнительно: Проверьте отсутствие спонтанных зародышевых центров наивно мышей из-за не мониторинг случайного инфекции. Это может быть сделано либо путем иммунофлуоресценции (наличие структур зародышевого центра) или проточная цитометрия (частота зародышевого центра B клеток) как описано¹².
   Примечание: Либо женщины или мужчины могут быть использованы. Как правило он идеально подходит для секса матча доноров и получателей, как несоответствие секса теоретически может привести к alloreactivity к мужской Y-антигена,¹⁵женщин-получателей/доноров.
3. Использование CD45.1 получателей (B6. SJL -Ptprc ЭППУ^b/BoyJ) в возрасте около 6-10 недель. Используйте 564Igi (B6. Cg-Igh^{tm1 тик (Igh564)}Igk^{tm1 тик (Igk564)}/j) и ПА-GFP (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) доноров в возрасте 6-12 недель.
4. Стерилизовать хирургические инструменты (прямо тонкой ножницы и щипцы Дюмон #5 и #7) путем автоклавирования их согласно обычной стерилизации руководящие принципы.
5. Подготовка 500 мл костного мозга (БМ) буфер, содержащий фосфат амортизированное saline (PBS), 2% плода Bovine сыворотки (ФБС), 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) при рН 7,4. Подготовить BM буфера, добавить 10 мл инактивированная тепла (1 час в водяной бане 56 ° C для инактивации дополнение) FBS и 1,25 мл раствора 400 мм ЭДТА (скорректирована с рН 7,4) до 500 мл и PBS, рН 7,4, смесь хорошо. Фильтр буфер с помощью колбу фильтра 0,2 мкм.
6. Подготовка 10 мл буфера lysis эритроцитов (РБК) (155 мм NH₄Cl, 12 мм NaHCO₃, ЭДТА 0,1 мм) путем разбавления 1 мл акций 10 x 10 мл общего объема реагента класс водой. Подготовка 50 мл PBS с 5 мм ЭДТА, рН 7,4.

2. создание смешанной костного химер

1. Облучение получателей (день 0)
   1. CD45.1 костный мозг получателей в контейнере соответствующего облучения и облучать с 1100 Rad в гамма облучателя.
      Примечание: Может использоваться альтернативная облучения источниками. Независимо от источника дозы и сроки должен быть оптимизированы, чтобы принести максимальный myeloablative эффект с повреждения минимальный залог тканей животных.
   2. Место на антибиотик воды ad libitum (1 мг sulfadiazin и 0,2 мг, триметоприм/мл питьевой воды).
2. Извлечение из костей (1 день)
   1. Анестезировать доноров костного мозга 564Igi, непрерывный поток 4% изофлюрановая в воздухе и усыпить шейки матки дислокации. Спрей вниз доноров с этанолом и разместить их на стерильные хирургические колодки в капот потока. Приступить к работе, поддержании стерильных условиях, с использованием стерильных буферов и оборудования.
   2. Чтобы извлечь бедра и голени, сначала надрезают вокруг лодыжки и продлить вверх весь путь до бедра, прямо тонкой ножницами. С помощью тяжелого щипцами или палец и указательный пальцы, потяните кожу вверх и от ноги к телу. Аналогичным образом, потяните кожу вниз и с ног.
   3. Выскочить коленного и голеностопного суставов, схватил ногу на бедра и потянув ногу насильственно. Перейти к разорвать лодыжки совместных и вытащить ноги к телу удерживая голени, тем самым лишая сухожилий и мышц от голени.
   4. Разорвать колена совместного выпустить голени и аналогичным образом тянуть это к телу удерживая бедренной кости, тем самым лишая сухожилий и мышц от бедра. Сделать надрез на тазобедренном суставе и вырезать сухожилия, а затем вытащить бедренной кости от хип сокета. Повторите шаги 2.2.2-2.2.4 на контралатеральную сторону.
   5. Тщательно очистите кости, потерев их с грубой бумажное полотенце, чтобы удалить все оставшиеся мышц и соединительной ткани. Затем промойте их в ледяной BM буфера перед наконец их свежей холодной BM буфер на льду, с помощью пары Дюмон #7 щипцов. Повторите шаг 2.2 для PA-GFP доноров.
      Примечание: Количество клеток костного мозга от одного донора варьируется в зависимости от пола и возраста. Масштаб числа доноров согласно коэффициенты желаемой ввода костного и числа и нужное количество получателей. Если доноры не хватает, Передние конечности могут быть включены для извлечения костного мозга. Это обычно дает дополнительную 1/3 до ½ клеток, полученных из задних конечностей. Как правило везде от 50-200 миллионов клеток могут быть восстановлены на доноров, в зависимости от возраста, пола, происхождения и ли включены только задние или задние и передние конечности.
3. Извлечение клеток костного мозга
   1. Подготовьте раствор, промыв в ледяной BM буфера. Слейте буфер полоскания и использовать контроллер электрической пипетку с 10 мл Серологические Пипетки для добавления 10 мл свежего ледяной BM буфера.
   2. Передать минометов, используя пару Дюмон #7 щипцами кости из 564Igi доноров и пользуйтесь толкателем раздавить и измельчения костей выпустить костного мозга. Аспирационная экстракт костного мозга с 10 мл Серологические Пипетки и передать его через сито ячейки 70 мкм в 50 мл трубки на льду.
   3. Добавьте еще 10 мл свежего ледяной BM буфера с раствором и повторите для обеспечения полного восстановления клеток. Удаление костный материал из минометов с бумажным полотенцем, отменить надлежащим образом и смыть раствор тщательно с 70% этиловом спирте, после чего буфера BM. Повторите шаг 2.3 для PA-GFP группы доноров костного мозга.
4. Подсчет клеток костного мозга
   1. Использование микропипеткой, место капли, содержащие 40 мкл буфера lysis РБК на кусок пластика парафин фильма. Инвертировать трубки костного 564Igi несколько раз и вывезти 10 мкл аликвота, используя микропипеткой. Смешайте его с 40 мкл капли буфера lysis РБК.
   2. Впоследствии 50 мкл Трипановый синий (0,4% в водном растворе) до капли. Сразу же загрузите 10 мкл результате смесь в Burker-Тюрк Горяева и count под микроскопом. Рассчитайте количество клеток / мл, используя 10 x коэффициент полного разрежения. Подтвердить жизнеспособность клеток адекватных > 90%. Повторите шаг 2.4 для PA-GFP группы доноров костного мозга.
5. Подготовка доноров суспензий
   1. На основе графов, полученные на шаге 2.4 и нужное количество получателей, рассчитайте объем доноров костного мозга от каждого из двух донорских групп быть смешаны в трубе смеси доноров.
      Примечание: например, для создания одной группы смешанного 564Igi:PA 1:2-GFP химер с 6 CD45.1 получателей: каждый получатель требует 20 х 10⁶ доноров клеток всего, 1 часть 564Igi и 2 части ПА-GFP. Таким образом, это требует 6 x 1/3 x 20 x 10⁶ = 40 x 10⁶ клеток донора 564Igi и 6 x 2/3 x 20 x 10⁶ = 80 x 10⁶ ПА-GFP доноров клеток.
   2. Смешайте необходимое количество PA-GFP и 564lgi костного мозга донора в 50 мл Конические трубки. Центрифуга костного смеси на 200 x g и 4 ° C на 10 минут, с помощью поворотной ведро ротора.
   3. Декант супернатант и Ресуспензируйте клетки в ледяной BM буфера на плотность составляет 1 x 10⁸ клеток / мл. Переезд в пробки microcentrifuge помощи 1,5 мл на льду.
6. Воссоздание костного получателей с доноров костного мозга
   1. Анестезировать получателей с помощью индукции с непрерывным потоком 4% изофлюрановая в воздухе, следуют обслуживания на 3,75%. Проверка надлежащего плоскости анестезии, отсутствие мыс щепотка рефлекс.
   2. Осторожно проведите трубка, содержащая костного микс для обеспечения адекватного ресуспендирования клеток костного мозга, а затем 200 мкл аспирата костного смеси (~ 20 x 10⁶ клеток), в 0,3 мл, 30 калибровочных инсулина шприца.
   3. Место получателя на своей стороне, мягко растянуть кожу выше и ниже глаз немного поп глаз вне и осторожно вставьте кончик шприца примерно под углом 30° в передней части глазницы, заботясь, чтобы избежать глаз и окружающих тканей. Когда кончик иглы ощущается на ощупь кости, подчеркивая глазницы, убрать немного (~0.5 мм) и медленно залить доноров костного мозга с помощью постоянное давление.
      Примечание: Там должно быть без кровотечения, отсутствие утечки жидкости и не очень мелкие выпуклые глаза после инъекции.
   4. Возвращение мыши в клетке с ad libitum антибиотик водой и проверить немедленного восстановления от процедуры. Повторите шаг 2.6 для каждого получателя.
      Примечание: Хвост-Вену может быть использован вместо retroorbital инъекции с аналогичными результатами, однако, в наших руках это значительно медленнее, что может быть проблемой при работе с большими группами получателей. Восстановления анестезированные животных непосредственно на подстилке малого диаметра следует избегать, поскольку это создает риск аспирации и удушение
7. Удаление антибиотик воды (день 14)
   1. Удаление антибиотик воды из cage(s) и замените регулярные питьевой водой.

3. Проверка успешного растворения и проверка надлежащей степени химеризма (неделя 6)

1. Retroorbital кровотечение химер и элементов управления
   1. Подготовка трубки для сбора крови, маркировки 1,5 мл microcentrifuge трубы согласно tag номера получателя уха и добавляя 50 мкл PBS, содержащих 5 мм ЭДТА.
      Примечание: Включать соответствующие элементы управления для PA-GFP, CD45.1 и CD45.2 и 9D 11 (идиотип). Это может быть сделано путем включения 1 ПА-GFP + мышь, 1 CD45.1 мыши, 1 В6 мыши и 1 564Igi мышь.
   2. Анестезировать мышей и проверки надлежащего плоскости анестезии как шаг 2.6.1. Химера на его стороне, мягко растянуть кожу выше и ниже глаз немного поп глаз вне.
   3. Аккуратно вставьте Майлар завернутый гепаринизированным капиллярной трубки (60 мкл внутренний объем) примерно на 40° угол в передней части глазницы, заботясь, чтобы избежать повреждения глаз и окружающих тканей. Аккуратно твист/поверните трубку до тех пор, пока он начинает заполнять с кровью.
   4. Позволит кровь пассивно заполнения трубки, капиллярность, пока почти полностью, затем убрать трубки и поместить его в соответствующий трубу предварительно помечены коллекции, в то время как в то же время, сразу же расслабляющий сцепление вокруг глаз, чтобы позволить глаза урегулировать обратно в позицию. Следует немедленно прекратить кровотечение.
   5. Убедитесь, что капилляр опорожняется в коллекции трубку и выбросьте его в Шарпс контейнер. Закройте трубку и инвертировать три раза, чтобы обеспечить полное смешивание с ЭДТА PBS.
   6. Вернуть указатель мыши к клетке и проверить немедленного восстановления от процедуры. Повторите шаг 3.1 для каждой экспериментальной мыши и соответствующие элементы управления.
      Примечание: Соблюдайте осторожность при использовании пункция подчелюстной ключе, как этот метод может представляют больший риск случайного инфицирования в облученных получателей, прежде чем они полностью восстановлена. Кроме того в нашем опыте, мы находим, что объем крови и количество крови, потерянных из-за чрезмерного кровотечения больше переменной. Оба эти соображения важны, как костного химер чувствительны в фазе растворения, прежде чем новый костного мозга является полностью прижившимися и кроветворения возобновил нормальные уровни.
2. Периферической крови одноядерных клеток (КСДОР) очистка
   1. После завершения сбора крови, кратко (10 s) центрифуга трубы на низкой скорости (< 200 x g) для сбора разреженного стабилизировалась крови в нижней части трубы.
   2. Заполните шприц 10 мл с лимфоцитов разделение среднего и прикрепить иглы 18 G. Вставьте иглу в нижней части первой трубки и стяжки образца крови с 1 мл лимфоцитов разделения среды. Осторожно снять иглу и протереть бумажным полотенцем для предотвращения перекрестного загрязнения следующего образца.
   3. Пройдите все образцы, а затем центрифуги за 25 минут на 800 x g, при комнатной температуре, в центрифугу размахивая ведро с тормозами, равным низкий/выкл.
   4. Подготовьте набор соответственно помечены 1,5 мл microcentrifuge пробирки, содержащие 1 мл ледяной BM буфера.
   5. После центрифугирования, для каждого образца введите верхний (плазмы) слоя с 200 мкл микропипеткой и аспирационная мононуклеарных клеток (MNC) слой чуть выше интерфейс. Передать клетки соответственно помечены трубка, содержащая 1 мл BM буфера. Закройте крышку и перевернуть смешивать. Выбросите лимфоцитов разделения средне содержащих трубки.
   6. Пройдите все образцы и затем центрифуги на 200 x g за 5 мин., 4 ° C в размахивая ведро ротора. Аспирационная и удалить супернатант Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл ледяной BM буфера. Образцы уже готовы для пятнать антитела и анализа гранулярных потока.
3. Пятнать для оценки потока гранулярных
   Примечание: Предложил панель: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A568, CD45.2-APC. Non активированный ПА-GFP обнаруживается в Тихоокеанском канале оранжевый (или эквивалент). Не краска жизнеспособности требуется, как разделение лимфоцитов избавляется от мертвых клеток.
   1. С помощью микропипеткой, добавьте 100 мкл суспензии клеток за хорошо для каждого образца, химеры и управления, 96-луночных пластины.
   2. Для 3 номера PA-GFP контрольных образцов бассейн оставшиеся 100 мкл каждого образца (всего 300 мкл). Добавьте 50 мкл этого материала для неокрашенных управления и окрашенных контроля скважин. Для управления сингл окрашенных ПА-GFP дополнительно 50 мкл неокрашенных ПА-GFP образца.
   3. Для каждой скважины 100 мкл буфера (неокрашенном), одного антитела (сингл окрашенных компенсации элементы, за исключением PA-GFP компенсации управления) или смесь антител (образцы). Инкубируйте на льду за 20 минут.
   4. Центрифуга на 200 x g 5 минут при 4 ° C. Флик из буфера. Добавить 200 мкл буфера BM в каждой скважине и снова центрифуги для стирки. Флик из буфера и Ресуспензируйте клеток в каждой скважине в 200 мкл буфера BM. Образцы уже готовы для анализа на проточный цитометр (рис. 1).
      Примечание: Зародышевого центра ответы в химеры могут быть проанализированы в любой точке 6 недель и более.

4. В естественных условиях маркировки маргинальные зоны/Субкапсулярной синуса для идентификации одного зародышевых центров по оказанию помощи

Примечание: Настоящий протокол продемонстрировал зверолов/Хок (подколенной лимфоузлов) и инъекции внутривенные (и.в., селезенки), но может быть изменено в соответствии с целевой сайт.

1. Двусторонние зверолов инъекции для маркировки подколенной лимфатических узлов
   1. Анестезировать мышей как шаг 2.6.1.
   2. В трубу microcentrifuge 1,5 мл развести 2 мкл антител CD169 анти мыши PE-меченых крыса в 18 мкл PBS, рН 7,4. Место два капель 10 мкл смеси на кусок пленки пластиковые парафина. Аспирационная каждая капелька с помощью 0,3 мл инсулина шприца с иглой 30 колеи.
   3. Придать 10 мкл маркировки смеси в любом зверолов (Введите иглу под углом 5-10° в центральной части зверолов, проксимальной с самого начала пальцами и вставить иглу примерно на полпути к пятке) или Хок (Введите иглу на 5 - 10 ° угол чуть выше пятки и вставить о середине его длины вдоль оси ахиллова сухожилия в направлении колена). Вернуть их клетки мышей и подождать около 15 минут, прежде чем продолжить с шага 5.
2. Внутривенные инъекции для маркировки селезенки
   1. Анестезировать мышей как точка 2.6.1.
   2. В трубу microcentrifuge 1,5 мл развести 10 мкл антител CD169 анти мыши PE-меченых крыса в 90 мкл PBS. Аспирационная смесь с 0,3 мл шприц инсулина.
   3. Выполнение инъекции и.в. retroorbital в соответствии с шагом 2.6. Вернуть их клетки мышей и подождать около 15 минут, прежде чем продолжить с шага 5.
      Примечание: в качестве альтернативы изофлюрановая, инъекции анестетика, такие как кетамин/Ксилазина смеси могут быть использованы; Однако это обычно приводит к увеличению времени восстановления. Так как лимфатический дренаж обычно влиянием движения скелетных мышц, это должно привести к медленнее время опорожнения.

5. explanting селезенки и лимфатических узлов и подготовка к photoactivation

1. Подготовка двухсторонняя палата изображений и photoactivation
   1. Удалите поршень из 20 мл шприц и обратно нагрузки он с вакуумной смазка, вставив насадка Трубки вакуумные масла в него. Затем удалите поршень от шприц 5 мл и используйте 20 мл шприц для обратно нагрузки он вакуумные смазкой.
   2. Используйте пылесос смазка загружен 5 мл шприц для подготовки изображений и photoactivation палаты, поместив квадратных coverslip на плоской поверхности и отслеживания по краям coverslip с вакуумной жира (около 1-2 мм от края).
      Примечание: позаботьтесь, чтобы избежать загрязнения вакуумного смазка всех поверхностей, которые впоследствии соприкасаться с объектива микроскопа, как microdroplets вакуумных смазки эмульгированных в воде погружения может загрязнить объектив.
   3. Заполните вверх вакуумные смазка камеры крышка выскальзования с ледяной BM буфера и место на холодную ровную поверхность.
2. Заготовка лимфатических узлах и селезенке
   1. Усыпить в естественных условиях помечены химерных мышь, чтобы быть проанализированы в соответствии с шагом 2.2.1. Спрей вниз каркаса с 70% этиловом спирте.
   2. Для доступа в подколенной лимфатических узлов, используйте прямо тонкой ножницы, чтобы сделать надрез в коже чуть ниже колена яму и продлить отрезок вверх вдоль линии подколенного сухожилия почти до тазобедренного сустава. С помощью Дюмон #5 и #7 щипцы, тянуть каждый из выставленных закрылки кожи наружу, чтобы разоблачить ткани в подколенной ямки (рисунок 2A).
   3. Используя пару Дюмон #5 щипцов, внимательно введите подколенной ямки медиальной просто подколенной Вены и вскрыть открыть жира путем вставки и открытия и закрытия щипцы вдоль оси конечности, чтобы разоблачить базовой подколенной лимфатических узлов.
   4. Поп лимфатических узлов из ямки, щипать четырехглавой мышцы от лицевой стороны проксимальнее колена, используя большой палец и указательный палец (рис. 2B). Захватите лимфатических узлов снизу с щипцами для освобождения его от окружающих тканей (рис. 2 c), а затем поместить его в зале вакуумные смазка, подготовленную на этапе 5.1.
   5. Повторите шаги 5.2.2 – 5.2.4 на контралатеральную сторону. Несколько лимфатические узлы могут быть установлены в одной камере, при желании.
   6. Наконец закройте камеру, поместив вторую coverslip поверх вакуумные смазка обода и давит осторожно, стараясь выдавить все пузырьки воздуха.
      Примечание: Некоторые из буфера может вытолкнуть также, но вакуумные смазка должна образуют плотное прилегание, предотвращения утечки жидкости (Рисунок 2D). Лимфатические узлы находятся теперь в двухсторонний тепловизионной камере.
   7. Для доступа к селезенке, используя пару прямо тонкой ножницы сделать надрез через брюшную стенку на левой стороне мыши, проксимальнее передней медиальной линии чуть ниже грудной клетки и продлить его вокруг тела по задней подмышечной линии. Кончик селезенки должно быть видно (рис. 3A).
   8. Вытяните селезенки с парой Дюмон #7 щипцов и вырезать спаек на нижней выпустить его. Использование пара прямо тонкой ножницы сократить ~ 2 мм толщиной, поперечного сечения, ломтики.
   9. Место среза в зале вакуумные смазка, подготовленную на этапе 5.1. Несколько фрагментов хандра могут быть установлены в одной камере, при желании.
   10. Наконец закройте камеру, поместив вторую coverslip поверх вакуумные смазка обода и давит осторожно, стараясь выдавить все пузырьки воздуха. Все тепловизионные камеры на льду все время сохраняйте, за исключением во время визуализации и photoactivation.
       Примечание: Некоторые из буфера может вытолкнуть также, но вакуумные смазка должна образуют плотное прилегание, предотвращения утечки жидкости. Ломтики селезенки в настоящее время двухсторонний тепловизионные камеры (рис. 3B).

6. Photoactivation

1. Определение единого зародышевых центров
   Примечание: Этот Протокол описан для селезенки, но полностью аналогична для лимфатических узлов.
   1. Место тепловизионной камеры на микроскопа. С помощью пипетки пластиковые передачи 3,5 мл, поместите каплю дистиллированной воды поверх верхней coverslip и ниже цели до точки соприкосновения. Фокус на вершине ткани, используя пропускаемого света.
   2. Переключитесь в темный режим и два Фотон возбуждения и настроить лазер для 940 нм.
      Примечание: С наборами соответствующий фильтр, эта длина волны позволяет возбуждения и обнаружения второго поколения гармоник в коллагена содержащих структур, связанных с крупных сосудов и структурные элементы, а также CD169-PE вводят в шаге 4.2, который Идентифицирует маргинальные зоны. Однако 940 нм возбуждения вовсе не photoactivate ПА-GFP.
   3. Локализовать отдельных областей белый целлюлозы (ограниченная окрашивание CD169-PE) вблизи поверхности ткани и идентифицировать periarteriolar лимфоидной оболочка (PALS, Т-клеток зоны), второе поколение гармоник, связанные с Центральной артериолы. В зоне между Палс и маргинальные зоны, посмотрите на наличие весьма autofluorescent, активированный окрашивающийся тело макрофагов (сильный autofluorescent сигнала на всех каналах, blob-вид с темной вакуолей) (рис. 4A).
      Примечание: В случае необходимости, из-за нежелательной ориентации ткани, тепловизионные камеры могут быть отражено и изображений могут быть выполнены из другого направления.
   4. На основании признаков, указанных в шаге 6.1.3., нарисуйте область интереса, определения области одного зародышевого центра. Настройка Z-стек около 100-150 мкм глубины, начиная с поверхности ткани и с использованием размера шага ~ 3 мкм.
   5. Переключиться на волны возбуждения 830 нм. Выключить или затемнить все каналы для предотвращения фотоповреждения детекторы (как мощность лазера и выход флуоресценции обычно значительно выше на этой длине волны) и затем «образ» стек.
      Примечание: Конкретные параметры, такие как лазерная мощности и пиксель продолжительность, зависит от глубины в ткани, конкретные ткани используется и система электронного фотографирования. Каждое приложение должно быть оптимизирована для конкретной системы обработки изображений используется. Хотя важно, чтобы получить эффективный photoactivation во всем стеке, следует позаботиться не фотоповреждения клетки.
   6. Вернуться к волны возбуждения 940 нм и открыть каналы. Сканирование через стек для подтверждения эффективной photoactivation всей (рис. 4B) и отсутствие фотоповреждения (диффузный, не связанной ячейки ПА-GFP сигнал, темные пятна или высокой степенью аутофлюоресценция в photoactivated районе).
   7. Перейти к photoactivate всех соответствующих тканей в тепловизионной камере, а затем незамедлительно вернуть его на льду до дальнейшей обработки. Перейти с photoactivation дополнительных тепловизионных камер.
      Примечание: Ткани explanting, монтажа и особенно photoactivation трудоемких процессов, но общий оборот вокруг времени должно быть ограничено до 4-6 часов, чтобы предотвратить резкое снижение жизнеспособности клеток.

7. восстановление и анализ photoactivated клеток

1. Извлечение лимфоцитов из лимфатических узлов и селезенки
   1. Для каждого образца, photoactivated Подготовьте соответствующим образом помечены 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая 500 мкл буфера БМ на льду. Включает образцы из элемента управления не PA-GFP и неактивированные ПА-GFP мыши. Это достигается путем включения одного управления B6 и один мышь управления ПА-GFP.
   2. Осторожно удалите верхняя крышка выскальзования из тепловизионной камеры, заботясь, чтобы сохранить позицию образцов (если несколько образцов присутствуют в одной камере) и место каждого образца в своих соответствующих образцов трубку.
   3. С помощью пестика гомогенизатор, сжать ткани и твист пестиком в трубе выпустить лимфоцитов. С помощью микропипеткой, аспирационная lysate и процеживают через сито ячейки 70 мкм в пробки microcentrifuge свежий, предварительно охлажденный 1,5 мл. Для образцов лимфатический узел перейдите к шагу 7.1.5.
   4. Для образцов селезёнки центрифуги на 200 x g 5 мин при 4 ° C в размахивая ведро ротора. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл буфера lysis РБК. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, затем 800 мкл ледяной BM буфера и перейти к шагу 7.1.5.
   5. Центрифуга на 200 x g 5 мин при 4 ° C в размахивая ведро ротора. Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 200 мкл ледяной BM буфера. Образцы уже готовы для окрашивания для оценки потока гранулярных и сортировки, при желании.
2. Пятнать для оценки потока гранулярных
   Примечание: Предложил панель: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A647, CD38-PE-Cy7, поправимо жизнеспособности краска Efluor-780, GL7-Pacific Blue. Non активированный ПА-GFP обнаруживается в Тихоокеанском канале оранжевый (или эквивалент). Photoactivated ПА-GFP обнаруживается в канале GFP. Окрашивание с CD169-PE и используя это как дамп ворота могут быть исключены любой совместной очищенную макрофагов (которые могут или не могло быть в естественных условиях помечены CD169-PE).
   1. С помощью микропипеткой, добавьте 100 мкл суспензии клеток за хорошо для каждого образца, химеры и управления, в 96-луночных пластине.
   2. Для B6 контрольных образцов 50 мкл этого материала для неокрашенных управления и окрашенных контроля скважин. Для управления неактивированные сингл окрашенных ПА-GFP дополнительно 50 мкл неокрашенных неактивированные ПА-GFP образца. Для элемента управления активированный ПА-GFP, сингл витражи бассейн оставшийся материал для всех образцов photoactivated.
   3. Каждому хорошо, 100 мкл буфера (незапятнанное и контролирует ПА-GFP компенсации), одну антитела (сингл окрашенных компенсации управления) или смесь антител (photoactivated образцов). Инкубируйте на льду за 20 минут.
   4. Центрифуга на 200 x g 5 минут при 4 ° C. Флик из буфера. Добавить 200 мкл буфера BM в каждой скважине и снова центрифуги для стирки. Флик из буфера и Ресуспензируйте клеток в каждой скважине в 200 мкл буфера BM. Образцы уже готовы для анализа на проточный цитометр или сортировщик (представитель результаты на рис. 5).

Результаты

Создание смешанных костного химер

Настоящий Протокол энергично достигает смешанные костного химер с почти полной химеризма в отсеке клетки B, как показано в результатах представительных на рисунке 1 (для статистической значимости, пожалуйста, обратитесь к ¹²). Serotyping показывает нормализованных клетки B номера на 6 недель пост растворения (рис. 1а), с низкой частотой 9D 11 (идиотип) позитивные циркулирующих клеток B, вытекающие из 564Igi отсека (рис. 1B). В течение всего лимфоцитов ворот, есть низкой частоты остаточного получателя производные ячеек, ~ 6% CD45.1 (Q1), показывающее общую степень химеризма ~ 94% (рис. 1 c). В рамках доноров квартал (CD45.1-, Q4 + Q3) отношение 564Igi (Q4) для PA-GFP (Q3) составляет около 23% до 77%. Это немного ниже, чем ввода 33% до 66% соотношение объясняется большой негативный выбор клеток B вытекает из отсека 564Igi ¹². Как видно из рис. 1 d, существует практически полный химеризма в отсеке клетки B (99,9% CD45.1-) и доминирование клеток костного мозга, полученных B ПА-GFP (Q3), который является следствием тяжелых негативный выбор 564Igi-производные B клеток.

Урожай тканей, обработки и оценки гранулярных потока

Рисунок 2 и на рисунке 3 демонстрируют процедуры и результаты explanting свежезаваренным изолированных лимфатических узлах и селезенке ломтиками. Рисунок 4 представляет представителя результат для маркировки в естественных условиях и photoactivation одного зародышевого центра области в разрезе описаны селезенки. Как видно (рис. 4A), в естественных условиях маркировки с CD169-PE энергично пометил маргинальной зоне (красный, обозначается «Мотовилихинские заводы»). Второй гармоники сигнала проявляется в структурные элементы, содержащие коллаген и крупных сосудов (синий), включая Центральной артериолы periarteriolar лимфоидной оболочка (Палс). Высоко autofluorescent, Активированные макрофаги окрашивающийся тела связаны с зародышевого центра активности (стрелок). Вместе взятые, идентификация маргинальной зоне, приятелей, и окрашивающийся тело макрофагов, позволяет идентифицировать области интереса, который скорее всего содержит одного зародышевого центра. Области интереса является photoactivated, как показано на рисунке 4В. Как показали, photoactivation является microanatomically точные⁹, уступая определенной области активации. Дополнительно представленные результаты служат подтверждением высокой плотности PA-GFP + лимфоцитов в восстановленный химер и наличие спонтанной зародышевых центров. Вниз по течению потока гранулярных оценки далее подтверждает нормализованных клетки B отсека чисел (рис. 5 d), спонтанное зародышевого центра населения (Рисунок 5E) и наличие подмножества ячеек зародышевого центра B, которые были photoactivated (Рисунок 5F).

Таким образом настоящий Протокол представляет надежный метод для создания смешанных костного химер с спонтанное аутореактивная зародышевых центров, которые состоят преимущественно из производных одичал тип B клетки, несущие photoactivatable репортер. Это в свою очередь позволяет течению анализ отдельных зародышевых центров (графический обзор на рис. 6).

Рисунок 1: Поток гранулярных оценки степени химеризма в крови 564Igi (CD45.1-, ПА - GFP-): PA-GFP (CD45.1, ПА-GFP +) смешанная химерами в смертельно облученного CD45.1 получателей (CD45.1 +, ПА - GFP-), 6 недель после растворения. A) участок показаны стробирования B220 + B клеток, предварительно воротами на синглетно лимфоцитов. B) Subgate от участка A, показаны 11 9D + (идиотип) частоты в пределах клетки B населения. C) участок из PA-GFP против CD45.1, предварительно воротами на синглетно лимфоцитов. D) участок PA-GFP против CD45.1 в subgate клетки B от участка A. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Процедура для уборки урожая и монтаж подколенной лимфатические узлы для изображений и photoactivation. A) разрез ниже колена и расширены до тазобедренного сустава, и края убираются в стороны, чтобы разоблачить подколенной ямки (стрелки). B) вышележащих fatpad открыт и подколенных лимфоузлов является подвергаются (стрелки). C) подколенной лимфатических узлов извлекается из ямки. D) процедура повторяется для контралатеральную сторону и обоих узлов установлены в камере двухсторонний coverslip/вакуум смазка заполнены с BM буфера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: процедуры для сбора урожая и монтажа селезенки для изображений и photoactivation. ) Разрез на передней медиальной линии чуть ниже грудной клетки и расширены вокруг тела по задней подмышечной линии, и края убираются подвергать кончик селезенки (стрелки). B) селезенки убирается и вырезан и нарезать ломтиками тонкий (1-2 мм), которые установлены в камере двухсторонний coverslip/вакуум смазка заполнены с BM буфера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Photoactivation. A) двух Фотон Микрофотография зародышевого центра в селезенке перед photoactivation. В естественных условиях маркировки с анти CD169-PE была выполнена до сбора урожая селезенки на этикетке маргинальной зоне (красный, обозначается «Мотовилихинские заводы»). Второй гармоники сигнала является очевидной в содержащие коллаген структуры, связанные с кожного покрова и крупных сосудов (синий). Наконечники стрел выявить весьма autofluorescent, Активированные макрофаги окрашивающийся тело связанных с активностью зародышевого центра. Визуализация была исполнена на 940 нм возбуждения. В баре масштаба в левом верхнем углу указывает 200 µm. B) что касается A, но после photoactivation на 830 нм. Photoactivated клетки являются теперь видны (зеленый) в определенных регионах ограниченный интерес маргинальной зоне и охватывающих ранее выявленных макрофаги окрашивающийся тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Поток анализ гранулярных клеток photoactivated зародышевого центра Б. A) участок вперед против стороны точечной и лимфоцитов у ворот. B) Площадь участка вперед разброс как функция вперед разброс высоты в пределах лимфоцитов ворота и результирующая синглетно ворота. C) жизнеспособности красителя исключение участка в пределах синглетно ворота и результирующая ворота живой клетки. D) Gating B220 + B клеток. E) Gating зародышевого центра B клеток, определены как CD38lo GL7hi клетки внутри ворот B220 +. F) Gating photoactivated клеток в популяции клеток GC B, определены как подмножество ячеек, совместно выражая неактивированные и photoactivated ПА-GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: графический обзор Протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Большое количество мышиных моделях аутоиммунитета доступны, многие из которых представляют с¹⁶спонтанное зародышевых центров. Однако многие из имеющихся моделей гавань сложных генетических стола или мутации в центральном регуляторы лимфоцитов распространения или активации, делает их плохо подходит для intercrossing с линии репортер и исследования поведения обычных лимфоцитов в аутоиммунных заболеваний соответственно. Нынешняя модель, напротив, позволяет «plug-and-play» подход к аутореактивная производного диких тип зародышевого центра B клеток с помощью любой желаемой комбинации трансгенов, стук аутов и репортеров, в данном случае представлен углубленный анализ photoactivatable гена GFP. Использование в естественных условиях маркировки стратегии, одного зародышевых центров могут быть визуализированы в описаны лимфоидной ткани и photoactivated их клеточных компонентов, с помощью двух Фотон микроскопа. Photoactivated лимфоциты от одного зародышевых центров может быть проанализированы или отсортированный поток cytometrically, как отдельные клетки или навалом. Эти клетки могут впоследствии подвергаться дополнительные течению молекулярной и функционального анализа для предоставления новые идеи в области аутоиммунных заболеваний.

Есть некоторые важные шаги для успешного выполнения этой процедуры. Как свидетельствует представитель результаты, облучение (1100 Rad) и воссоздание доноров костного мозга успешно заменить отсеке получателя костного мозга, уступая почти полной химеризма в отсеке клетки B. Это важный момент, поскольку остаточные получателя производные клетки B сделает подмножество населения зародышевого центра «темная». Независимо от источника, используемый для облучения дозы и сроки облучения должна быть оптимизированы, чтобы принести максимальный myeloablative эффект с повреждения минимальный залог тканей животных. Для растворения кость сокрушить протокол и растворения с 20 миллионов всего доноров клеток нашла приносить устойчиво высокое преобразование градусов. Рабочая стерильные и холодной на льду для извлечения костного обеспечивает высокую жизнеспособность донора костного мозга. Для достижения желаемого доноров костного мозга соотношения, важно проявлять большую осторожность при подсчете аликвоты клеток, как для самого подсчета и когда вывоз подвыборки костного мозга для подсчета. Смешивание и совместно грануляции доноров кабачки, вместо центрифугирования и resuspending отдельно и затем смешивания, служит для предотвращения любой наклон в соотношениях доноров после подсчета клеток.

Химера поколения смешанных костного протокола может стоять самостоятельно, и он включает генерирование химер с аутореактивная зародышевых центров с любой требуемой репортер, трансген или нокаут. Однако одно ограничение для этого является необходимость использования histocompatible доноров. Штамм 564Igi на фоне C57Bl/6J congenic и как следствие, других доноров и получателей помощи должны иметь фон congenic H-2b (или в качестве альтернативы, штамм 564Igi следует backcrossed на нужную нагрузку и аутоиммунных фенотип Проверено на новом фоне). Процедура облучения, как правило, в пользу окружающей среды tolerogenic¹⁷, и несоответствия в некоторых незначительных антигены гистосовместимости может быть терпимо. Однако этот аспект должны тщательно рассматриваться, особенно если смешивания мужского и женского пола доноров и/или получателей, благодаря потенциалу для женщин реактивности с мужчины ограничено Y-антигены.

Аналогичным образом аспект photoactivation протокола может стоять самостоятельно и может использоваться во многих различных контекстах. Однако ПА-GFP репортер доступен в настоящее время только с UBC promotor, который действует во всех клетках гемопоэтических линии, но не в стромальные клетки. Как уже упоминалось во введении, другие photoactivatable, фотопереключаемых или photoconvertible репортер штаммы доступны и может быть заменен на PA-GFP, с соответствующей корректировкой экспериментальных условиях.

Важно избежать случайного photoactivation нежелательных областей, поддерживая лазера значительно выше 900 Нм при визуализации, как это будет длина волны не photoactivate ПА-GFP. Для photoactivation себя конкретные параметры, такие как лазерная мощности и пиксель продолжительность, будет зависеть от глубины в ткани, конкретные ткани используется и система электронного фотографирования, и каждое приложение должно быть оптимизирована для конкретной системы обработки изображений используется. Следует позаботиться не фотоповреждения клетки, но это в то же время необходимо получить эффективное photoactivation во всем стеке, для того, чтобы получить достаточное представление активированные клетки для анализа, ниже по течению. Зародышевого центра B клетки обычно составляют везде от 0,5% до ~ 2% клеток селезенки или кожная лимфатического узла Б, и как видно из представительных результатов (рис. 5), photoactivated одного зародышевого центра B клетки могут составляют ~ 1% от общего населения в кусочек единого селезенки. Таким образом успешный анализ или сортировка значительного числа клеток требует обработки большое количество событий.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody, 9D11-A568	In-house generated		9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255
Antibody, 9D11-A647	In-house generated		9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1	Biolegend	110705
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker)	Biolegend	144613
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1)	Biolegend	142403
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38	Biolegend	102717
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220	Biolegend	103235
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized	Fisher Scientific	211766
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Conical tubes, 50 mL	Falcon	352235
Cover slip, square, 22x22 mm, 0.13-0.17 mm	Thermo Fisher Scientific	22X22-1
EDTA	Merck	1,084,180,250
Ethanol, 70%	VWR	8301.360
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270106
Flow cytometer, FACS Canto II	BD Biosciences	338962
Flow cytometer, LSRFortessa SORP	BD Biosciences	-	Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm)
Grease, high vacuum, Dow Corning	VWR	DOWC1597418
Hemocytometer, Burker-Türk	VWR	630-1544
Isoflurane, IsoFlo vet.	Orion Pharma	9658
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media)	Cedarlane	CL5035
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf)	Sarstedt	72.690.550
Microscope, Two-photon	Prairie Technologies (now Bruker)	-	Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml	VWR	410-0110
NaHCO3	Merck	1063290500
Needle, 18 gauge	BD Medical	304622
NH4Cl	VWR	87,769,290
PBS	Sigma	d8537
Pestle homogenizer	VWR	47747-358
Pestle, unglazed, 175 mm	VWR	410-0122
Pipette, Serological, 10 ml	VWR	612-3700
Pipette, transfer, plastic	Sarstedt	861,172,001
Plastic paraffin film (Parafilm M)	Bemis	PM996
Plate, 96-well	Falcon	353910
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps	FST - Fine Science Tools	91150-20
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps	FST - Fine Science Tools	91197-00
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight	FST - Fine Science Tools	91460-11
Syringe, 10 mL	Terumo	SS-10ES1
Syringe, 20 mL	Terumo	SS-20ES1
Syringe, 5 mL	Terumo	SS-05S1
Syringe, Insulin, 0.3 cc	BD Medical	324827
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml	MSD Animal health	431577
Trypan blue solution, 0.4%	VWR	K940-100ML
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	65-0865-14