JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол излагает метод количественного анализа образования митофагии протеинового комплекса, специально в бета-клетках из первичных образцов человека- иаклетов. Этот метод, таким образом, позволяет анализ митофагии из ограниченного биологического материала, которые имеют решающее значение в драгоценных человеческих образцов бета-клеток поджелудочной железы.

Аннотация

Митофагия является важным митохондриальным пути контроля качества, который имеет решающее значение для поджелудочной железы газа бета-клеток биоэнергетики для топлива глюкозы стимулировали высвобождение инсулина. Оценка митофагии является сложной задачей и часто требует генетических репортеров или несколько дополнительных методов не легко использовать в образцах тканей, таких как первичные островки поджелудочной железы человека. Здесь мы демонстрируем надежный подход к визуализации и количественной оценке формирования ключевых эндогенных митофагических комплексов в первичных островках поджелудочной железы. Используя чувствительный метод перевязки близости для обнаружения взаимодействия регуляторов митофагии NRDP1 и USP8, мы можем специально количественно определить формирование основных митофагных комплексов на месте. Соединяя этот подход к противодействию транскрипции факторPDX1, мы можем количественно митофагических комплексов, и факторы, которые могут ухудшить митофагии, в частности, в бета-клетки. Методология, которая мы описываем, преодолевает потребность в больших количествах клеточных экстрактов, необходимых для других исследований взаимодействия белково-белкового взаимодействия, таких как иммунопреципиция (ИС) или масс-спектрометрия, и идеально подходит для драгоценных образцов человека, как правило, не в достаточном количестве для этих подходов. Кроме того, эта методология устраняет необходимость в методах сортировки потоков для очистки бета-клеток от неоднородной популяции островков для применения белка ниже по течению. Таким образом, мы описываем ценный протокол для визуализации митофагии, хорошо совместимых для использования в разнородных и ограниченных популяциях клеток.

Введение

Бета-клетки поджелудочной железы производят инсулин, необходимый для поддержания нормального гомеостаза глюкозы, и их неудача приводит к развитию всех форм диабета. Бета-клетки сохраняют надежную митохондриальную способность генерировать энергию, необходимую для сочетания метаболизма глюкозы с высвобождением инсулина. В последнее время стало очевидно, что поддержание функциональной митохондриальноймассы имеет ключевое значение для оптимальной функции бета-клеток 1,2,3. Для поддержания функциональной митохондриальной массы бета-клетки полагаются на механизмы контроля качествадля удаления дисфункциональных, поврежденных или стареющих митохондрий 4. Мы и другие ранее показали, что бета-клетки полагаются на специализированную форму митохондриального оборота, называемую митохондриальной аутофагией (или митофагией), для поддержания контроля качества митохондрии как у грызунов, так и у человека островков1, 2,5. К сожалению, однако, не было простого способа обнаружения митофагии, или эндогенно выраженных митофагических компонентов, в бета-клетках поджелудочной железы человека.

Недавно мы показали, что регулирование вверх по течению митофагии в бета-клетках опирается на формирование белкового комплекса, включающего E3 лигазаclees CLEC16A и NRDP1 и deubiquitinase USP81. NRDP1 и USP8 были показаны независимо, чтобы повлиять на митофагию через действие на ключевой митофаг иинициатор PARKIN6,7. NRDP1 цели PARKIN для повсеместности и деградации, чтобы выключить митофагии6, и USP8 специально deubiquitinates K6 связанных PARKIN содействовать его транслокации в митохондрии7. Близость перевязки анализ (PLA) технология была недавний прогресс в области белкового взаимодействия биологии8, что позволяет визуализации эндогенных белковых взаимодействий на месте в одиночных клетках, и не ограничивается дефицитным материалом образца. Эта методология особенно заманчиво для человека островк / бета-клеточной биологии, в связи с редкостью наличия образцов, в сочетании с необходимостью понимания физиологически значимых белковых комплексов в неоднородных типов клеток.

Используя подход PLA, мы можем наблюдать ключевые комплексы эндофагии в первичных бета-клеток поджелудочной железы человека и нейрональных клеточных линий, и продемонстрировать влияние диабетогенной среды на митофагическом пути1. Таким образом, главной целью этого протокола является анализ конкретных митофагных белковых комплексов в тканях, не хватает обильного материала, или где обычные исследования взаимодействия белка невозможны.

протокол

Использование де-идентифицированных донорских островков поджелудочной железы человека через Институциональный наблюдательный совет (IRB) освобождение и в соответствии с Мичиганского университета IRB политики. Островки поджелудочной железы были предоставлены NIH/NIDDK спонсируемой Комплексной программой распределения островок (IIDP).

1. Подготовка образца человеческого именноадора

  1. Диссоциация одноклеточных ячеек
    1. Образцы культуры человека- иофорта (4000-6000 эквивалентов газолетов/10 мл носителей) в течение не менее 1 дня при 37 градусах Цельсия в поджелудочной железе, атакжеме - 1 мМ глутамина (PIM(G)), 100 единиц/мл противоопухолево-антибиотико-антибиотик, 1 мм натриевый пирруватый и 10- сыворотка (FBS) или сыворотка АБ человека.
    2. Используйте световой микроскоп для вскрытия при 3-х увеличении, чтобы подсчитать отдельные островки человека от культуры. Выберите 40 островков за лечение/состояние интереса (например, глюколипототоксичность) в 1,5 мл труб оков в островках.
    3. Островки Центрифуги при 400 х г в течение 1 мин при 10 градусах По цельсию до осадка.
    4. Вымойте образцы, путем краткой инверсии труб при комнатной температуре, дважды с 1 мл фосфата буферного соления (PBS), содержащего 50 мкм PR619 (ингибитор деубицициназы; для сохранения убиквитин зависимых белков ы влицаниях), с центрификацией между каждой стирки при 400 х г в течение 1 мин при 10 градусах По цельсию.
    5. Диссоциативные островки на одиночные клетки с 125 йл 0,25% трипсин, содержащий 50 мкм PR619 путем инкубации предварительно разогретого трипсина (37 градусов по Цельсию) в течение 3 мин с островковыми гранулами. Аккуратно рассеять островки в течение этого времени с периодическим нежным трубачом с помощью 200 л пипетки.
    6. Утолить трипсин с 1 мл разогретого (37 градусов по Цельсию) PIM (S) медианов, содержащих 50 мкм PR619, затем осадочных клеток центрифуги на 400 х г в течение 1 мин.
    7. Вымойте клетки центрифугированием при 400 х г в течение 1 мин, дважды, с PBS 50 мкм PR619.
    8. Наконец, повторное присоединение клеток в 150 МЛ PBS, содержащий 50 мкм PR619.
  2. Одноклеточная присоединение и фиксация
    1. После повторного приостановки, спина клеточного раствора на матовый, заряженный, микроскоп слайды с помощью cytocentrifuge на 28 х г в течение 10 минут.
    2. После цитоцентрифугирования, наброски клеточной области с гидрофобной ручкой (см. Таблица материалов), чтобы свести к минимуму антитела / PLA объемы решения необходимо. Исправьте клетки с 4% параформальдегидом в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: PFA является опасным и должны быть обработаны с осторожностью.
    3. Для достижения наилучших результатов, выполнять окрашивания / PLA немедленно, или в течение 24 ч. При необходимости храните образцы в PBS при 4 градусах Цельсия до окрашивания не более 48 ч.

2. Иммуногистохимия

  1. Блокировки
    1. Вымойте клетки дважды с 1x PBS в течение 5 минут при комнатной температуре.
    2. Блок клеточного раствора, чтобы устранить фоновое окрашивание, с 10% осла сыворотки в PBS, содержащий 0,3% моющего средства (см. таблицу материалов) для 1 ч при комнатной температуре.
  2. Окрашивания
    1. Инкубировать клетки с первичной мыши или кролика антитела против USP8 (1:250) и NRDP1 (1:250) соответственно (см. Таблица материалов) разбавленный в фосфатных буферных сосудистой с моющим средством (PBT, см. Таблица материалов), на 4 кв ночь, чтобы обнаружить митофагию комплекса сигнализации через PLA.
    2. Совместное инкубировать клетки с маркером, специфичным для идентификации бета-клеток, который не был поднят в мыши или кролика, чтобы не вмешиваться в сигнал PLA. В этом случае инкубируют клетки с антикозом PDX1 (1:500) в ПБТ. Инкубировать все первичные антитела на ночь при 4 градусах Цельсия, используя пластиковую пленку поверх раствора, чтобы предотвратить испарение.

3. Перегоняемый асссирование близости

  1. ЗОНД НОАК и контрпятно
    1. Подготовьте решение зонда PLA в соответствии с инструкциями производителя, т.е. сделайте 20 л зонда раствора на образец, подготовив окончательную концентрацию раствора 1:5 как анти-мышонка, так и анти-кроличьего зонда в PBT, и инкубируя в течение 20 минут в помещении Температура.
    2. После ночной инкубации, мыть клетки дважды с 1x PBS в течение 5 минут каждый, на рокер.
    3. Непосредственно перед инкубации с зондом решение, добавить анти-коза Cy5 вторичной в окончательной концентрации 1:600 в зонд решение (для обнаружения эндогенных PDX1). Добавьте 20 раствор зонда к каждому состоянию клетки, аккуратно накройте пластиковой пленкой и инкубируйте при 37 градусах По кв. м в течение 1 ч.
  2. Перевязка
    1. Вымойте клетки дважды, при комнатной температуре, с буфером A (см. таблицу материалов для рецепта) в течение 5 минут каждый, на рокер.
    2. Приготовьте раствор перевязки (часть реагентов обнаружения, см. Таблицаматериалов) в соответствии с инструкциями производителя. Для этого разбавляют запас перевязки (5x) 1:5 в диэтил-пиробкарбонат (DEPC) очищенной воде. Непосредственно перед инкубации добавить 0,025 U/mL лигазы. Добавьте в клетки раствор перевязки 20 л. Накройте пластиковой пленкой и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
  3. Усиления
    1. Вымойте клетки дважды при комнатной температуре с буфером А в течение 2 мин каждый.
    2. Сделать усиливающих раствор (часть обнаружения реагентов, см. Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя. Разбавить буфер усиления (5x) 1:5 в DEPC-обработанной воды и держать в темноте до использования. Добавьте 1:80 разбавления полимераза (часть обнаружения реагентов, см. Таблица материалов) в раствор непосредственно перед добавлением раствора в клетки.
    3. Добавьте в клетки 20 злификации раствора. Накройте пластиковой пленкой и поместите в темноту при 37 градусах По цельсии в течение от 1 ч 40 мин до 2 ч для максимального сигнала.
  4. Подготовка к визуализации
    1. Вымойте клетки дважды с буфером B (см. таблицу материалов для рецепта) в течение 10 минут при комнатной температуре, на рокер.
    2. Наконец, мыть клетки один раз в 0.01x Буфер B, в течение 2 минут при комнатной температуре на рокер.
    3. Маунт образцы, добавив каплю монтажа средств массовой информации, содержащие 4 ",6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) и тщательно размещения coverslip над образцами с помощью скальпеля лезвие, чтобы выжать любые пузырьки образуются. Печать покрывает липы с помощью прозрачного лака для ногтей по краям.
    4. Образцы изображений на микроскопе, способном захватывать несколько фокусных плоскостей, такие как лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, или перевернутый флуоресцентный микроскоп с возможностями деконволюции, принимая по крайней мере 9 различных изображений фокусной плоскости.
      1. Захват изображений на 100-кратный увеличение, с примерно 0,45 мм z-стек высоты. Захват PLA на 550 нм возбуждение, 570 нм выбросов; противопяте пятно при возбуждении 650 нм, 670 нм выбросов; и DAPI при 405 нм возбуждении, 450 нм выбросов.
    5. Для обеспечения флуоресценции фоновых сигналов изображения и рассеянного света сведены к минимуму для анализа событий НОАК (особенно на широкоугольных микроскопах), обработка изображений с использованием двухмерного алгоритма деконволюции (ближайшего соседа) с помощью стандартное программное обеспечение для обработки изображений по выбору.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для Olympus использовать CellSens, Nikon использовать NIS-Элементы, Leica использовать LAS X, Зейсс - ЗЕН, Метаморф, MATLAB, Гюйгенс программного обеспечения, а также несколько плагинов доступны через Image-J. Для анализа следует проанализировать общее количество взаимодействий по всем z-стоимам с помощью программного обеспечения Image-J, обеспечив анализ только положительных ячеек Pdx-1 (раздел 3.5).
  5. Количественная оценка взаимодействий НОАК
    1. Откройте бесплатное программное приложение Image-J и откройте изображение PLA. Начните с первого резко в фокусе НОАК изображения.
    2. Нажмите на вкладку изображения, и выберите настроить,то порог (рисунок1A). Отрегулируйте порог, чтобы удалить все неспецифические сигналы PLA, сделайте примечание корректировки порога и попытайтесь сохранить его последовательным на протяжении всего анализа.
    3. Нажмите на вкладку процесса, и выберите двоичный, а затем сделать двоичный (Рисунок1B). Используйте двоичное изображение для измерения частиц,нажав на вкладку "анализировать" и нажимая частицы (рисунок1С).
    4. Для анализа убедитесь, что настройки следующие: Размер 0-Бесконечность, Круговая no 0-1.0, Показать - Очертания, флажки для результатов отображения,и четкие результаты (рисунок1D). Нажмите OK. Обратите внимание на количество частиц, проанализированных в электронной таблице, обозначающих образец, и положение z-stack.
    5. Повторите шаги 3.5.2-3.5.4 до тех пор, пока не будут проанализированы все фокус-стеки z для выборки. Сумма общее количество частиц для образца в таблице количественнообщее количество взаимодействий.

Результаты

Мы провели первоначальные эксперименты в линии бета-клеток поджелудочной железы MIN6 и линии нейробластомы SH-SY5Y SH-SY5Y, чтобы оптимизировать и подтвердить как специфичность антител, так и визуализированные белковые взаимодействия. Клетки MIN6 были покрыты крышками на крыш...

Обсуждение

Здесь мы описываем простой и эффективный подход к использованию NRDP1:USP8 PLA в тканях/клетках, представляющих интерес для количественной оценки формирования высокопотечения митофагических комплексов. Ранее мы подтвердили формирование CLEC16A-NRDP1-USP8 митофагии комплекса в бета-клеток поджелу...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы признают финансовую поддержку со стороны JDRF (CDA-2016-189 и SRA-2018-539), Национального института диабета и болезней пищеварения и почек, Национальных институтов здравоохранения (R01-DK-108921), семьи Брем и семьи Энтони. Премия JDRF по развитию карьеры s.A.S. частично поддерживается Датской академией диабета, которая поддерживается Фондом Ново Нордиска.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTA 1XLife Technologies25200-056
Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062
Block solutionHomemadeUse 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.
Buffer AHomemadeTo make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use
Buffer BHomemadeTo make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use
Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goatJackson Labs705-175-147
Detection Reagents RedSigma- AldrichDU092008-100RXNKit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.
DuoLink PLA probe anti-mouse MINUSSigma- AldrichDU092004-100RXN
DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUSSigma- AldrichDU092002-100RXN
Fetal bovine serum
Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)Santa CruzSC-14664RRID: AB_2162373
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MIN6 pancreatic cell lineGift from D. StoffersMouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.
Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)Sigma- AldrichSAB200527
Pap-penResearch Products International195505
ParafilmUse to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.
PBT (phosphate buffered saline with triton)HomemadeTo make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)
Penicillin-Streptomycin (100X)Life Technologies15140-122
Phosphate buffered saline, 10XFisher ScientificBP399-20
PIM(ABS) Human AB serumProdo LabsPIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)Prodo LabsPIM-G001GMP
PIM(S) mediaProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
Prolong Gold antifade reagent with DAPILife Technologies (Molecular Probes)P36935
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)Bethyl LaboratoriesA300-049ARRID: AB_2181251
SH-SY5Y cellsGift from L. SatinHuman neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.
Sodium Pyruvate (100X)Life Technologies11360-070
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Water for RNA work (DEPC water)Fisher ScientificBP361-1L

Ссылки

  1. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
  6. Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
  7. Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
  8. Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
  9. Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
  10. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  11. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
  12. Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
  13. Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
  14. Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
  15. Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
  16. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  17. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  18. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  20. Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
  21. Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
  22. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  23. Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  24. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены