Opsonophagocytic убийства Assay оценить иммунологические реакции против бактериальных патогенов

Резюме

Этот assay убийство opsonophagocytic используется для сравнения способность фагоцитирующих иммунных клеток реагировать и убивают бактерии, основанные на различных методов лечения и/или условий. Классически этот assay служит золотой стандарт для оценки эффекторные функции антител против бактерий как опсонин.

Аннотация

Ключевым аспектом иммунного ответа на бактериальной колонизации хоста является фагоцитоза. Assay убийство opsonophagocytic (OPKA) является экспериментальной процедуры, в котором фагоцитирующих клеток совместно культивируемых с бактериальной единиц. Иммунные клетки фагоцитоз и убить бактериальных культур в духе дополнение зависимых. Эффективность убийства клеток иммунной системы зависит от целого ряда факторов и может использоваться для определения различных бактериальных культур сравнения в отношении устойчивости к смерти клетки. Таким образом можно оценить эффективность потенциал на основе иммунной терапии против конкретных штаммов бактерий и/или серотипов. В этом протоколе мы описываем упрощенная OPKA, которая использует основные культуры условий и клеток подсчета для определения жизнеспособности бактериальных клеток после совместного культуры с условий лечения и иммунных клеток HL-60. Этот метод был успешно использован с рядом различных серотипов пневмококков, капсульные и acapsular штаммов и других бактериальных видов. Преимущества этого протокола OPKA являются его простота, универсальность (как этот assay не ограничивается лечения антителами как опсонины) и минимизации времени и реагенты для оценки основных экспериментальных групп.

Введение

Opsonophagocytic убийства пробирного (OPKA) является важнейшим инструментом для увязки изменения в бактериальных структуры или функции для последующих изменений в иммунной реакции и функции. Таким образом он часто используется в качестве дополнительного анализа для определения на основе иммунной эффективность лечения антителами, вакцин-кандидатов, оптимизация фермента и т.д. Хотя в естественных условиях анализы необходимы для определения эффективного разминирования или защиты в модели бактериальной инфекции, OPKA может использоваться для оценки иммунного вклад в бактериальной клетке смерти на самых основных компонентов: бактерии, иммунные клетки и экспериментальные лечение. Предыдущие исследования показали, что OPKAs могут быть модифицировать и использовать для различных бактерий и серотипов, включая Streptococcus pneumoniae¹,² золотистый стафилококк, синегнойная³. Кроме того эти оптимизированные анализов может использоваться для оценки различных экспериментальных процедур, включая фермента возможность сделать более доступными для дополнения опосредованных иммунных клеток⁴ и антитела лечение для улучшения бактерии опсонизацию⁵. Классически, OPKA пробирного успешно используется в фундаментальных и клинических исследованиях параметры как мощный индикатор для защиты индуцированных возбудителя специфические антитела^6,,78,9 .

Различные типы иммунных клеток может использоваться для оценки opsonophagocytic убийства. Один из часто используемых фагоцитарной населения является линия человека лейкозных клеток HL-60. Эта линия клетки могут храниться как инактивированных promyelocytes в культуре; Однако они могут быть продифференцированы в различных активированных государства через различных наркотиков лечения^10,11. Лечение HL60 с N, N-Диметилформамид дифференцирует линии клетки в активированных нейтрофилов с сильным фагоцитарной активности¹¹. В то время как клеток HL-60 были оптимизированы и часто используются для этих анализов фагоцитоза¹⁰, других первичных полиморфноядерных лейкоцитов может использоваться как иммунные руку эксперимент¹².

Кроме того эти анализы может быть упрощенной¹³ или мультиплексированных¹⁴ взглянуть на несколько устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий для проверки. Мультиплексированных метод был достигнут более реальным путем разработки программного обеспечения, которое может эффективно рассчитывать бактериальные колонии, образуя единиц (CFUs) за пятно на плиты агара¹⁵. Здесь мы описываем рациональный метод, используя один штамм бактерий, клеток HL-60, ребенок кролика дополнением и плиты агара крови. С помощью этого метода несколько процедур можно быстро оценить вопросы конкретных исследований на как можно модулировать врожденный иммунный ответ к бактериальной инфекции.

протокол

1. Культура, дифференциация и проверки клеток HL-60

1. Подготовьте СМИ культуры клеток HL-60 состоит из 500 мл RPMI с L-глютамина и 50 мл тепло инактивированная плода бычьим сывороточным. Не добавляйте антибиотики, как это может повлиять на дифференциацию клеток HL-60.
2. Для распространения/обслуживание клеток HL-60 культуры 5 х 10⁶ клеток в 10 мл средства массовой информации культуры клеток HL-60 75 см² вентилируемые фляги при 37 ° C и 5% CO₂. Проход клетки каждые 3−4 дней для поддержания оптимального клеток концентрации.
   Примечание: Клетки концентрация не должна превышать 5 x 10-6/мл.
3. Создайте рабочие запасы клеток HL-60, aliquoting примерно 1 х 10⁶ клеток/мл в HL60 культуре СМИ с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) в 1 мл криогенных трубы.
   Примечание: Рабочие запасы могут храниться при температуре-80 ° C. Основной запас должен храниться при-120 ° C.
4. Дифференцировать клеток HL-60, культивирования 1,5 x 10-⁷ клеток в 15 мл средства массовой информации культуры клеток HL-60 с 0,6% N, N-Диметилформамид (DMF) при 37 ° C и 5% CO₂ в стерильных фильтр максимум 75 см² фляги для 3 дней до OPKA.
5. Проверить что клеток HL-60 успешно дифференцированной и подходят для использования в OPKA assay путем тестирования жизнеспособность и поверхностных маркеров ячейки согласно установленным потока цитометрии протоколы^{16,17, 18,19}. После дифференциации урожай клеток HL-60 и пятна примерно 1 х 10⁴ клетки с дневно конъюгированных антител/пятна для CD71, CD35, annexin V и пропидий йодидом.
   Примечание: Дифференцированных клеток должно быть ≥65 жизнеспособным, ≥55% CD35⁺и ≤20% CD71 создана⁺ определяется путем проверки протоколов¹⁴ (рис. 1).

2. Подготовка OPKA буферов и реагенты

1. Подготовка 50 мл стерильного опсонизацию буфера B (OBB) путем смешивания 42,5 мл стерильного 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) с Ca^{2 +}/Mg^{2 +}, 5 мл сыворотки тепла инактивированная плода говядину и 2,5 мл 0,1% стерильный желатина. Хранить при 4 ° C.
2. Получить ребенок кролика дополнением и хранить при температуре-80 ° C.
3. Получить или подготовить бактериальной культуры (то есть, 15 x 100 мм² 5% овец крови агар Знаки номерные знаки).

3. Подготовка образцов бактериальных запасов

1. Получите запас бактериальный strain(s) тестируемых.
   Примечание: Для этого протокола, серотипа 3 пневмококк (WU2, щедро предоставленных д-р Муна Nahm) используется.
2. Расти бактериальный штамм в соответствующей бульон (т.е., Тодд-Хьюитт бульон + 0,5% экстракт дрожжей для этого штамма WU2) для приблизительно 2−4 ч при 37 ° C.
   Примечание: Оптическая плотность при 600 Нм (₆₀₀OD) культуры должно составлять 0,6 и 0,8.
3. Пелле бактерии центрифугированием при 6000 x g на 2 мин и Ресуспензируйте клетки в 10−30 мл 15% глицерина в соответствующие бульон. Алиготе бактериальной культуры (500 мкл на Алиготе) в стерильных 1.5 мл пробирок и хранить при температуре-80 ° C.
4. Оттаять одного флакона бактериальных акций в ванну воды 37 ° C. Пелле бактериальные клетки и Ресуспензируйте в 500 мкл OBB в стерильных условиях.
5. Подготовка различных разведениях бактериальной акций в «OBB» (т.е., 10 мкл неразбавленный, 10 мкл 1:10, 10 мкл масштаба 1: 100 и т.д.). Выполните OPKA пробу (разделы 4 – 6, включая HL-60/дополнением сотрудничества культуры), как описано ниже с использованием различных разведениях Необработанные бактериальных запасов. Культура пластины на ночь на 30 ° C (CO₂).
   Примечание: Температура 30 ° C для WU2 предотвратить разрастание; другие штаммы/серотипы могут расти оптимально при 37 ° C.
6. Подсчет колоний для каждого разведения Необработанные бактериальных акций совместно культивируемых клеток HL-60 и дополнения. Определите, какие разведения бактерий дает оптимальное количество countable колоний (примерно 80−120 CFUs для без лечения бактерий, совместно культивируемых клеток HL-60). Обратите внимание, это раствора для будущих OPKAs с участием этой бактериальные фондовом.

4. бактериальных лечения и культура

1. Разморозить один трубки бактериальной акций, подготовленную на этапе 3.3. Пелле бактерий (6000 x g на 2 мин) и Ресуспензируйте Пелле клеток в OBB на оптимальное разведение, определенных на шаге 3.6.
2. Пипетка 10 мкл ресуспензированы бактериальной разрежения в колодец в раунд нижнюю ячейку 96-луночных культуры пластине.
3. 20 мкл соответствующего лечения антителами или наркотиков, для каждой экспериментальной скважины в двух экземплярах.
   Примечание: В этом протоколе серотип специфические антитела, сгенерирована мышей добавляется в качестве лечения X и гликозид гидролазы фермента, известного деградировать серотипа 3 полисахаридной капсулы добавляется в качестве лечения Y (рис. 2)^4,20. Для контроля скважин используйте 1 x PBS или OBB, в зависимости от буфер, используемый для лечения скважин.
4. Встряхните образца пластины на приблизительно 90 об/мин за 1 ч при комнатной температуре. Настройте эти условия в зависимости от оптимальной температуры или встряхивания условий лечения проходит испытания.

5. HL-60 Бактериальная культура сотрудничества

1. Подготовьте клеток HL-60, уборки HL-60 дифференцированной клетки, которые обращаются с ДМФ три дня до (см. шаг 1.4) в 15 мл конические трубы. Пелле клетки (500 x g, 3 мин), удалить супернатант и мыть с по крайней мере 10 мл ПБС.
2. Пелле вымыть клетки (500 x g, 3 мин), удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в OBB (начать с 1 мл OBB и настроить для окончательного концентрации 1 x 10-7/мл после подсчета клеток).
3. Добавьте дополнение кролик baby (стерильные, неразбавленное baby кролик сыворотки, возраст 3−4 недель) на окончательный объем 1:5.
   Примечание: Конечная концентрация HL-60-дополнения смесь должна быть 1 x 10-7/мл. Если тестирование дополнения зависимостей, второй раствор, содержащий активных клеток HL-60 с тепло инактивированная дополнением может использоваться (дополнением может инактивированная по инкубации в водяной бане при > 55 ° C для по крайней мере 30 минут).
4. После того, как 1 h бактериальной культуры является полным (шаг 4.4), разделите дублировать скважин для двух групп (например, использование только 20 мкл самобытной культуры 30 мкл совместного учета для дозирования ошибка) каждый образец (т.е., 10 мкл каждого 30 мкл пример хорошо в две новые скважины) : один набор будет совместно культивируемых с HL-60-дополнение и один будет включать в себя только бактерии. Добавьте 50 мкл HL-60-дополнения смесь (из шага 5.3) для каждого экспериментального набора скважин (делегированных + HL-60); Добавьте 50 мкл OBB только скважин бактерий только (делегированных -HL-60).
   Примечание: Для этого примера примерно 800 бактериальный CFUs используются для первоначального совместного культуры клеток HL-60 мкл⁵/50 5 x 10. Если это многообразие инфекции является слишком высокой или слишком низкой, как указано в заключительном колонии числами, скорректировать первоначальный бактериальных разрежения в отличие от числа клеток HL-60.
5. Встряхните 96-луночных пластины при 37 ° C в течение 1 ч (CO₂).

6. образец покрытия и ночь инкубации

1. Разбавьте каждый хорошо 1:5 с «OBB», так что каждый образец имеет объем по крайней мере 50 мкл.
2. Пипетка 50 мкл каждого образца непосредственно на заданном районе бактериальной культуры пластины, обеспечивая достаточное расстояние между образцами. 15 x 100 мм² раунд плиты агара, накапайте приблизительно 4 образцы на одну пластину.
3. Накрыть и образцы сохнуть в течение приблизительно 15 минут при комнатной температуре.
4. Инвертируйте пластины и культуры на ночь на 30 ° C (CO₂). Кроме того культура пластины в анаэробных баночки для проверки ли бескислородные условия влияют на рост бактерий или управления для морфологии.
5. После ночи культуры счетчик колоний в каждой области указанного образца. Анализ данных, сравнивая количество живых клеток в каждом наборе для соответствующего элемента управления и/или образцы, которые не получают совместно культуры клеток HL-60 (ориентировочный выживания клетки 100%, 0% клеток убийство).

Результаты

Проверка HL-60 дифференциации должны выполняться перед началом OPKA. Это может быть достигнуто с помощью проточной цитометрии для определения внеклеточного выражение CD11b, CD35, CD71 и annexin V (рис. 1). Пропидий йодидом может также использоваться в качестве маркера жизнеспособности...

Обсуждение

OPKAs служат существенно важную роль в оценке антител при посредничестве иммунных реакций, вызванных прививки^6,8. Основной смысл этой упрощенной OPKA является адаптируемость в условиях для проверки (то есть, антитела, фермента лечения и т.д.). В этом смысле в то...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V (APC conjugated)	BioLegend	640919
anti-CD35, human (PE conjugated)	BioLegend	333405
anti-CD71, human (PE conjugated)	BioLegend	334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2)	Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)
blood agar plates	Hardy Diagnostic	A10
Fetal Clone serum	HyClone	SH30080.03
glycerol	Sigma	G9012-1L
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated)	BioLegend	400907
N,N-dimethylformamide (DMF)	Fisher Chemical	UN2265
propidium iodide	Sigma	P4864
RPMI media with L-glutamine	Corning	10-040-CV