JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол детализирует процедуру, в которой нейронные культуры человека преобразуются с лентивирусными конструкциями, кодирующие для мутантного человека Тау. Трансдуктед культур отображения Тау агрегатов и сопутствующих патологий.

Аннотация

Аберрантное агрегирование белка Тау патогенично участвует в ряде нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (AD). Хотя мышиные модели толопатии предоставили ценный ресурс для исследования нейротоксических механизмов агрегированного Тау, становится все более очевидным, что из-за межвидовой разницы в нейрофизиологии, мозг мыши непригоден для моделирования состояния человека. Достижения в области клеточной культуры сделали человека нейрональных культур доступны для экспериментального использования в пробирке и способствовали развитию нейротерапии. Однако, несмотря на адаптацию человеческих нейрональных клеточных культур, в пробирке модели человеческой таулопатии еще не широко доступны. Этот протокол описывает клеточную модель агрегации Тау, в которой человеческие нейроны преобразуются с лентивирусными векторами, которые кодируют патогенически мутировавшего Тау, сплавленного в репортера желтого флуоресцентного белка (YFP). Трансдукд культур производят Тау агрегатов, что пятно положительно для тиофлавина и отображения маркеров нейротоксичности, такие как снижение длины аксонов и увеличение лизосомальный объем. Данная процедура может быть полезной и рентабельной моделью для изучения человеческих тауопатий.

Введение

Патологическая агрегация микротрубочек связанных белка Тау является определяющей чертой многих нейродегенеративных заболеваний, в том числе AD, фронтовисочной деменции (FTD), болезнь пика, и прогрессивный надъядерного паралич (PSP)1. В небольное состояние, Тау связывается и стабилизирует микротрубочек нитей в нейрональных аксонов2. Однако, связанное с болезнью гиперфосфорилирование Тау способствует агрегацию Тау, диссоциации из микротрубочек и нейрональной токсичности3. Токсическое воздействие агрегированного Тау может включать аномальную активацию холинергических4 и глутаматергических рецепторов5 , приводящее к регуляции внутриклеточного кальция и, в конечном счете, клеточной смерти. В моделях животных, снижение мозга Тау улучшает патологии в мышах AD6 и в мышах моделей повторяющихся мягкой черепно-мозговой травмой7.

Монтаж доказательств свидетельствует о том, что структура и обязательным сродство мыши полученных Тау отличаются от человека, полученных Тау и что мышь Тау непригодна для моделирования человеческих тауопатий8. Тем не менее, человеческие клетки таулопатии модели не являются широко коммерчески доступными. Общая цель этой работы состоит в том, чтобы описать в пробирке модель агрегация Тау, в которой человеческие нейроны преобразуются с лентивирусных производных векторов, содержащих мутантные человеческие конструкции Тау9. Тау совокупности вызывает лентивирусные конструкции кодирует для Тау повторить домен укрывательство P301L и V337M мутаций, слиты с корреспондентом YFP (Тау-RDDM-YFP), а Управление строит код для дикого типа (ДФ) Тау повторить домен сливается с репортер YFP (Тау-т-YFP). Нейронные культуры трансдукты с помощью этого метода выражают примерно в девять раз больше Тау, чем нетрансдукты культур. Хотя количество выражения Тау чрезмерно выражено примерно равным между Тау-РДМ-ИФФ-и Тау-т-ЗПС-трансдукзные клетки, только нейроны трансдукты с дисплеем Тау-РДМ-YFP агрегаты. Культур преобразователи с Тау-РДМ-YFP пятно положительно для тиофлавина и отображения сокращений в аксональной длины и синаптической плотности. Таким образом, эта клеточная модель может быть полезным инструментом для изучения агрегация Тау в пробирке.

протокол

1. подготовка средств массовой информации и реагентов

  1. Оттепель матричных Мембранные покрытия для культуры пластин при температуре 4 ° c (не позволяйте матрице фундамента мембраны, чтобы согреться или он затвердеет). Сделайте 1 mL aliquототы и храните их при температуре-20 °C или-70 ° c.
  2. Воссоздать базовый фактор роста фиброзного (bFGF) в стерильном фосфата-буфером физиологического раствора (PBS) при 10 мкг/мл и сделать 10 мкл аликвотов. Храните их при температуре 4 °C.
  3. К новой, закрытой, 500 mL бутылке ДМЕ/F12 с глутамином, добавьте B27 (10 мл), n (5 мл) и пенициллин-стрептомицин (5 мл). Поместите 50 mL этой нейронной стволовой клетки (СНБ) в коническую трубку и добавьте 10 мкл 10 мкг/мкл (окончательный 2 мкг/мл) bFGF. Храните НСК (+) bFGF СМИ при температуре 4 °C.
  4. Чтобы сделать (-) bFGF СМИ, использовать тот же рецепт, как описано в шаге 1,3, но не добавлять bFGF. Эти средства массовой информации будут использоваться для дифференциации ССК нейронов и поддерживать нейрональных культур после дифференциации.

2. ленто вирусные конструкции

Примечание: Перед началом работы с лентовирусными конструкциями убедитесь, что Лаборатория была одобрена для использования агентами уровня биобезопасности-2 (BSL-2). Кроме того, при работе с ленто-вирусными векторами необходимо использовать культурные вытяжки BSL-2, средства индивидуальной защиты (СИЗ) и методы утилизации.

  1. Получить Тау-конструкции упакованы в ленто вирус из предпочтительного источника (см. Сандерс и др.10 для построения информации).

3. культивание нервных стволовых клеток человека

Примечание: НСКС, как правило, посеяны на 100000-150 000 клеток/см2 и наиболее коммерчески доступных НКО продаются как 1 х 106 клеток/флакон. Этот протокол был оптимизирован для 10 см клеточных блюд культуры (хотя другие размеры блюд могут быть использованы); Поэтому, если используются коммерчески доступные НСКС, то, возможно, потребуется расширить НСКС, сначала культивируя в шести-хорошо блюда, с тем чтобы привести в достаточном количество клеток семян 10 см блюд. Этот протокол может альтернативно быть адаптирован для различных размеров тарелки клеточной культуры (но он не содержит инструкций для проходных НПВ, как эти протоколы доступны в других местах11,12).

  1. Для подготовки пластин культуры клетки, извлекайте одно Алиготе замороженного покрытия мембраны матрицы подвала для плит культуры клетки и дайте ему оттепель на 4 °c (aliquототы можно поместить на 4 °c за ночь день прежде чем клетки должны быть посеяны). Добавить 385 мкл из подвала мембраны матричных покрытий до 5 мл ДМЕМ/F12 Media + пенициллин-стрептомицин.
    Примечание:     5 мл ДМЭМ/F12 Media + пенициллин-стрептомицин достаточно, чтобы покрыть одно блюдо 10 см (1 мл этого фундамента матричных покрытий для покрытия мембраны достаточно, чтобы покрыть один колодец 6-хорошо блюдо). В качестве альтернативы, если клетки должны быть фиксированными и иммуноокрашенных, или окрашенных для тиофлавина, культурные клетки на стекле покрытие в 24-хорошо культуры блюд.
    1. Храните средства массовой информации и матрицы покрытия холодной до и при добавлении их к культуре блюд. Добавьте матричные покрытия мембраны фундамента в блюда культуры и поместите посуду в инкубатор (при температуре 37 ° c) на 1 ч. Для оптимального покрытия, не инкубации матрицы фундамента мембраны для более или менее 1 ч. После 1 ч, аспирин оболочки фундамента Мембранные покрытия из клеточных культур блюд. Убедитесь, что это совпадает с NSCs быть готовым к покрытием.
      Примечание: Если клетки не оттаяли от замороженных запасов, пропустите шаг 3,2 и продолжайте шаг 3,3.
  2. Если клетки растаяли от замороженных запасов НСК, возьмите флакон замороженных клеток и нагревать его в водяной бане, нагретой до 37 ° c, перемещая флакон взад и вперед по воде. После оттаивания, спрей флакон с 70% этанола и поместить его в капот культуры клеток. Перенесите клетки в ~ 10 мл ДМЕ/F12 + пенициллин-стрептомицин СМИ и центрифугу трубки при комнатной температуре в 1 000 x g в течение 5 мин. аспирин средств массовой информации и ресуспензируем клетки в НСК СМИ.
  3. Разбавить клетки в НСК СМИ, чтобы получить соответствующую плотность посева для сосуда культуры ячейки, которая используется.
    Примечание: Например, если НКС в настоящее время покрытием на шесть-хорошо пластины-один и на шесть-ну культуры блюдо имеет площадь поверхности 9 см2-от 900 000 до 1 350 000 клеток, необходимых для семян. Таким образом, один флакон, содержащий 1 000 000 клетки могут быть ресуспендирован в 2 мл средств массовой информации и добавил к одному хорошо из шести-хорошо блюдо.
  4. Добавить достаточное количество клеток приостановлено в НСК СМИ семян подвале мембраны матричные покрытием культуры блюда (100 000 клеток/см2) и изменения в средствах массовой информации через день (при использовании замороженных запасов, изменение средств массовой информации на следующий день после обшивки и через день после этого). Вырастить клетки, пока они не 75%-80% свободно.
    Примечание: Клетки, скорее всего, достигнет 75%-80% слияния вскоре после обшивки, но это может занять больше времени, если замороженные запасы используются.
  5. После того, как НПЦ 75%-80% свободно, начать нейрональных дифференциации путем удаления НСК (+) bFGF СМИ и заменив его НСК (-) bFGF СМИ. Культура клетки в этом медиа (замена средств массовой информации через день), по крайней мере 4 недели.
    Примечание: Клетки будут продолжать делиться в течение нескольких дней после вывода bFGF; Таким образом, клетки могут достигать 90 – 100% слияния. После культивирования в течение 4 недель, клетки будут достигнуты нейронов судьбы и будут готовы для лечения леновирус.

4. преобразование и поддержание нейрональных культур

  1. Чтобы преобразовать нейроны с лентивирусом, используйте титр Кол-во 3,4 х 105 приводных единиц/ячейки (a 100% свободно 10 см блюдо будет содержать ~ 10 000 000 нейронов). Разбавить приводимые блоки к необходимой концентрации в средствах культуры клетки и добавить их к клеткам (используйте нормальный том средств для тарелки культуры клетки). Через два дня после добавления ленто вирус, мыть клетки 1x со свежими (-) bFGF СМИ (без леновируса) и продолжать культивирования в (-) bFGF СМИ, как обычно.
  2. Для лечения после ленто-вируса, кормить преобразователи нейронов путем изменения клеточной культуры СМИ ([-] bFGF СМИ) каждый день. Поддержание клеток в течение ~ 8 недель после его окончания. Регулярно Визуализируйте клетки под легким микроскопом для того чтобы обеспечить жизнеспособность.
    Примечание: Неточность или дендритные разрывы являются признаками того, что клетки больше не жизнеспособны.

5. Визуализация клеток

  1. Живая-клеточная визуализация
    1. После переливания (через 4 дня после добавления леновируса), соблюдайте сигналы YFP под флуоресцентным микроскопом, способным к визуализации живой клетки. Примите тарелки культуры клетки из инкубатора и убеждайтесь что скважины культуры остают стерильными путем держать крышку на верхней части тарелок культуры. Визуализируйте клетки используя 10x цель с длиной волны возбуждения ~ 514 Нм и фильтр излучения ~ 527 Нм.
      Примечание: Агрегаты обычно видны в преобразователей клеточных культур через 6 – 8 дней после применения ленто-вируса.
  2. Окрашивание фиксированной ячейки (маркировка b-тубулин III и окрашивание тиофлавина)
    1. Чтобы зафиксировать клетки в параформальдегиде (дфа), удалите средства массовой информации из трансдуксных нейронов, выращенных на стеклянных покрылистах. Промыть клетки 1x с PBS, удалить мыть, и добавить 300-500 мкл (при использовании 24-хорошо пластин) 4%-фа (разбавленный в PBS) на комбинезон для 20 мин при комнатной температуре. Снимите и промойте комбинезон 2x с PBS.
    2. Подготовьте блокирующее решение, состоящее из PBS, 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,3% Тритона X-100. Добавьте 300 – 500 мкл раствора к скважинами и Инкубируйте покрылисты для 2 ч при температуре 4 °C. После 2 ч, разбавленных первичных антител (при концентрации антител 1:500) в блокировании раствора и добавить 300-500 мкл первичного антитела решение для каждого хорошо. Поместите пластинку на качающуюся или поворотную платформу (на малой скорости) на ночь при температуре 4 °C.
    3. На следующий день удалите первичное антитело и вымойте комбинезон 3x для 5 минут каждый с PBS. Развести вторичные антитела в блокирующее буферное решение (при концентрации 1:1000) и добавить вторичное решение антитела к каждому хорошо. Выберите соответствующее вторичное антитело с помощью флуоресцентной метки, которая не пересекается с сигналом YFP (например, CY-3). Инкубировать клетки при комнатной температуре для 2 ч на качания или вращающейся платформе. После 2 ч, удалить вторичное решение антитела и мыть комбинезон 3x для 10 мин каждый с PBS.
    4. Вымойте комбинезон в двойной обоженной воде (DDW) в течение 10 мин. Удалите DDW и добавьте 300 мкл/колодец 0,015% Тиофлавин-с разбавляют 50% этанола в течение 10 мин. Удалите раствор Тиофлавин и промойте комбинезон 2x для 4 мин каждый с 50% этанола, а затем один 4 мин промыть 30% этанола и 2 моет в течение 5 минут каждый с 30% этанола. Вымойте комбинезон 1x с DDW до монтажа.
      Примечание: Тиофлавин, описанная в шаге 5.2.4, необязателен.
    5. Чтобы смонтировать комбинезон на стеклянные горки, поместите одну каплю монтажных носителей на сторону стеклянной горки "+". Удалите всю жидкость из колодца, содержащего стеклянный комбинезон, и, используя тонкие щипцы, аккуратно удалите маскированное стекло, проследя, какая сторона имеет культивируемые клетки.
    6. Аккуратно нажмите на край комбинезона против Кимпротрите, чтобы удалить излишки влаги. Тем не менее захвата комбинезон с тонкой щипцы, прикоснуться к краю (с клеточной стороной, обращ, к падению монтажа средств массовой информации) из покрывало для монтажа средств массовой информации, а затем аккуратно поместите покрывало на монтажных средств массовой информации (размещение культивируемых клеток в монтаж средства массовой информации и сэндвич их между комбинезон и стеклянная горка). Позвольте монтажных носителей затвердевать в течение 30 минут до визуализации. Слайды могут храниться при температуре-20 ° c для использования в будущем.
    7. Изображение клетки с помощью флуоресцентного микроскопа и соответствующие возбуждения/излучения спектры (YFP = ~ 514/527 Нм, CY-3 = ~ 555/568 Нм, и Тиофлавин S = ~ 390/426 Нм).

6. Факультативные методы

  1. Каждые 2 дня собирайте условные носители из культур и храните их при температуре-20 ° с для будущих анализов видов Тау, выпущенных культурами.

Результаты

Тау-РДМ-ИФФ-трансдукдированные нейроны были маркированные с помощью YFP, а РДМ-трансдукдированные культуры отображены агрегатами после транспроизводство. Эти включения окрашиваются в положительную для тиофлавина (рис. 1). Как показано на рисунке 1 , этот п...

Обсуждение

Этот протокол описывает поколение в пробирке модель человеческой тауопатии, что экспонаты серебра-пятно-позитивные агрегаты и Тиофлавин-положительных нейрофибриллярных связок (Нфтс). Кроме того, трансдукты клеток отображения Тау-индуцированных патологий, таких как морфологические д...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить д-р Питер Дэвис в Альберт Эйнштейн колледж медицины для поставки PHF-1 и CP13 антител и д-р Марк Diamond в Техасском университете, Юго-Западный, за предоставление Тау конструкций. Эта работа была поддержана гранты Ассоциации Альцгеймера (НИРГ-14-322164) в С.Х.И. и из Калифорнийского института регенеративной медицины (TB1-01193) для PR

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm culture dishesThermofisher12556002
15 mL tubesBiopioneerCNT-15
16% paraformaldehydeThermofisher50-980-487
24 well culture platesThermofisher930186
50 mL tubesBiopioneerCNT-50
70% ethanol in spray bottleVarious sourcesNA
B27 supplementThermofisher17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)Corning356231
Basic FGFBiopioneerHRP-0011
Bovine serum albuminSigmaA7906
Cell culture incubatorVarious sourcesNA
CentrifugeVarious sourcesNA
DMEM-F12 culture media with glutamineThermofisher10565042
Ethanol (50% concentration or higher)Various sourcesNA
Flourescently labeled secondary antibodiesVarious Sources, experiment dependentNA
Fluorescent microscopeVarious sourcesNA
Glass coverslipsThermofisher1254581
Glass slidesThermofisher12-550-15
Human neural stem cellsVarious sourcesNA
Lentiviral vectorsVarious sourcescustom order
Mounting mediaThermofisherP36934
N2 supplementThermofisher17502048
Penicillin-StreptomycinThermofisher15140122
Phosphate buffered salineThermofisher14190250
Primary antibodiesVarious Sources, experiment dependentNA
Rocking or rotating platformVarious sourcesNA
Sterile cell culture hoodVarious sourcesNA
Thioflavin SSigmaT1892-25G
Triton X-100ThermofisherBP151-100
Water bathVarious sourcesNA

Ссылки

  1. Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
  2. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  3. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
  4. Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
  5. Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
  6. DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
  7. Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).
  8. Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
  9. Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
  10. Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
  11. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
  12. Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
  13. Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).
  14. Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены