CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Резюме

Представлен протокол для эффективного РЕДАКТИРОВАНИя биогенов CRISPR/Cas9 рибонуклеопротеинов в клетках млекопитающих с помощью трубной электропорации.

Аннотация

Nucleases редактирования генов, представленный CRISPR-ассоциированных белков 9 (Cas9), становятся основными инструментами в биомедицинских исследованиях. Успешная доставка элементов CRISPR/Cas9 в целевые клетки путем трансфекции является необходимым условием для эффективного редактирования генов. Этот протокол демонстрирует, что трубная электропорация (Т) машинно-опосредованные поставки CRISPR/Cas9 рибонуклеопротеин (RNP), наряду с одноцепочечной олигодеоксинуклид (ssODN) донорские шаблоны для различных типов млекопитающих клеток, приводит к надежной точные события редактирования генов. Во-первых, TE был применен для доставки CRISPR/Cas9 RNP и ssODNs, чтобы вызвать болезнетворные мутации в интерлейкине 2 рецепторов субъединицы гамма (IL2RG) гена и сепиаптерина редуктазы (SPR) ген в клетках кролика фибробластов. Точные показатели мутации 3,57%-20% были достигнуты в результате секвенирования клонирования т.д. Та же стратегия была затем использована в человеческих iPSCs на нескольких клинически значимых генов, включая рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), миозин связывающий белок C, сердечный (Mybpc3), и гемоглобин субъединик бета (HBB). Последовательно были достигнуты высокоточные показатели мутаций (11,65%-37,92%) как определяется глубоким секвенированием (DeepSeq). Нынешняя работа показывает, что трубная электропорация CRISPR/Cas9 RNP представляет собой эффективный протокол трансфекции для редактирования генов в клетках млекопитающих.

Введение

CRISPR/Cas9 является наиболее часто используемым программируемым нуклеазадляи для редактирования генов. Он работает через одно руководство РНК (sgRNA)-опосредованное распознавание как целевых последовательностей, так и смежных протосказеров, прилегающих мотив (PAM) последовательности в геноме. Nuclease Cas9 генерирует двухцепочечный разрыв ДНК (DSB), расположенный три нуклеотидов вверх по течению последовательности PAM^1. DSBs восстанавливаются либо через подверженные ошибкам не-гомомогагный конец присоединения (NHEJ) или гомологии направлены ремонт (HDR) пути. Для достижения точного редактирования генов через hDR путь, донорские шаблоны часто предоставляются в формате плазмид ДНК (pDNA) или одноцепочечной олигодеоксинуклеотида (ssODN).

CRISPR/Cas9 и sgRNA могут быть доставлены в клетки в трех форматах: рибонуклеопротеин (РНП) комплекс белка Cas9 и gRNA^2,3; Cas9 мРНК и sgRNA^4,5; или плазмидднкой ДНК (pDNA), которая содержит необходимые промоутеры, приводомsgRNA, и Cas9 кодирования области 6,^7,8. Многие группы продемонстрировали, что, когда CRISPR/Cas9 поставляется как RNP, эффективность редактирования генов часто превосходит те, которые достигнуты в форматах pDNA или mRNA, что объясняется гораздо меньшим размером RNP по сравнению с нуклеидными кислотами⁹. Кроме того, ранее было показано, что новая трубка электропорации (TE) машина особенно эффективна в применении редактирования генов в нескольких типах клеток⁹.

Представленный в настоящей работе пошаговой протокол в использовании TE для доставки CRISPR/Cas9 RNP к клеткам млекопитающих различных видов в нескольких клинически значимых локусов. Этот новый метод трансфекции TE и высокое явление скорости HDR могут найти широкое применение в биомедицинских исследованиях.

протокол

Все процедуры содержания, ухода и использования животных были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Мичиганского университета.

1. Подготовка клеток

1. Приобретение iPSCs человека (ACS-1030) из Американской коллекции культуры типов (ATCC). Культура iPScs на искусственной внеклеточной матрицы с фидер-свободной средой культуры клетки (см. Таблица материалов) в инкубаторе культуры клетки (5% CO₂ на 37 c) следуя инструкциям поставщика.
   1. 2 ч до трансфекции, лечить iPSCs с 10 мкм Rho-ассоциированных, свернутая катушка, содержащая белок киназы (ROCK) ингибитор Y27632 (использование которого уменьшает апоптоз диссоциированных человеческих hiPSCs и увеличивает выживание и эффективность клонирования hiPSCs без влияющих на их плюрипотентность).
   2. При трансфектировании отлините iPSCs с решением отслоения клеток (см. ТаблицаМатериалов) на одиночные ячейки при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Подсчитайте номер ячейки.
2. Установить культуры клеток кролика фибробластов, используя первичную культуру биопсии кожи кожи уха кролика, как ранее описано¹⁰.
   1. Биопсия кожи уха 0,5 см получена из кончика уха кролика. Сбрить волосы с ушной ткани.
   2. Промыть 2x с фосфат-буферным сольником Dulbecco (DPBS) с 5% пенициллина-стрептомицина. Перенесите ушную ткань на новую тарелку культуры тканей 6 см, затем разрежьте ткань на мелкие кусочки (1,0 мм х 1,0 мм). Добавьте несколько капель сыворотки крупного рогатого скота, чтобы предотвратить высыхание тканей.
   3. Распространение измельченных тканей на 10 см ткани культуры блюдо, а затем добавить 10 мл культуры среды. Клетки кролика фибробласткультируются в модифицированном орле Dulbecco (DMEM) с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода. Положите блюдо культуры ткани в инкубатор культуры клетки (5% CO₂ при 37 градусах Цельсия).
   4. Через три-пять дней после покрытия, используйте трипсин-EDTA, чтобы переварить клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 2 мин. Подсчитайте номер ячейки.

2. Проектирование и синтез ГРНК и донора Олигоса

1. Для каждого гена, дизайн руководство РНК на основе последовательности целевых локус с помощью онлайн-инструмента (например, lt;http://crispor.tefor.net / ).
2. Вставить в последовательности ДНК интерес.
3. Выберите геном и мотив, прилегающий к протоскандру (PAM). Возможные последовательности направляющих ввода ДНК будут отображаться на странице вывода. Рекомендуется выбирать gRNA с более высокой прогнозируемой эффективностью и более низкими внецелевыми потенциалами.
4. Синтезировать ДНК коммерческим поставщиком для расшифровки гРНК. Выполняйте экстракорпоранцию гРНК с помощью набора синтеза гРНК в соответствии с инструкциями производителя.
5. Очистите gRNA с помощью микроколонки очистки РНК, включенной в набор синтеза gRNA. Измерьте концентрацию, затем храните гРНК при -80 градусов по Цельсию.
6. Разработай шаблон донора ssODN для каждого сайта мутации. SsODNs могут быть синтезированы коммерческими поставщиками, такими как IDT. В целом, каждый ssODN имеет длину 120-160 нуклеотидов (нт), состоящий из 60-80 nt в левой руке гомологии и 60-80 nt в правой руке гомологии. Для предотвращения повторного сокращения отредактированной ДНК, молчание мутации в PAM должны быть введены в ssODN, когда это возможно. Участок разреза CRISPR должен быть максимально приближен к намеченным геномным изменениям.

3. Электропорация труб Кас9 РНП и ssODNs

1. Подготовьте клетки, как описано в разделе 1.
2. Повторное удаление 2-3 х 10⁵ ячеек в 20 йл буфера электропорации. Пипетка вверх и вниз тщательно производить одноклеточной подвески.
3. Для трансфекции Cas9 RNP, премикс 2 мкг белка Cas9-NLS с 0,67 мкг гРНК при комнатной температуре (RT) в течение 10-15 мин. Затем аккуратно смешайте сформированный комплекс RNP вместе с 2 мкг ssodN с клетками.
4. Перенесите клеточную смесь в электропорную трубку 20 Л, используя универсальные наконечники подтянутых пипетки, предоставляемые комплектом электропорации трубки. Чтобы добиться лучшей электропорации, старайтесь избегать образования пузырьков воздуха во время передачи.
5. Поместите электропорационную трубку в слот электропорера и нажмите "Go", чтобы закончить. Следуйте предложенным производителем параметрам для каждого типа ячейки. Например, для клеток iPSCs и кролика фибробластных, набор напряжения составляет 420 В, а время пульса 30 мс. Успешный цикл электропорации указывается пульсовым отчетом на экране дисплея электропоратора.
6. После электропорации, передача человеческих клеток iPS до 1 мл предварительно разогретого Y-27632-содержащей культуры среды, описанной в части клеточной культуры. Для клеток кролика фибробласт, передать их dMEM с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки.
7. Плита resuspended клетки к одному наилучшим образом плиты культуры клетки 12 наилучшим образом.
8. Меняйте среду культуры каждый день. Y-27632 удаляется из культуры iPSC среды 24 ч после электропора.

4. Анализ событий редактирования генов

1. Урожайные клетки 72 ч после электропорации. Дайджест клетки из культуры пластины с помощью трипсина-EDTA для клеток кролика фибробластов или решения отслоения клеток для человека iPSCs. После центрифуги, resuspend клетки с 350 мл буфера лисиса (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 М EDTA; pH 8.0, 10% SDS, добавить 20 л 20 мг/мл протеиназа K запас на 1 мл буфера лисиса), затем инкубат при 55 градусов по Цельсию в одночасье.
2. Извлеките геномную ДНК с помощью фенол-хлороформа с помощью стандартных процедур.
3. Усиль 100-200 bp фрагментов ДНК, содержащих целевые области с помощью высокой точности ДНК полимераза, а затем очистить фрагменты ДНК от гелей с помощью комплекта извлечения геля или непосредственно из продуктов ПЦР с помощью PCR SV мини-комплект.
4. Чтобы определить эффективность редактирования генов путем секвенирования бактериальной колонии, привязка очищенных продуктов ПЦР в вектор pCR4-TOPO с помощью комплекта клонирования TOPO TA. Случайно подобрать бактериальных клонов, а затем последовательность вставки с помощью универсального последовательности грунтовки, предоставляемые TOPO TA клонирования комплекта.
5. Чтобы определить эффективность редактирования генов путем глубокого секвенирования, отправьте очищенные продукты ПЦР (100-200 вр) со ступени 4.3 для секвенирования amplicon CRISPR в ядре секвенирования ДНК.

Результаты

TE Cas9 RNP и ssODNs к клеткам кролика фибробласта

Общий процесс TE-опосредощенной доставки Cas9 RNP клеткам млекопитающих иллюстрируется на рисунке 1. Во-первых, мутации C231Y и Q235X были произведены в гене IL2RG, а мутация R150G была произведена в гене SPR в клетках кролика фибробласта. Потеря функций мутаций в генах IL2RG и SPR, как известно, вызывают первичный иммунодефицит¹¹ и двигательный и когнитивный дефицит^12,соответственно.

Конкретные конструкции sgRNA иллюстрируются на рисунке 2A. Праймеры, используемые для усиления целевых регионов, перечислены в таблице 3. Последовательности ssODNs отображаются в таблице 1. Скорость редактирования генов определялась бактериальным клонированием TA(рисунок 2B). На IL2RG C231 локус, из 28 клонов, которые были секвенированы, один (3.57%) осуществляется точная мутация C231Y, четыре (14.28%) переносимые вставки или удаления (индель) мутации, а остальные 23 (82%) были дикого типа. На IL2RG No235 локус, из 27 клонов, которые были секвенированы, два (7,41%) перенесены точные мутации 235X, три перенесенные индельные мутации (11,11%) а остальные были дикого типа. В SPG R150 локус, из 20 клонов секвенированных, пять (25%) осуществляется точная мутация R150G, 10 (50%) переносимые индельные мутации, а остальные были дикого типа.

TE Cas9 RNP и ssODNs для человека iPSCs

Затем TE использовался для доставки Cas9 RNP и ssODNs для iPSC человека и целевого клинического заболевания локусов в генах EGFR, Mybpc3 и HBB. Точечные мутации в проксимальном регионе EGFR T790 дают устойчивость ингибиторам тирозина киназы EGFR у пациентов с немелкоклеточным раком легких (NSCLC), укрывающими активирующие мутации EGFR^13. Мутация кадрового смещения в экзоне 16 в Mybpc3 замешана в гипертрофической кардиомиопатии¹⁴. Мутация точки E6V в гене HBB приводит к серповидно-клеточному заболеванию^15.

Конкретные конструкции sgRNA иллюстрируются на рисунке 3A. Праймеры, используемые для усиления целевых регионов, перечислены в таблице 3. Последовательности ssODNs отображаются в таблице 1. Скорость редактирования генов была определена DeepSeq(рисунок 3B). На локусе EGFR, 15.68% из alleles снесли точные перегласы точки перегласовки (6.315 считываний), 22.75% снесено indel перегласывание (9.162 считываемых), и остальные 61.57% были одичал-типом (24.797 читает). На Локус Mybpc3, 37,92% осуществляется точное удаление 4 bp TGAA (11,654 читает), 2,24% осуществляется indel мутаций (410 считываний), а остальные 59,84% были дикого типа (18,692 читает). На HBB локус, 11,65% осуществляется точная мутация E6V (6,565 читает), 23,35% осуществляется indel мутаций (13163 читает), а остальные 65% были дикого типа (36,644 читает).

Рисунок 1: Диаграмма потока электропорации трубки Cas9 RNP.

Рисунок 2 : Редактирование генов клеток кролика фибробластов. (A) Иллюстрация целевых последовательностей. Коробки указывают на целевые локусов. Подчеркнутые буквы соответствуют последовательностям гРНК. Красные буквы указывают на последовательности PAM. (B) TA результаты клонирования событий редактирования генов. Коробки указывают точно мутить локусы. Показанная последовательность Indel является лишь репрезентативной для одного типа аллеля. Другие последовательности indel не отображаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 : Редактирование генов iPSCs человека. (A) Иллюстрация целевых последовательностей. Коробки указывают на целевые локусов. Подчеркнутые буквы соответствуют последовательности gRNA. Красные буквы указывают на последовательности PAM. (B) Deepseq результаты событий редактирования генов. Коробки указывают точно мутить локусы. Красные буквы указывают на молчаливые мутации, которые были введены в шаблоны доноров. Показанная последовательность Indel является лишь репрезентативной для одного типа аллеля. Другие последовательности indel не отображаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Локус	Последовательность олиго
(целенаправленная мутация)
Кролик IL2RG (C231Y)	АГГГГГТГГАТГГГГГАГАААКТКАТТАКТАКТККТКТККККККККККККТГТТТТТТТТТАТТАЧГГТГКККККАТТГГАГГАГГАТГГАГТ ГААТГАГКККЦКАККАЦКАКТГГГГАГАААААТТААААТТАААААААААААААТГККККККККККТ
Кролик IL2RG (235X)	АГГГГГТГГАТГГГГГАГАААКТКАТТАКТАКТККТКТККККККККККТГТТТТТТТТТАТТАКККТТГГГГГГТГГТГГТТАГТТАГТТАГТГАТТГГГТГАТ ГААТГАГКККЦКАККАЦКАКТГГГГАГАААААТТААААТТАААААААААААААТГККККККККККТ
Кролик SPR	gacctccatgcctgcgctgctgaagaggcgtttcctgcgcgcgcgcgcgcactgttgacatcgcgggactggtgaacatcgtctctgtgcctgctcaaggg cgctgtac
(R150G)
Человек EGFR	ACGTGATGGCGCGCGTGGGGGGGGGGGGGGGGGG АГКТКАТГКТЦКТЦККТКТКТКТККТГКТГГТГКТКТКТККТККТАТТАСТАТТАСТГГГАЗААГАГАААЦААААААААААТАТТТГКККЦАГАГТАКТАК
(Точка мутаций, примыкательных к T790)
Человек Mybpc3	GCCCCCTGTGTCATCATCACGCGCCCCTGGAGGACCAGCTGGGGGTGATGGGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGG GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTCCAGAAGCACGGGGGTGTGTGGGGGGGCAT
(удаление 4 bp)
HBB человека	TCTGACACAACTGTGTGTGTКАКАКТАККТЧАКТКАААКАКАКАКАКАКАЧКГГГГГГКККККККККТГГАГАААГГГКГККТГГААГГТАКТГККК CTGTGGCAAGGTGAACGTGGGAAGTGTGGGGGGGGGGGGGGGG
(E6V)

Таблица 1: Последовательности ssODNs.

Шаг	Проблема	Возможные причины	Решения
2.1	Низкий уровень indel	Плохое руководство РНК дизайн, Руководство РНК запасов	Редизайн руководство РНК, производить / заказать новый путеводитель РНК.
2,3	Низкая эффективность PGE	плохой дизайн ДНК донора, низкоэффективная НАправляющая РНК, неправильное количество донорской ДНК или низкое качество ДНК	Увеличьте длину рук гомологии, введите мутации PAM, внедрите молчаливые мутации в ДНК донора, используйте более эффективное руководство РНК, Оптимизируйте соотношение белка Cas9 над направляющей РНК.
3.4	Неудачная трансфекция	Воздушные пузыри, образующиеся при переносе клеток-буферной смеси в электропорную трубку, неправильное напряжение/длительность настройки	Старайтесь избегать образования пузырьков воздуха, отрегулируйте настройки напряжения/продолжительности.
3.6	низкоклеточная жизнеспособность после электропорации	Низкая выживаемость одного человека ipsc	Добавить ингибитор ROCK после электропорации, увеличить количество клеток.
4.1	Неудачный ПЦР	Высокое содержание GC, или повторяющаяся последовательность	Оптимизируйте состояние ПЦР, добавьте DMSO в систему ПЦР.

Таблица 2: Руководство по устранению неполадок для частых проблем.

Имя праймер	Последовательности	Примечание
RB-IL2RG-F	КАТГАКАГТГАГГГГТКТК	Для усиления фрагмента ДНК кролика IL2RG
Rb-IL2RG-R	TGCCAGAGACACAAGCGAAC
РБ-СПР-Ф	ГТАКТГГАГАГАГАГАГАГАГГИГГИГГИГГГ	Для усиления фрагмента ДНК кролика SPR
RB-SPR-R	КТКАКАККККККККГГГГГГгГ
H-EGFR-F	ТГАГГККГГГГГАКААКАКАК	Для усиления фрагмента ДНК ЧЕЛОВЕКА EGFR
H-EGFR-R	ACCAGTTGAGCAGGTACTGGGGG
H-Mybpc3-F	ATGCCCCGTTCTGGAAC	Для усиления человеческого фрагмента ДНК Mybpc3
H-Mybpc3-R	ТКАГгГАГАГаККККККККККККАТ
H-HBB-F	ТААККТГАТАКСККК	Для усиления фрагмента ДНК HBB человека
H-HBB-R	CATTTGCTCTGAКАКААКТ

Таблица 3: Праймеры используются в шаге 4.3.

Обсуждение

Метод электропорации трубки был эффективен в доставке CRISPR/Cas9 RNP и ssODNs к клеткам кролика и человека, что привело к надежному точному редактированию генов (PGE). Основное различие между TE и другими обычными устройствами электропорации является использование трубки, в которой два электрода находятся на верхней и нижней части трубки и образец загружается в полном объеме, а затем запечатывается на электропорации (Рисунок 1). В отличие от этого, в обычном кювете, электроды находятся по бокам и образец не полностью герметичен во время электропорации. Эта новая конструкция уменьшает генерацию воздушного пузыря и сжимает размер воздушного пузыря, что, следовательно, улучшает равномерноераспределение электрического напряжения, и в результате приводит к снижению клеточной смертности и высокой эффективности трансфекции 9. В настоящее время высокие показатели ПГЭ (15%-37%) были достигнуты ориентации EGFR, Mybpc3 и HBB генов в человеческих iPSCs. Эти результаты согласуются с предыдущим докладом, в котором высокие показатели PGE были достигнуты в стволовых клетках человека⁹.

Болезнетворные мутации были нацелены на гены IL2RG и SPR в клетках кролика. Недавно, IL2RG-нокаут кроликов были произведены в качестве моделей для человека X-связанных тяжелой комбинированной иммунодефицита (SCID-X1)^16,17. Настоящая работа показывает, что мутации пациента IL2RG (например, C231Y и No235X) могут эффективно генерироваться в клетках кроликов, демонстрируя возможность создания моделей кроликов SCID-X1, несущих мутации пациентов. Было также продемонстрировано, что sPR R150G мутации могут быть эффективно созданы в клетках кролика. Эта мутация вызывает двигательные и когнитивные дефициты у детей¹². Эти модели IL2RG и SPR мутации кролика, как только генерируется, может служить ценными доклинических моделей для трансляционных исследований. Они также могут быть использованы для создания генного редактирования на основе терапии для этих моногенных заболеваний.

Одной из проблем для CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генов приложений является вне цели редактирования событий. Indel ставки были проанализированы на прогнозируемых верхней вне целевых сайтов для sgRNAs, используемых в этом исследовании (Таблица S1), используя методы, ранее описанные⁹. В общей сложности, семь потенциальных верхней вне цели локусов были проанализированы для sg-rb-IL2RG-01, пять для sg-rb-SPR, семь для sg-hEGFR, пять для sg-hMybpc3, и семь для sg-hHBB), используя праймеры, перечисленные в таблице S2. Нет вне цели indels были выявлены T7E1 анализы (Рисунок S1), что свидетельствует о минимальных вне целевых рисков для CRISPR / Cas9-опосредованного редактирования генов с помощью этих sgRNAs. Это также указывает на то, что метод электропорации трубки сам по себе не вызывает и не увеличивает внецелевое количество внетарных ввода. Тем не менее усилия должны быть направлены на сокращение или ликвидацию нежелательных внецелевых внеадресных внештатных внештатных внештатных внештатных внештатных внештатных внештатных внештатных в Секвенирование всего генома может быть необходимо, чтобы исключить такие события для клеток, которые предназначены для использования в клинических приложениях.

На техническом уровне, следующие считаются ключевыми факторами для достижения эффективного точного редактирования генома crispR/Cas9 RNP трубки электропорации. Во-первых, рекомендуется выбрать эффективную sgRNA с прогнозируемым низким внецелевого потенциала. Важно проверить эффективность indel выбранного sgRNA перед использованием его для приложений PEG. Это не редкость, что программное обеспечение предсказал хороший sgRNA не удается на этапе проверки.

Во-вторых, для достижения высокого PGE, рекомендуется, чтобы вызвать мутации PAM к донору ssODN, когда это возможно. Обоснование заключается в том, что таким образом, CRISPR/Cas9 повторно сокращается после интеграции шаблонов донора. В некоторых случаях, PGE сам вводит PAM мутации. В других случаях можно ввести молчаливые мутации в последовательность PAM. В случае, если мутация PAM невозможна, рекомендуется попытаться включить в донора несколько молчаливых мутаций, что соответствует последовательности sgRNA.

В-третьих, особенно актуально для Т., важно избегать образования пузырьков воздуха при передаче клеток и смеси РНП в электропорацию трубки. В то время как конструкция трубки TE уже сводит к минимуму образование пузырьков воздуха, тщательная обработка еще больше уменьшит и может даже полностью избежать образования пузырьков воздуха. Неполадка съемки руководство для частых проблем, которые могут возникнуть в применении трубки электропорации для CRISPR/Cas9 рибонуклеопротеин опосредоненный точное редактирование генов предоставляется в таблице 2.

В заключение здесь показано, что электропорация труб является эффективным средством доставки CRISPR/Cas9 RNP и ssODNs к клеткам млекопитающих для достижения высоких показателей ПГЭ. Этот новый метод трансфекции TE и его надежная точная скорость редактирования генов могут способствовать разработке приложений для редактирования генов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	STEMCELL Technologies	792	Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2.
Cas9 Nuclease 3NLS	IDT	1074182	Cas9 protein, first used in Step 3.3.
DMEM	Thermo Fisher	11965092	For cell culture, first used in Step 1.2.3.
DPBS	Thermo Fisher	1708075	For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.
EDTA	Lonza	51201	For making lysis buffer, first used in Step 4.1.
Electroporation buffer	Celetrix	13–0104	The electroporation buffer, first used in Step 3.2.
Electroporation tubes	Celetrix	20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104	The electroporation tube, first used in Step 3.4.
Electroporator	Celetrix	CTX-1500A LE	The tube electroporation machine, first used in Step 3.5
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	12003C	For cell culture, first used in Step 1.2.2.
Forma CO2 Incubators	Thermo Fisher	Model 370	For cell culture, first used in Step 1.1.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28115	For gel purification, first used in Step 4.3.
Human  induced pluripotent stem cells	American Type Culture Collection	ACS-1030	Human iPSCs, first used in Step 1.1.
Matrigel	Corning	354277	Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1.
mTeSR 1 medium	STEMCELL Technologies	85850	Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1.
PCR SV mini	GeneAll	103-102	For PCR product purification, first used in Step 4.3.
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163	For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.
Phenol-chloroform	Thermo Fisher	15593031	For DNA extraction, first used in Step 4.2.
Precision gRNA Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4.
Proteinase K Solution	Thermo Fisher	AM2548	For DNA extraction, first used in Step 4.1.
Q5 high-fidelity DNA polymerase	NEB	M0491	For PCR amplification, first used in Step 4.3.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771	For making lysis buffer, first used in Step 4.1.
TA Cloning Kit	Thermo Fisher	K457502	For TA clone sequencing, first used in Step 4.4.
Tissue Culture Dish (10 cm)	FALCON	353003	For cell culture, first used in Step 1.2.3.
Tissue Culture Dish (12 well)	FALCON	353043	For cell culture, first used in Step 3.7.
Tissue Culture Dish (6 cm)	FALCON	353004	For cell culture, first used in Step 1.2.2.
Tris HCl	Thermo Fisher	BP1757-500	For making lysis buffer, first used in Step 4.1.
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25200056	For cell digestion, first used in Step 1.2. 4.
Universal Fit Pipette Tips	Celetrix	14-0101	For electroporation, first used in Step 3.4.
Y27632	LC Labs	Y-5301	The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1.