JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью этого протокола является генотип морского анемоне Nematostella vectensis во время гастрирования без ущерба для эмбриона.

Аннотация

Описано здесь pcR основе протокола генотипа гастрола этап эмбриона anthozoan cnidarian Nematostella vectensis без ущерба для жизни животного. После экстракорпорального оплодотворения и де-желе, зиготы могут развиваться в течение 24 ч при комнатной температуре, чтобы достичь ранней до середины гастральной стадии. Эмбрионы гаструлы затем помещаются на гелевой ложе агарозы в чашке Петри, содержащей морскую воду. Под рассекающим микроскопом вольфрамовая игла используется для хирургического отделения фрагмента асоральной ткани от каждого эмбриона. Послеоперационные эмбрионы затем разрешается залечить и продолжить развитие. Геномная ДНК извлекается из изолированного фрагмента ткани и используется в качестве шаблона для локуса конкретных ПЦР. Генотип может быть определен на основе размера продуктов ПЦР или наличия/отсутствия специфических пЦР-продуктов. Послеоперационные эмбрионы затем сортируются по генотипу. Продолжительность всего процесса генотипирования зависит от количества эмбрионов, которые должны быть обследованы, но это минимально требует 4-5 ч. Этот метод может быть использован для выявления нокаут мутантов из генетически неоднородной популяции эмбрионов и позволяет анализировать фенотипы во время развития.

Введение

Книдарийцы представляют разнообразную группу животных, которые включают медуз, кораллов и морских анемонов. Это дипобласты, состоящие из эктодерма и эндодерма, которые разделены внеклеточной матрицей (мезоглией). Cnidaria является сестрой группы для speciose Bilateria, к которому традиционные модели животных, таких как Drosophila и Mus принадлежат1. Кроме того, Cnidaria-Bilateria расхождения, как полагают, имели место в докембрийский период2. Таким образом, сравнительные исследования книдарян и двулатерян имеют важное значение для получения понимания биологии их последнего общего предка. Недавно сравнительная геномика показала, что книдарианцы и двулатеры имеют много генов инструментария развития, таких как выемка и bHLH, подразумевая, что их общий предок уже имел эти гены3. Тем не менее, роль этих генов инструментария развития в последнем общем предке Cnidaria и Bilateria сравнительно менее хорошо понимается. Для решения этой проблемы, очень важно изучить, как эти глубоко сохраненные гены функционируют в книдарии.

Одной из новых книдарских генетических моделей является anthozoan Nematostella vectensis. Его геном был секвенирован3, и различные генетические инструменты, в том числе морфолино-опосредованный ген нокдаун, мегануклеазы опосредованного трансгенеза, и CRISPR-Cas9-опосредованные генные стукины и нокауты, теперь доступны для использования в этом животном. Кроме того, развитие Nematostella относительно хорошо понимается. Во время эмбриогенеза, гастрирование происходит путем инвагинации4, и эмбрион превращается в личинку планулы свободного плавания. Планула впоследствии превращается в полип с ессиальным полипом с ртом и околоустными щупальцами. Затем полип растет и достигает половой зрелости.

CRISPR-Cas9-опосредованный целевой мутагенез в настоящее время регулярно используется для изучения функции генов в Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Для генерации нокаут мутантов в Nematostella, коктейль, содержащий локус конкретных одного руководства РНК и эндонуклеазы Cas9 белка впервые вводится в неоплодотворенных или оплодотворенных яиц для производства F0 основателя животных, которые обычно показывают, мозаикизма. F0 животных впоследствии подняли до половой зрелости и пересеклись друг с другом, чтобы произвести F1 населения, подмножество которых может быть нокаут мутантов6. Кроме того, сексуально зрелые животные F0 могут быть скрещены с дикими животными типа для создания F1 гетерозиготных животных, и F1 гетерозиготы, которые несут нокаут аллель в локус интереса могут быть пересечены друг с другом для производства F2 потомство, одна четверть из которых, как ожидается, будет нокаут мутантов5. Оба подхода требуют метода выявления нокаут-мутантов из генетически неоднородной популяции. Полипщу можно использовать для извлечения геномной ДНКдля генотипирования 6,7. Однако в тех случаях, когда исследуется функция развития гена интереса и эмбрионы-мутанты не достигают стадии полипа (т.е. из-за личинок летальности, связанной с мутацией), мутации мутантов необходимо выявить на ранних стадиях онтогена. Описано здесь ПЦР-протокол генотипа отдельных животных на стадии гаструлы без ущерба для животного, который позволяет идентифицировать нокаутмутантов из генетически неоднородной популяции эмбрионов. Продолжительность всего процесса генотипирования зависит от количества эмбрионов, которые должны быть обследованы, но это минимально требует 4-5 ч.

протокол

1. Индукция нереста, экстракорпоральное оплодотворение и де-желе

  1. Поддерживать Nematostella vectensis в морской воде с соленостью 12 частей на тысячу (ppt) в темноте при 16 градусах Цельсия, кормя Артемию ежедневно.
  2. За день до индукции нереста поместите животных в температурно-легкий инкубатор. Программа инкубатора так, что животные подвергаются воздействию 8 ч света при 25 градусах Цельсия. Дополнительно: Накормить небольшой кусочек (1 мм3) устрицы для отдельных животных, прежде чем поместить их в инкубатор для повышения нереста.
  3. Оставьте животных в инкубаторе на 1 ч при 16 градусах Цельсия.
  4. Удалите животных из инкубатора и оставьте их на скамейке со светом при комнатной температуре (RT), чтобы нерест. Нерест обычно происходит в течение следующих 1,5-2 ч.
  5. Если самцы и женщины находятся в отдельных контейнерах, поместите пакеты яйцеклеток из женского контейнера в контейнер, содержащий сперму, с помощью передаваемых пипеток, кончик которой разрезается, чтобы увеличить отверстие так, чтобы яйца не повреждались механическим стрессом во время механического стресса Передачи. Разрешить яйца, которые будут оплодотворены, оставив их в мужской контейнер, по крайней мере 15 мин.
  6. Де-желе яйцо пакеты в морской воде, содержащей 3% цистеин (pH 7.4) на чашку Петри или в 15 мл трубки. Аккуратно агитировать на шейкере в течение 12 мин.
  7. Используйте пластиковый пипетка, чтобы разбить комки и продолжать агитировать еще 2-3 мин, пока полностью де-jellied.
  8. Удалите цистеин, заменив средства массовой информации пресной морской водой, по крайней мере 5x.
  9. Храните оплодотворенные яйца на стеклянной чашке Петри при 16 градусах цельсия или РТ.

2. Хирургическое удаление асоральной ткани из эмбриона гастрита

  1. Подготовьте буфер экстракции ДНК, состоящий из 10 мм Tris-HCl (pH 8), 50 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 и 1 мг/мл протеиназы K. Использование 20 мл буфера экстракции на эмбрион. Хорошо перемешать путем вихря и aliquot буфера в ПЦР труб.
  2. Растворите 1% агарозы в морской воде и вылейте ее в чашку Петри, чтобы покрыть дно. Охладить на скамейке, чтобы сделать гель кровать. Налейте пресную морскую воду, чтобы покрыть гель кровать в чашке Петри.
  3. Передача 24 ч после оплодотворения (hpf) эмбрионов (ранней до середины гастральной стадии) в чашку Петри, содержащую гелевой кроватьа агарозы.
  4. Вставьте вольфрамовую иглу в держатель иглы и стерилизовать путем погружения кончика иглы в спирт (70% или выше) и размещение его в огне, чтобы сжечь алкоголь.
  5. Под рассекающим микроскопом (при 20x до 40x увеличении) используйте вольфрамовую иглу, чтобы уберечься от агарозной кровати, удалив кусок поверхности агарозы размером с эмбрион, которым можно манипулировать, и поместите эмбрион на депрессию с ее боковой стороны лицом вниз для того, чтобы ограничить движение эмбриона для микрохирургии.
  6. Используйте вольфрамовую иглу, чтобы хирургическим путем вырезать кусок аборальной ткани, расположенный напротив устного бластопорального отверстия. Асоральный от одной трети до одной четверти эмбриональной ткани вдоль устно-асоральной оси, как правило, достаточно.
  7. Используйте пипетку P20 для переноса изолированной абораальной ткани (в йт;2 мл) в трубку ПЦР, содержащую 20 мл буфера экстракции ДНК.
  8. Перенесите послеоперационный эмбрион в колодец, содержащий не менее 500 мл пресной морской воды в 24- или 96-хорошо пластины.
  9. Повторите шаги 2.4-2.8 для количества эмбрионов по мере необходимости.
  10. Поместите хорошо пластины, содержащие послеоперационные эмбрионы в инкубаторе на 16 градусов по Цельсию или RT до генотипирования не будет завершена.

3. Геномная экстракция ДНК и генотипирование ПЦР

  1. Кратко вращайте пЦР-трубки, содержащие буфер экстракции ДНК и изолированные эмбриональные ткани с помощью мини-центрифуги (например, при 2680 х г на 10 с).
  2. Для извлечения геномной ДНК из отдельных эмбрионов, инкубировать ПЦР трубки при 55 кв. C в течение 3 ч. Вихрь в течение 30 с каждые 30 минут для обеспечения распада клеточных скоплений и повышения лизисклеток.
  3. Инкубировать пЦР трубки при 95 градусах по Цельсию в течение 5 мин для инактивации протеиназа K.
  4. Храните экстракты gDNA при 4 градусах Цельсия или на льду, и немедленно переходите к ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен оставить здесь, поместив экстракты gDNA в морозильную камеру -20 градусов.
  5. Настройка реакции ПЦР с использованием извлеченных gDNA в качестве шаблона для усиления геномного локуса интереса.
    1. Если различные аллели в локус интереса отличаются по размеру, так что разница в размерах может быть обнаружена электрофорус геля агарозы, дизайн одного набора грунтовки, чтобы усилить весь локус.
    2. Кроме того, используйте аллеле-специфические грунтовки, которые генерируют продукты ПЦР только при наличии конкретного аллеля; например, путем проектирования грунтовки, которая связывается с областью, содержащей мутации вставки/удаления.
    3. Используйте типичную реакционную смесь 20 мл ПЦР следующим образом: 5 мл экстрактов гДНК, 8 мл безнужной воды, 4 мл буфера ПЦР, 0,2 мл 10мМ dNTPs, 0,6 мл DMSO, 1 мл 10 мЛ вперед праймер, 1 мл 10 мл реверсивного грунта , и 0,2 мл полимеразы ДНК (см. Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько грунтовок могут быть использованы в реакции ПЦР. Например, один универсальный передний грунт и два аллеля конкретных обратных праймеров могут быть объединены, до тех пор, как два обратных праймера предназначены для создания пЦР продукты различных размеров, так что наличие / отсутствие двух аллелей может быть однозначно определяется гелевым электрофорезом (см. раздел репрезентативных результатов).
  6. Запуск электрофороз геля агарозы, чтобы определить размер и наличие / отсутствие продуктов ПЦР. Отрегулируйте состояние электрофорезаи геля агарозы (например, процент агарозного геля, V/cm, и продолжительность) в зависимости от ожидаемого размера продуктов ПЦР.
  7. Используйте результаты ПЦР относительно размера и наличия/отсутствия продуктов ПЦР, чтобы назначить генотип каждому послеоперационному эмбриону. Например, если ожидается, что различные аллели будут генерировать продукты ПЦР разных размеров, используйте информацию о размере для присвоения генотипа для каждого эмбриона. Если используются специальные аллелеры, данные о наличии/отсутствии продуктов ПЦР следует использовать для присвоения генотипа каждому эмбриону.
  8. Сортировать эмбрионы в соответствии с генотипом.

Результаты

Геном Nematostella имеет один локус, который кодирует белок-предшественник для нейропептида GLWamide. Три нокаутмутант аллеля на этом локусе(glw-a, glw-b,и glw-c) ранее сообщалось5. Четыре гетерозиготных самца, несущие аллель дикого типа (яп....

Обсуждение

Описан очерканный здесь протокол на основе ПЦР для генотипа одного морского эмбриона анемона без ущерба для животного. После нереста и де-желе, оплодотворенные яйца могут развиваться в gastrulae. Абраальная область каждого эмбриона гаструлы удаляется хирургическим путем, а изолированная ?...

Раскрытие информации

Автору нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим анонимных рецензентов за комментарии к более ранней версии рукописи, которая улучшила рукопись. Эта работа была поддержана за счет средств Университета Арканзаса.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Drosophila Peltier Refrigerated IncubatorShellabSRI6PFUsed for spawning induction
Instant ocean sea saltInstant ocean138510
Brine shrimp cystsAquatic Eco-Systems, Inc.BS90
L-Cysteine HydrochlorideSigma AldrichC7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500VWR89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0QUALITY BIOLOGICAL351-007-01
Potassium chlorideVWRBDH9258
EDTA, 0.5M pH8VWRBDH7830-1
Tween 20Sigma AldrichP9416
Nonidet-P40 SubstituteUS BiologicalN3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA gradeThermoFisher25530049
AgaroseVWR710
Micro Dissecting needle holderRobozRS-6060
Tungsten dissecting needleRobozRS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal CyclersEppendorfE6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseNew England BioLabsM0530L
dNTP mixNew England BioLabsN0447L
GLWamide universal forward primer5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’

Ссылки

  1. Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
  2. Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
  3. Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
  4. Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
  5. Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
  6. He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
  7. Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
  8. Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
  9. Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
  10. Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
  11. Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
  12. Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
  13. Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
  14. Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
  15. Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
  16. Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147CRISPRCnidariaNematostella

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены