JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол, чтобы вызвать тяжелые TBI с боковой жидкости ударных травмы (FPI) модель у взрослых, мужчин Wistar крыс. Мы также демонстрируем использование беспроводной телеметрической системы для сбора непрерывных записей видеоЭЭГ и мониторинга эпилептиформных разрядов, соответствующих посттравматическому эпилептогенезу.

Аннотация

Боковая жидкость ударных травм (FPI) модель хорошо известна и была использована для изучения TBI и посттравматической эпилепсии (PTE). Вместе с тем были зарегистрированы значительные различия в конкретных параметрах, используемых в различных исследованиях, которые использовали эту модель, что затрудняет согласование и интерпретацию результатов между лабораториями. Например, сообщалось о изменчивости в отношении размера и расположения краниэктомии, того, как находится концентратор замка Луер по отношению к краниэктомии, атмосферного давления, применяемого к дюре, и продолжительности пульса давления. Каждый из этих параметров может повлиять на тяжесть травмы, которая напрямую коррелирует с частотой ПТЭ. Это проявилось как широкий спектр показателей смертности, исправления рефлекторных времен и частоты судорожных изъятий сообщили. Здесь мы предоставляем подробный протокол для метода, который мы использовали, чтобы облегчить гармонизацию между исследованиями. Мы использовали FPI в сочетании с беспроводной системой телеметрии ЭЭГ для непрерывного мониторинга электрографических изменений и обнаружения активности захвата.  FPI индуцируется путем создания краниэктомии 5 мм над левым полушарием, между Брегмой и Ламбдой и прилегающей к боковому хребту. Концентратор замка Luer закреплен на черепе над краниэктомией. Этот концентратор подключен к устройству FPI, и 20-миллисекундный импульс давления доставляется непосредственно в нетронутую дюру через трубку давления, подключенную к концентратору через разъем замка поворота. После выздоровления крысы повторно анестезируются, чтобы удалить концентратор. Пять 0,5 мм, электродные винты ЭЭГ из нержавеющей стали находятся в контакте с дюной через череп и служат в качестве четырех записывающих электродов и одного эталонного электрода. Электродные провода собираются в пьедестал разъем, который закреплен на месте костным цементом. Непрерывные записи видео/ЭЭГ собираются на срок до 4 недель после TBI.

Введение

В докладе, представленном Конгрессу в 2015 году, Центры по контролю заболеваний сообщили, что около 2,5 миллиона человек в год страдают черепно-мозговой травмой (TBI) в США1. Подсчитано, что TBI вызывает 20% симптоматической эпилепсии и 5% всех эпилепсий2,3,4. Кроме того, около 20% пациентов СТоу развиться посттравматической эпилепсии5. Важно отметить, что хронические, периодические судороги, которые происходят в результате ТБИ часто фармакорезентных, увеличивая бремя болезни6. Точные механизмы, приведем к посттравматической эпилепсии (ПТЭ), остаются неясными. Тем не менее, несколько ключевых эпидемиологических исследований изучили заболеваемость и потенциальный риск развития посттравматической эпилепсии (ПТЭ)2,4,7,8,9 ,10,11. Эти эпидемиологические исследования, каждый усилил корреляцию тяжести травмы с риском эпилептогенеза.

Текущие методы, которые были широко использованы для выявления новых противоэпилептических методов лечения в значительной степени опирались на модели, которые используют химио-судорожные или электрические разжигания, чтобы вызвать эпилепсию12. Учитывая высокую частоту фармакорезистентности к препаратам, разработанным в этих моделях пациентами ТБИ, мы предполагаем, что индуцированные ТБИ изъятия могут отличаться от хемоконвульсантов или индуцированных изъятий и могут включать различные пути или процессы эпилептогенез. Таким образом, модель TBI может быть лучше подходит для разработки методов лечения, которые являются более эффективными для предотвращения посттравматического эпилептогенеза.

Модель тобья ударных (FPI) модель TBI была использована на декады и устоявшийся метод для того чтобы исследовать и TBI и PTE13,14,15,16,17, 18. Однако, как мы недавно рассмотрели, существует высокая степень изменчивости в методах FPI сообщили в лабораториях19,20. Такое отсутствие согласованности между лабораториями предотвращает воспроизводимость доклинических выводов и делает интерпретацию результатов сложной задачей. Как следствие, повышенный интерес и усилия были применены к установлению большей гармонизации для этих типов исследований21,22,23,24.

В целях дальнейшего повышения согласованности и согласования между лабораториями, ориентированными на изучение посттравматического эпилептогенеза, мы предоставляем здесь подробную методологию нашего подхода. Мы ранее сообщали 60% заболеваемости судорожными судорогами в течение шести недель после тяжелой TBI20. Теперь мы используем этот подход для мониторинга крыс, начиная день травмы и постоянно следовать за ними 24 часа в сутки в течение 4 недель. Мы решили использовать беспроводную телеметрию системы, которая дает несколько преимуществ. Во-первых, крысы могут свободно передвигаться по своей клетке, и таким образом снижает стресс. Во-вторых, снижение шума сигнала, как крыса служит в качестве земли. Кроме того, наша нынешняя система использует акселерометр, который обнаруживает быстрое движение во всех трех плоскостях (X, Y и No) и может быть полезным для выявления судорожных событий захвата. Наконец, система беспроводной телеметрии позволяет легче управления крыс, таких как дополнительные солены инъекции, взвешивания и проведения неврологических оценки тяжести, которая усложняется, когда крысы прикреплены к тросу. Однако этот подход также имеет ряд ограничений. Во-первых, начальная стоимость системы для записи до восьми крыс одновременно может быть в диапазоне $ 60000. Во-вторых, мощность ограничена источником батареи. Это требует ежедневного мониторинга и замены батарей. Время, необходимое между изменениями батареи, может зависеть от частоты выборки. Тем не менее, для 1000 Гц выборки, батареи, как правило, меняются один раз в неделю. Ограниченный источник питания также ограничивает систему записью только из четырех сигналов ЭЭГ. Наконец, выпадение сигнала ограничено, но иногда происходит. Однако такой подход обеспечивает последовательный и надежный метод мониторинга посттравматического эпилептогенеза и может помочь в выявлении новых терапевтических методов лечения.

протокол

Все процедуры были одобрены и следовали руководящим принципам Университета в Буффало институционального ухода за животными и использования комитета.

1. Травма жидкости ударных

  1. Носите лабораторное пальто или хирургическое платье, хирургическую маску, хирургические перчатки, а также головное покрытие и стерилизуем все инструменты и материалы, которые контактируют с хирургическим местом.
  2. Анестезия 10-12-недельный, мужчина, Wistar крысы (350-400 г) с 3% изофлуран и 1 л / мин кислорода в индукционной камере соответствующего размера для крыс. Удалить крысу из индукционной камеры и переместить его в области подготовки, как только он без сознания. Положите стерильную офтальмологическую мазь в оба глаза.
  3. Бритье волос на голову крысы с электрическими клиперами с #40 лезвием от чуть выше глаз на каудальной основе ушей, чтобы произвести достаточно хирургического поля. Удалите любые свободные, обрезанные волосы с сайта.
  4. Очистите хирургическое место, применяя 2% хлорогексидина скраб для бритой кожи головы следуют 70% этанола. Начните с центра и двигайтесь наружу в концентрических кругах от места разреза. Повторите этот процесс 3 раза. Применить бетадин раствор на сайте таким же образом и позволил высохнуть.
  5. Поместите анестезируемую крысу в стереотаксический каркас и поддерживайте анестезию при 2-3% изофлуран-1 л/мин кислорода через носекон. Проверьте на потерю абстиненции рефлекс задних конечностей и потери palpebral рефлекс, чтобы убедиться, что крыса находится в хирургической плоскости анестезии.
  6. Мониторинг частоты дыхания, частоты сердечных приступов, температуры тела и насыщения кислородом на протяжении всей операции. Поддерживайте частоту сердечных приступов между 300-400 bpm и SpO2 выше 90%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пульс-оксиметр прилагается к задней ноге могут быть использованы для обеспечения постоянного чтения из частоты сердечных приступов и SpO2. Частота сердечных приступов выше 400 bpm указывает на то, что крыса недостаточно обезождана. Саморегулирующаяся прокладка для нагрева, соединенная с ректальным термометром, установленная при температуре 37 градусов по Цельсию, может быть расположена под крысой на протяжении всей операции для поддержания температуры тела. Стереомикроскоп с источником света в сочетании с лампой оптического волокна полезны для визуализации процедуры.
  7. Используйте 23 г иглы, чтобы ввести 0,5% бупивакаин гидрохлорид интрейдерально в кожу головы на участке разреза для местной обезболивания 10 - 15 минут до принятия разреза.
  8. Сделайте разрез средней линии 1,5-2,5 см через кожу и мышцу кожи головы с помощью #10 скальпеля. Уречку кожи и мышц, чтобы разоблачить череп и обеспечить четкое хирургическое поле. Отражение лежащей в основе фасции и жировой ткани от кости стерильными ватными тампонами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электрический каутерии полезен для достижения быстрого гемостаза.
  9. Бритье вниз боковой гребень левой теменной кости с помощью хирургического куретт для получения гладкой плоской поверхности, так что основание женского женского замка Luer концентратор может отдохнуть заподлицо с черепом.
  10. Орошайте поверхность черепа и окружающие ткани с 2,0 мг/мл гентамицина растворве в стерильных солизных растворах. Погрело лишнее раствора стерильными тампонами.
  11. Нанесите 3% перекиси водорода на череп, чтобы высушить кость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кость недостаточно сухая, зубной цемент не будет придерживаться должным образом и образует сплошную печать.
  12. Создайте участок краниэктомии диаметром 5 мм через левую теменной кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трефин бит помещенв в силовой дрель, прикрепленный к стереотаксической рамы может быть полезным для инициирования краниэктомии. Используйте ручную дрель с трефином диаметром 5 мм, чтобы медленно закончить краниэктомию через оставшуюся кость. При приближении к завершению краниэктомии, поверните трефин в обратном направлении, чтобы предотвратить разрыв основной матер дюра. Там будет истончение черепа по периметру диска и клапан черепа будет чувствовать себя свободно при нажатии слегка.
  13. Удалите костной лоскут с помощью хирургического кюретта и гладких щипц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые кровотечения могут возникнуть, но гемостаз может быть быстро достигнуто путем применения мягкого давления с стерильными ватным тампонами.
  14. Используйте стереомикроскоп и освещение, чтобы визуально осмотреть дюру на наличие признаков разрыва.  Тонкий край кости останется вокруг окружности участка краниэктомии.  Аккуратно удалите этот край с гладкой ткани щипками, заботясь, чтобы не разорвать дюру.
  15. Swab череп с 70% этанола, чтобы удалить любую костную пыль и высушить череп.
  16. Нанесите тонкий слой клея цеаноакрилата вокруг нижнего края концентратора замка Luer и закрепите его к черепу над краниэктомии, не препятствуя открытию. Используйте осторожность, чтобы не привести клей в контакт с dura. Кроме того, печать замка Luer на месте с дополнительным тонким слоем клея вокруг внешнего основания концентратора.
  17. Приготовьте суспензию из зубного цемента. Нанесите цемент на поверхность черепа вокруг и над основанием замкового узла Luer, чтобы закрепить его на месте.
  18. Заполните концентратор замка Luer стерильным консервантом свободной искусственной церебральной спинномозговой жидкости (CSF) раствор (pH 7.4) с помощью шприца и иглы, так что выпуклый болюс солевая можно увидеть над верхней части обода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Решение будет держать дюра влажной, как зубной цемент высыхает, а также служит показателем целостности уплотнения. Если уровень решения падает на всех, это признак утечки в системе и блокировки Luer должны быть удалены и заменены.
  19. После того, как зубной цемент полностью вылечить, прекратить газовую анестезию и удалить крысу из стереотаксической рамы.
  20. Поместите крысу на платформу рядом с устройством FPI.
  21. Устройство FPI имеет изогнутый металлический наконечник, который простирается от преобразователя давления в конце резервуара жидкости. Безопасный 12 см длиной давления труб до конца изогнутые кончик с противоположным концом прекращения в 2 см мужской замок Luer твист разъем. Защитите крысу к устройству FPI, соединив женский конец концентратора на черепе крысы к мужскому разъему.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что соединение плотно защищено и что все пузырьки воздуха были удалены из системы.
  22. Поместите животное в строгое recumbency и неоднократно проверить на возвращение вывода рефлекс. Как только крыса восстанавливает рефлекс вывода, но все еще успокоительное, отпустите маятник устройства FPI, чтобы вызвать один 20 мс давление импульса и вызвать травму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы не вызвать травму в то время как животное глубоко обезврежьте, как это, как правило, вызывают повышенную смертность из-за нейрогенных индуцированных отек легких. Все устройства показывают изменчивость. Тем не менее, на устройстве, используемом для этого эксперимента, 17 "угол размещения молотка производит 2,2 - 2,3 атмосферного давления импульса. Неповрежденные, фиктивные животные проходят все те же процедуры, за исключением фактического импульса жидкости, чтобы вызвать травму.
  23. Немедленно отключите крысу от устройства FPI после травмы, поместите его в sternal recumbency, и обеспечить дополнительный кислород (1 л / мин) через нос конуса до спонтанного дыхания возвращается. Апноэ является ожидаемым следствием травмы. При необходимости, обеспечить периодические ручные вдохи через маску клапана мешок, пока крыса начинает спонтанно дышать самостоятельно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, апноэ длится менее 2 мин. Переходное быстрое повышение частоты сердечных приступов (Зтт;500 бм) наблюдается сразу после введения пульса давления из-за взрыва катехоламина. Это может контролироваться с пульсоксиметро, прикрепленный к ноге крысы и может служить в качестве возможного индикатора того, что тяжелая травма произошла.
  24. Мониторинг крысы непрерывно и записывать время возвращения исправления рефлекс (стабильная амбуляция на всех четырех конечностях).
  25. Величина импульса атмосферного давления для каждой крысы должна быть в пределах 0,05 атмосферы друг от друга. Подтвердите, что каждый пульс давления производит гладкий сигнал на осциллоскоп е с последовательной амплитудой и длительностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шумный сигнал может указывать на пузырьки воздуха в системе, которые должны быть удалены до доставки импульса травмы. Атмосферное давление импульсов, которые производят серьезные травмы, в этом эксперименте, являются те, которые обычно приводят к животным высвачивания раз 30-60 мин. Этот диапазон высыхающих времен связан с уровнем смертности примерно 40-50%).
  26. Администрирование 10 мл предварительно разогретого сосудистого подкожного подкожного в качестве поддерживающего ухода.
  27. Верните крысу в домашнюю клетку и дайте ей восстановиться, по крайней мере, 4 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенная смертность наблюдается, когда крысы помещаются сразу же обратно под наркозом.

2. Имплантация корковых эЭГ-электродов и видео-эЭГ-запись

  1. На 4 ч после травмы, анестезирует крысу, как уже описано ранее, и поместить его обратно в стереотаксическую раму, чтобы удалить концентратор замка Luer и зубной цемент.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентратор и цемент легко оторваться при умеренном давлении. При удалении концентратора тщательно проверяйте наличие разрыва или повреждения дюра. Непосредственно усыпил любое животное с повреждением дуры.
  2. Нанесите небольшое падение 0,5% гидрохлорид бупивакаина на череп в каждом из мест, где 5 пилотных отверстий должны быть пробурены (см. рисунок 1).
  3. Просверлите пилотные отверстия через череп ручным 0,1-мм сверлобитой.
  4. Закрепите винт электрода из нержавеющей стали в каждое отверстие пилота в следующих местах: эталонный винт помещается caudal к лямбде над мозжечком. Записывающие электроды размещены: 1) над полушарием ипсилатеральной и ростральной к краниэктомии; 2) над полушарием ипсилатеральной и каудальной к краниэктомии; 3) над полушарием контралатеральной и ростральной к краниэктомии; 4) над полушарием контралатеральной и каудальной к краниэктомии.
  5. Swab череп с 70% этанола, чтобы удалить любую костную пыль.
  6. Обложка краниэктомии сайт с тонким слоем стерильного костного воска, чтобы покрыть подвергаются dura.
  7. Соедините электродный массив к 5 эЭГ-электродам, обернув открытый конец цветокодированного электрода, плотно обняв назначенный электрод из нержавеющей стали винта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Противоположные концы каждого электродного провода расположены в определенном, назначенном месте внутри разъема пьедестала.
  8. Приготовьте суспензию из костного цемента.
  9. Соберите электродные провода в катушку под пьедесталом и закрепите провода и пьедестал на место с костным цементом. Держите пьедестал в положении, пока костной цемент не вылечится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кость должна быть особенно сухой и нелишенной любой остаточной крови для достижения надлежащей адгезии и предотвращения преждевременного удаления передатчика.
  10. Прикрепите беспроводной передатчик со свежими батареями к пьедесталу, прежде чем удалить животное из стереотаксической рамы.
  11. Поместите животное в домашнюю клетку и поместите клетку в непосредственной близости от приемника и с учетом назначенной видеокамеры. Инициировать видео/запись ЭЭГ.

3. Сбор видео-записей ЭЭГ

  1. Перед сбором сигналов ЭЭГ, сделать частоту развертки комнаты, где крысы будут размещены для сбора ЭЭГ для выявления любых потенциальных частот вмешательства, чтобы предотвратить сбор записи ЭЭГ с любой частотой, которая имеет фоновый шум.
  2. Установите все передатчики на определенные частоты, которые свободны от помех.
  3. Установите частоту выборки и диапазон ввода каждого программируемого передатчика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано с помощью смарт-инструмента, предоставляемого производителем системы. Передатчики могут пробы с максимальной скоростью 1000 Гц и максимальным вхотворным диапазоном в 10 мВ. В этом эксперименте были проанализированы записи ЭЭГ от 0,5 гц до 30 Гц. Таким образом, частота выборки была установлена на уровне 250 Гц. Обычно мы наблюдаем амплитуды менее 1 мВ. Таким образом, диапазон ввода установлен на уровне 2 мВ.
  4. Используйте программное обеспечение для сбора ЭЭГ, предоставляемое производителем, для непрерывной записи видео-ЭЭГ, начиная с дня травмы, связывающей каждый беспроводной передатчик через уникальную частоту к конкретному приемнику.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пара приемника передатчика способна контролировать 4 монополярных эЭГ-канала и ускорение в самолетах X, Y и Q. Данные ЭЭГ могут быть записаны на сервер хранения. Данные видео должны быть сохранены на устройстве NAS, подключенном к серверу хранения. Программное обеспечение для анализа ЭЭГ синхронизирует видео и запись ЭЭГ на основе времени, поддерживаемого сервером хранения.
  5. Используйте программное обеспечение для сбора видео для записи видео каждой крысы с собственной камерой разрешения 2 МП (1920 х 1080), настроенной для записи на 30 кадров/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая камера имеет свою собственную инфракрасную подсветку для сбора видео в ночное время.
  6. Назначьте систему, чтобы автоматически сохранять все записи видео и ЭЭГ на сервере хранения каждые 24 ч. Видео производят довольно большие файлы.

4. Анализ видео/ЭЭГ

  1. Синхронизируйте видео с каждой записью ЭЭГ с разрешением 1/10 с. Сделайте это с помощью системы производителей видео / ЭЭГ анализа программного обеспечения, которое создает метафайл с печатью точного времени как ЕГЭ и видео.
  2. Ручной экран через записи ЭЭГ для определения событий индекса, определяющих активность захвата.
  3. Используя программное обеспечение анализа видео/ЭЭГ и события ЭЭГ, создайте файл конфигурации, в который используются ключевые параметры (т.е. мощность в определенных частотных диапазонах, отношение частотных диапазонов к общей мощности, порог ускорения и т.д.) для определения характеристик потенциальных событий захвата.
  4. Запустите программное обеспечение для анализа ЭЭГ для определения потенциальных регионов записи ЭЭГ, которые квалифицируются на основе параметров, выбранных в файле конфигурации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа ЭЭГ позволяет автоматически обнаруживать захваты и выделяет регионы, представляющие интерес для сигналов ЭЭГ, и обеспечивает анализ спектра мощности FFT по всему сигналу.
  5. Подтвердите потенциальные судорожные припадки с помощью видеозаписей, собранных во время приобретения, которые синхронизируются с соответствующими записями ЭЭГ каждой крысы.

Результаты

С помощью этой модели, мы индуцированных тяжелых TBI во взрослых, мужчин, Wistar крыс. В условиях, которые мы описываем здесь, мы обычно наблюдаем смертность 40-50%, и исправив рефлекторные времена 30 - 60 минут, как ранее описано20. Мы смогли собрать видео / ЭЭГ записи 24 ч / день, начиная с дня травмы. Диаграмма, показывающая расположение четырех монополярных эЭГ-электродов и одного эталонного электрода, показана на рисунке 1А. Изображения, демонстрирующие расположение и внешний вид поражений TBI, ожидаемых с условиями, описанными здесь, показаны на рисунке 1B-D. В условиях, описанных здесь, мы постоянно наблюдаем замедление дельты в течение первых трех дней после TBI. Менее сильно раненые крысы проявляют односторонние, прерывистые замедления дельты(Рисунки 2C-D). В отличие от этого, непрерывное, двустороннее замедление дельты наблюдается после более тяжелых травм(рисунок 3C-D). Некоторая степень замедления дельты постоянно наблюдалась у всех крыс ТБИ, но не была обнаружена ни у одного фиктивного (краниэктомия только) контроль ных крыс(рисунки 2A-B; 3A-B). Обширное замедление дельты постоянно наблюдалось в течение первых трех дней после травмы у большинства крыс TBI. Интересно, что крысы обычно показывают выраженную потерю веса в течение первых трех дней после травмы. Несудорожные припадки иногда наблюдаются в течение первой недели после TBI(рисунок 4 C-D). Клинические припадки, представляющие как всплеск кластеров, связанных с воспитанием и падением, а также клонус предплечья можно наблюдать после 1-недельного поста TBI(Рисунок 5C-D). Наконец, на рисунке 6 представлены репрезентативные изображения случайного выпадения сигнала и потери сигнала из-за отказа батареи.

figure-results-2106
Рисунок 1 . Расположение краниэктомии, размещения электродов и поражения. (A) показывает схематическую схему черепа крысы с расположением краниэктомии (серый круг в левом полушарии), четыре монополярных электрода (черные точки; 1,2,3,4), расположенных между Брегмой и Lambda и эталонным электродом (Черная точка, R) помещена средней линии, задняя к лямбде; (B) показывает коронарное посмертное МРТ T2 с расположением поражения, идентифицированного красным кругом; (C) показывает 2-D карту коры, где определяется расположение и размер поражения (голубая область). (D) показывает Nissl окрашенных корональной секции с поражения в коробке, поражения 100x увеличена на изображении справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3216
Рисунок 2 . Односторонняя, прерывистая дельта замедление, собранная в день умеренного ТБИ. (A) показывает 90 s EEG след от фиктивной прооперированных, невредимых контроля крысы в день операции. Представлены все четыре канала. 10-й длинный след (взятый из области коробки) был извлечен из 3-го канала, чтобы лучше визуализировать базовый шаблон ЭЭГ. Раздел 2048 ms EPOC этого был выбран для анализа в соответствующем FFT. (B) FFT анализ 2048 ms выбранных EPOC из невредимых фиктивных оперированных животных в день операции. (C) показывает 90 s EEG след, который демонстрирует прерывистую, одностороннюю модель замедленного дельты умеренно поврежденного животного в день ушиба. 10-й длинный след (взятый из области коробки) был извлечен из 3-го канала, чтобы лучше визуализировать дельта замедление EEG шаблон. Раздел 2048 ms EPOC этого был выбран для анализа в соответствующем FFT. (D) FFT анализ 2048 мс выбран EPOC от умеренной TBI животных в день травмы. 90 с ЭЭГ трассировки, сверху вниз являются биопотенциалы 1, 2, 3, 4, соответствующие их местоположения вокруг участка краниэктомии, как видно на рисунке 1. Серые вертикальные знаки определяют 1 с интервалом на следах ЭЭГ. Все следы ЭЭГ отображаются по шкале от 500 евро.  В графиках анализа FFT общий анализ частоты составлял 0,5-30 Гц. Это было дополнительно разбито на 4 отдельные частотные полосы Delta (желтый, 0,5-4 Гц), Тета (Фиолетовый, 4-8 Гц), Альфа (красный, 8-12 Гц), и бета-версия (зеленый, 12-30 Гц).  % (Power) график, показанный в анализе FFT, показывает, какой процент от общей мощности в анализируемом EPOC исходит от каждого ранее указанного диапазона частот, что позволяет дальнейшую математическую характеристику моделей волн ЭЭГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5379
Рисунок 3 . Двусторонняя, непрерывная дельта замедление собраны в день тяжелой TBI. (A) показывает 90 s EEG след от фиктивной прооперированных, невредимых контроля крысы в день операции. Представлены все четыре канала.  10-й длинный след (взятый из области коробки) был извлечен из 3-го канала, чтобы лучше визуализировать базовый шаблон ЭЭГ. Раздел 2048 ms EPOC этого был выбран для анализа в соответствующем FFT. (B) FFT анализ 2048 ms выбранных EPOC из невредимых фиктивных оперированных животных в день операции. (C) показывает 90 s EEG след, который демонстрирует непрерывный, двусторонний дельта замедление картины тяжело раненного животного в день травмы.  10-й длинный след (взятый из области коробки) был извлечен из 3-го канала, чтобы лучше визуализировать дельта замедление EEG шаблон. Раздел 2048 ms EPOC этого был выбран для анализа в соответствующем FFT. (D) FFT анализ 2048 мс выбран EPOC от тяжелой TBI животных в день травмы. 90 с ЭЭГ трассировки, сверху вниз являются биопотенциалы 1, 2, 3, 4, соответствующие их местоположения вокруг участка краниэктомии, как видно на рисунке 1. Серые вертикальные знаки определяют 1 с интервалом на следах ЭЭГ. Все следы ЭЭГ отображаются по шкале от 500 кВ.  В графиках анализа FFT общий анализ частоты составлял 0,5-30 Гц.  Это было дополнительно разбито на 4 отдельные частотные полосы Delta (желтый, 0,5-4 Гц), Тета (Фиолетовый, 4-8 Гц), Альфа (красный, 8-12 Гц), и бета-версия (зеленый, 12-30 Гц). % (Power) график, показанный в анализе FFT, показывает, какой процент от общей мощности в анализируемом EPOC исходит от каждого ранее указанного диапазона частот, что позволяет дальнейшую математическую характеристику моделей волн ЭЭГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-7526
Рисунок 4 . Несудорожный электрографический припадок собран 3 дня после тяжелого ТБИ. (A) показывает 90 s EEG след от фиктивной прооперированных, невредимым контроля крысы 3 дня25 после операции. Представлены все четыре канала. 10-й длинный след (взятый из области коробки) был извлечен из 3-го канала, чтобы лучше визуализировать базовый шаблон ЭЭГ. Раздел 2048 ms EPOC этого был выбран для анализа в соответствующем FFT. (B) FFT анализ 2048 ms выбранных EPOC из невредимых фиктивных оперированных животных на следующий день три25 после операции. (C) показывает 90 s ЭЭГ след три 25 дней после тяжелой травмы.  Это шоу здание, быстрый пики картины настоящее двустороннее и во всех 4 каналов сбора.  10-й длинный след (взятый из области коробки) был извлечен из 3-го канала, чтобы лучше визуализировать пики EEG шаблон. Раздел 2048 ms EPOC этого был выбран для анализа в соответствующем FFT. (D) FFT анализ 2048 мс выбран EPOC от тяжелой TBI животных в день травмы.  90 с ЭЭГ трассировки, сверху вниз являются биопотенциалы 1, 2, 3, 4, соответствующие их местоположения вокруг участка краниэктомии, как видно на рисунке 1. Серые вертикальные знаки определяют 1 с интервалом на следах ЭЭГ. Все следы ЭЭГ отображаются по шкале от 500 кВ.  В графиках анализа FFT общий анализ частоты составлял 0,5-30 Гц.  Это было дополнительно разбито на 4 отдельные частотные полосы Delta (желтый, 0,5-4 Гц), Тета (Фиолетовый, 4-8 Гц), Альфа (красный, 8-12 Гц), и бета-версия (зеленый, 12-30 Гц).  % (Power) график, показанный в анализе FFT, показывает, какой процент от общей мощности в анализируемом EPOC исходит от каждого ранее указанного диапазона частот, что позволяет дальнейшую математическую характеристику моделей волн ЭЭГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-9770
Рисунок 5 . Судорожный электрографический припадок собрал 9 дней после ТБИ. (A) показывает 90 s EEG след от фиктивной прооперированных, невредимым контроля крысы девять (9) дней после операции. Представлены все четыре канала. 10-й длинный след (взятый из области коробки) был извлечен из 3-го канала, чтобы лучше визуализировать базовый шаблон ЭЭГ. Раздел 2048 ms EPOC этого был выбран для анализа в соответствующем FFT. (B) FFT анализ 2048 ms выбранных EPOC из невредимых фиктивных оперированных животных на девятый день (9) после операции. (C) показывает 90 s EEG след девять (9) дней после тяжелой травмы. Это шоу здание, быстрый пики картины настоящее двустороннее и во всех 4 каналов сбора. 10-й длинный след (взятый из области коробки) был извлечен из 3-го канала, чтобы лучше визуализировать пики EEG шаблон.  Раздел 2048 ms EPOC этого был выбран для анализа в соответствующем FFT. (D) FFT анализ 2048 ms выбранных EPOC от тяжелой TBI животных девять (9) дней после травмы. 90 с ЭЭГ трассировки, сверху вниз являются биопотенциалы 1, 2, 3, 4, соответствующие их местоположения вокруг участка краниэктомии, как видно на рисунке 1. Серые вертикальные знаки определяют 1 с интервалом на следах ЭЭГ. Все следы ЭЭГ отображаются по шкале от 500 кВ. В графиках анализа FFT общий анализ частоты составлял 0,5-30 Гц. Это было дополнительно разбито на 4 отдельные частотные полосы Delta (желтый, 0,5-4 Гц), Тета (Фиолетовый, 4-8 Гц), Альфа (красный, 8-12 Гц), и бета-версия (зеленый, 12-30 Гц).  %(Power) график, показанный в анализе FFT, показывает, какой процент от общей мощности в анализируемом EPOC исходит от каждого ранее указанного диапазона частот, что позволяет дальнейшую математическую характеристику моделей волн ЭЭГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-11953
Рисунок 6 . Сигнал выпадает. Это 3 отдельных примера того, что сигнал выпадают из-за передатчика или приемника вопросы появляется как на записи ЭЭГ. (A) Это пример прерывистого отсева сигнала ЭЭГ на записи.  (B) Это пример выпадения из-за отказа батареи во время непрерывной беспроводной телеметрии появляется как на EEG трассировки.  (C) В пределах кружевной области, можно увидеть, что, когда качество сигнала (ЗОС) падает со 100 до 0, отслеживание ЭЭГ становится сплющенный и застой ный на 0 QV.  Серые вертикальные знаки определяют 1 с интервалом на следах ЭЭГ. Все следы ЭЭГ отображаются по шкале от 500 кВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Значительная изменчивость была зарегистрирована между лабораториями относительно конкретных параметров и методов, используемых для модели FPI TBI 14,26,27,28. Эти несоответствия привели к противоречивым результатам и затрудняют согласование усилий и результатов между лабораториями. Здесь мы представили подробную методологию, описывающую наш подход к долгосрочной, непрерывной записи видео / ЭЭГ для мониторинга посттравматической активности эпилептиформной. Ряд шагов имеет решающее значение для получения воспроизводимых результатов с помощью описанного метода.

Во-первых, учитывая, что заболеваемость посттравматической эпилепсией коррелирует с тяжестью травм, применяются условия, которые приводят к наиболее тяжелым ТБИ. В частности, используйте краниэктомию калибра 5 мм, чтобы обеспечить достаточно большую площадь дуры. Кроме того, закрепите устройство для блокировки самки и женщины Luer на поверхности черепа, с отверстием, размещенным непосредственно над краниэктомией. Это отличается от других лабораторий, которые использовали меньший краниэктомии (3 мм) и / или размещены модифицированные иглы концентратор внутри краниэктомии, которая эффективно уменьшает размер открытия. Путем устанавливать замок Luer вне краниэктомии, отверстие 5mm поддержано. Эти специфические параметры влияют на общую силу, применяемую к дуре. Атмосферное давление, применяемое к дуре, также оказывает значительное влияние на тяжесть наблюдаемых травм. К сожалению, атмосферное давление сильно изменчиво и, как представляется, зависит от устройства. Некоторые лаборатории сообщили о применении импульса давления 8 - 10 мс18. В отличие от этого, описанный здесь метод приводит к импульсу давления 20 мс. Это согласуется с другими лабораториями, которые, как представляется, генерировать более серьезные травмы 14,28. Ясно, что пульс давления, вызывающий травмы, является параметром, который показывает значительную изменчивость между лабораториями и должен быть эмпирически определен. Тем не менее, тяжесть травмы может быть определена на основе сочетания смертности (40-50%), выстраивание рефлекторных времен (Зgt;30 мин)26. Также важно, чтобы в исследование были включены только животные с нетронутой дурой. Кроме того, если краниэктомия окклюзии любого клея или цемента, так что часть dura под краниэктомии не подвергается полной силе импульса давления жидкости, то животное должно быть исключено из исследования.  Кроме того, избыток клея под замком Luer может прилипнуть к дюре и удалить его цементной крышкой даже после успешной травмы.  Наконец, гладкая форма кривой импульса давления на следе осциллоскопа дает указание на то, что в жидкой камере нет пузырьков воздуха, и указывает на то, что поршень движется без импеданса.

Еще одним важным фактором, который необходимо контролировать, является анестезия. Изофлуран воздействия должны быть сохранены до самого низкого уровня возможно для поддержания хирургической плоскости анестезии. Крысы подвергаются более высоким уровням изофлуран или в течение длительного времени, скорее всего, развивать нейрогенные индуцированные легочного отека. Подготовка черепа представляет собой еще один критический аспект метода. В частности, высыхание черепа и удаление любой костной пыли помогает предотвратить крыс от удаления передатчика преждевременно.

Размещение винтов и подключение проводов ЭЭГ, очевидно, имеют решающее значение для производства последовательно воспроизводимых записей. Важно, чтобы винты не помещались слишком глубоко, чтобы вызвать повреждение мозга. Костной лоскут, извлеченный из краниэктомии взрослых (12 недель) самцов крыс Wistar, постоянно имеет толщину 2 мм. Используйте электродные винты ЭЭГ с валом 2,5 мм. Полезно использовать кончики изогнутых гемостатических щипцы комаров в качестве прокладки, чтобы винты распространялись только на основание кости и не торчали в мозг.

Представленный здесь подход имеет некоторые ограничения. Аккумуляторы должны быть изменены на регулярной основе. Частота изменений батареи зависит от частоты выборки. Аккумуляторы обычно изменяются один раз в неделю на частоту отбора проб 1000 Гц. Этот временной срок можно продлить за счет снижения частоты выборки. Система также ограничена записью из четырех монополярных эЭГ-электродов. Тем не менее, это обеспечивает два канала на полушарие и может различать фокусные и обобщенные события и может различать передние и задние изменения. Несмотря на эти ограничения, этот подход обеспечивает разумный метод для проведения непрерывного видео/ЭЭГ мониторинга и обнаружения изменений эпилептиформа после тяжелых ТБИ.

Описанный здесь метод приводит как к электрографическим, так и ксудорожным припадам в течение одного месяца после TBI. Таким образом, этот подход обеспечивает разумные сроки, в которых для изучения потенциальных терапевтических для предотвращения эпилептогенеза после тяжелой ТБИ. Этот подход также предоставляет метод для исследования молекулярных механизмов, связанных с PTE и может привести к выявлению потенциальных биомаркеров, которые могут быть использованы для выявления пациентов, которые наиболее подвержены риску развития ПТЭ.

Раскрытие информации

Chelasea R Ричардсон является сотрудником emka Scientific, поставщик этой беспроводной телеметрии системы описано.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Пола Дресселя за его неоценимую поддержку в графическом дизайне и подготовке фигур.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.00 mm Drill BitsDrill Bit City: New Carbide Tools05M200
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement3M , Neuss Germany38019Dental Cement
4-0 SutureEthicon, Sommerville, NJK831H4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture 
5 mm outer diameter trephineFine Science Tools18004-50
BonewaxMedline Industries, Mendelcin, ILREF DYNJBW25
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vialPar Pharmalogical, Chestnut Ridge NY3003706NDC 42023-179-01
Dumont #6 ForcepsFine Science Tools11260-20
Dumont #7b ForcepsFine Science Tools11270-20
ecgAUTOEMKA Technologies, Falls Church, VA
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare  Cole-Palmer instrumentSKO#45501-22Order lot #214271
Foot Power DrillGrobet USA, Carlstadt, NJModel C-300
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution)Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MONDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
IOX2 Software EMKA Technologies, Falls Church, VA
Isoflorane, USPPiramal Enterprise Limited, Andhra, IndiaNDC 66794-013-25
IsoTech Anesthesia machineSurgiVetWWV9000
Lateral FPI deviceAmScien302curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22)
Leica A60 StereomicroscopeLeica Biosystems, Richmond, VAPN: 10 450 488
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mLHospira, Lake Forest, ILCA-362750mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50
Micro-Adson ForcepsFine Science Tools11018-12
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture CuttersFine Science Tools12002-14
PALACOS R+G bone cement with gentamicinHeraeus, REF: 5036964Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin
Physio SuiteKent Scientific, Terrington, CT
Povidone-iodine solutionBetadine 
Puralube Vet OintmentDechra Veterinary Products, Overland Park KSNDC 17033-211-38
Scalpel blade (#10) and holderIntegra Miltex, York, PAREF: 4-110
Scalpel Handle - #4Fine Science Tools10004-13
Sickle KnifeBausch + Lomb Storz InstrumentsN1705 HM5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches.
Silverstein Micro MirrorBausch + Lomb Storz InstrumentsN1706 S83mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches
Storage NASSynology Inc. DS3615xs
Synology Assistant Synology Inc. 
Thermal Cautery UnitGeiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IAModel NO: 150
VetivexDechra Veterinary Products, Overland Park KSVeterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP)
Video CamerasTRENDnet, Torrance, CATV-IP314PIIndoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral
Video NASSynology Inc. DS916
Wistar IGS rats Charles Riverstrain code 00312 wk old at the time of injury
Wullstein RetractorFine Science Tools17018-11

Ссылки

  1. Flanagan, S. R. Invited Commentary on Centers for Disease Control and Prevention Report to Congress: Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96, 1753-1755 (2015).
  2. Annegers, J. F., Coan, S. P., Hauser, W. A., Leestma, J., Duffell, W., Tarver, B. Epilepsy, vagal nerve stimulation by the NCP system, mortality, and sudden, unexpected, unexplained death. Epilepsia. 39, 206-212 (1998).
  3. Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, 4-9 (2009).
  4. Englander, J., et al. Analyzing risk factors for late posttraumatic seizures: a prospective, multicenter investigation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 84, 365-373 (2003).
  5. Faul, M. X. L., Wald, M. M., Coronado, V. G. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths 2002-2006. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , (2010).
  6. Herman, S. T. Epilepsy after brain insult: targeting epileptogenesis. Neurology. 59, 21-26 (2002).
  7. Annegers, J. F., Coan, S. P. The risks of epilepsy after traumatic brain injury. Seizure. 9, 453-457 (2000).
  8. Christensen, J., Pedersen, M. G., Pedersen, C. B., Sidenius, P., Olsen, J., Vestergaard, M. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373, 1105-1110 (2009).
  9. Webb, T. S., Whitehead, C. R., Wells, T. S., Gore, R. K., Otte, C. N. Neurologically-related sequelae associated with mild traumatic brain injury. Brain Injury. 29, 430-437 (2015).
  10. Mahler, B., Carlsson, S., Andersson, T., Adelow, C., Ahlbom, A., Tomson, T. Unprovoked seizures after traumatic brain injury: A population-based case-control study. Epilepsia. 56, 1438-1444 (2015).
  11. Wang, H., et al. Post-traumatic seizures--a prospective, multicenter, large case study after head injury in China. Epilepsy Research. 107, 272-278 (2013).
  12. Simonato, M., French, J. A., Galanopoulou, A. S., O'Brien, T. J. Issues for new antiepilepsy drug development. Current Opinion in Neurology. 26, 195-200 (2013).
  13. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Review Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
  14. Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscienc. 140, 685-697 (2006).
  15. McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
  16. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  17. Curia, G., Eastman, C. L., Miller, J. W., D'Ambrosio, R., Laskowitz, D., Grant, G. Modeling Post-Traumatic Epilepsy for Therapy Development. Translational Research in Traumatic Brain Injury. , (2016).
  18. D'Ambrosio, R., Fairbanks, J. P., Fender, J. S., Born, D. E., Doyle, D. L., Miller, J. W. Post-traumatic epilepsy following fluid percussion injury in the rat. Brain. 127, 304-314 (2004).
  19. Saatman, K. E., et al. Classification of traumatic brain injury for targeted therapies. Journal of Neurotrauma. 25, 719-738 (2008).
  20. Smith, D., Brooke, D., Wohlgehagen, E., Rau, T., Poulsen, D. Temporal and Spatial Changes in the Pattern of Iba1 and CD68 Staining in the Rat Brain Following Severe Traumatic Brain Injury. Modern Research in Inflammation. 4, 9-23 (2015).
  21. Ndode-Ekane, X. E., et al. Harmonization of lateral fluid-percussion injury model production and post-injury monitoring in a preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 151, 7-16 (2019).
  22. Ciszek, R., et al. Informatics tools to assess the success of procedural harmonization in preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 17-26 (2019).
  23. Immonen, R., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter MRI biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 46-57 (2019).
  24. Kamnaksh, A., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter plasma protein and miRNA biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 149, 92-101 (2019).
  25. Redell, J. B., Moore, A. N., Ward, N. H., Hergenroeder, G. W., Dash, P. K. Human traumatic brain injury alters plasma microRNA levels. Journal of Neurotrauma. 27, 2147-2156 (2010).
  26. Smith, D., et al. Convulsive seizures and EEG spikes after lateral fluid-percussion injury in the rat. Epilepsy Research. 147, 87-94 (2018).
  27. Eastman, C. L., Fender, J. S., Temkin, N. R., D'Ambrosio, R. Optimized methods for epilepsy therapy development using an etiologically realistic model of focal epilepsy in the rat. Experimental Neurology. 264, 150-162 (2015).
  28. Shultz, S. R., et al. Can structural or functional changes following traumatic brain injury in the rat predict epileptic outcome. Epilepsia. 54, 1240-1250 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены