JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол описывает использование проволочной миографии для оценки трансмуральной изометрической напряжённости мекишечных артерий, изолированных от мышей, с особым учетом модуляции факторами, высвобожмающей из эндотелиальных клеток и периваскулярных жировых тканей.

Аннотация

Изменение тонуса сосудов при чувствительности к патофизиологическим стимулам способствует развитию широкого спектра сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний. Эндотелиальная дисфункция представляет собой главную виновницу для уменьшенного сосонизации и увеличенного вазоконстрирования артерий. Жировые (жировые) ткани, окружающие артерии, играют важную роль в регуляции эндотелия-зависимого расслабления и/или сжатия клеток сосудистой гладкой мускулатуры. Кросс-переговоры между эндотелия и периваскулярные жировой ткани могут быть оценены ex естественных условиях с использованием установленных кровеносных сосудов с помощью проволоки миографии системы. Тем не менее, оптимальные настройки должны быть установлены для артерий, полученных от животных различных видов, возрастов, генетических фонов и/или патофизиологических условиях.

Введение

Дилатации и перетяжения артерий достигается путем расслабления и сокращения, соответственно, их сосудистых гладких мышечных клеток. Изменения в сосудистой отзывчивости мелких артерий способствуют гомеостатическому регулированию артериального давления со стороны вегетативных нервов и гормонов, присутствующих в крови (например, катехоламинов, ангиотензин II, серотонин, вазопрессин). На местном уровне, сосудистые реакции гладких мышечных клеток модулируется сигналов от обоих эндотелиальных клеток интимы и жировой ткани окружающих артерий (рис. 1).

Эндотелия не только пассивный барьер, но и служит в качестве поверхности для обмена сигналов между кровью и лежащих в основе сосудистых клеток гладкой мускулатуры. Выпуская различные вазоватоактивные вещества, эндотелий играет важнейшую роль в локальном контроле реакций сосудистого тонуса1. Например, в ответ на ацетилхолин, эндотелиальная оксида азота синтаза (Енос) активируется в эндотелия для производства оксида азота (нет), что вызывает расслабление лежащих в основе сосудистой гладких мышц путем активации растворимых гуанилилциклаз циклозы (SGC) 2. другие вазоактивные вещества включают в себя продукты цикоксигеназы (напр., простациклина и тромбоксана2), липоксидженазы (напр., 12-гидрокезицифосенические кислоты, 12-HETE), и цитохром P450 Монокислородазы (HETE и эпоксиосагеновые кислоты, Эетс), реактивные виды кислорода (ROS) и вазоактивные пептиды (напр., эндтилин-1 и ангиотензин II) и эндотелия-производные гиперполяризационные факторы (ЭДХЛ)3. Тонкий баланс между эндотелия производных вазодилататоры и сосудосустристрикторов поддерживать местный вазомоторные тон4,5.

Эндотелиальная дисфункция характеризуется нарушением эндотелия-зависимой вазолатации6, отличительной чертой сосудистого старения7. С возрастом, способность эндотелия содействовать васосонизации постепенно снижается, в значительной степени из-за снижения биодоступности нет, а также аномальное выражение и функции Енос в эндотелия и sGC в сосудистых гладких мышечных клетках8 , 9 , 10. сокращение не биодоступность потенцирует производство эндотелия зависимых вазоконстрикторов11,12. В возрасте артерий, эндотелиальная дисфункция вызывает гиперплазии в средствах массовой информации, как это отражено заметное увеличение толщины стены, количество медиальных ядер, которые напоминают артериального утолщения при гипертонии и атеросклерозе наблюдается в человеческом пациентам13,14. Кроме того, патофизиологические условия, такие как ожирение, диабет или гипертония ускорить развитие дисфункции эндотелия15,16.

Периваскулярная жировая ткань (ПФТ) выпускает многочисленные адипокины для регуляции сосудистой структуры и функции17. Анти-сократительное действие pvat опосредовано расслабляющими факторами, такими как адипонектин, нет, перекись водорода и сероводород18,19,20. Однако в зависимости от локализации и патофизиологических условий, PVAT также может усилить сократческие реакции в различных артериях21. Про-сократные вещества, производимые pvat включают ангиотензин-II, лептин, резстин, и рос22,23.  В большинстве исследований, на изолированных кровеносных сосудов, PVAT был рассмотрен в качестве простого структурной поддержки для сосудов и таким образом удалены во время подготовки сегментов кровеносных сосудов кольцо. Так как жировой дисфункции представляет собой независимый фактор риска для гипертонии и связанных с ними сердечно-сосудистых осложнений24, pvat окружающих кровеносные сосуды должны быть рассмотрены при исследовании сосудистой отзывчивости различных артерий.

Мульти-проволочные системы миографа широко используются для исследования вазомоторные функции различных кровеносных сосудов, в том числе аорты, межеечные, почечные, бедренные, церебральные и коронарные артерии25,26. Протоколы, описанные в настоящем документе, будут использовать проволочный миография для оценки сосудистой реакции в мезеечных артериях, выделенных из генетически модифицированных моделей мышей, с особым упором на модуляцию по PVAT.

протокол

Все животные, используемые для следующего исследования, были предоставлены лабораторным животным подразделением медицинского факультета Гонконгского университета. Этическое одобрение было получено от ведомственного комитета по использованию лабораторных животных для преподавания и исследований (CULАТР, No.: 4085-16).

1. Подготовка

  1. Подготовка лекарственных препаратов
    1. Храните наркотики надлежащим образом, как указано в бюллетене по безопасности материалов (MSDS) сразу после их получения. Растворите снадобья в форме порошка в растворителях как разрешения запаса высок-концентрации и после этого Алиготе для хранения на-20 °c.
      Примечание: большинство лекарств растворяются в дистиллированной воде для подготовки решений на складе; для некоторых препаратов может потребоваться Отопление или сонофикация. Если наркотики не полностью растворяются в воде, можно добавить каплю 1 м NaOH, в то время как для основных препаратов можно использовать каплю совместимого 1 M. Гидрофобные препараты могут растворяться в диметилсульфисовом (ДФСО) или абсолютном этанол. В последних случаях следует знать окончательную концентрацию ванны (в м) и следует проводить надлежащие меры контроля для того, чтобы исключить воздействие растворителей.
    2. Перед экспериментом, растворить препарат аликвотс (таблица материалов) в Кребс-звонарь бикарбонат раствор (Кребс), содержащий 115 mm Перламуговый, 4,6 mm kcl, 2,5 mm CAcl2, 1,17 mm mgso4, 1,17 mm х2PO4, 25 мм нако3, 11,1 mm D-глюкоза и 0,01 mm ЭДТА, pH 7,4.
    3. Для кумулятивных кривых реакции концентрации, подготовьте запасы и рабочие решения различных препаратов по серийным разведениям (Таблица 1).
  2. Настройка прибора
    1. Калибровка силового датчика для всех каналов перед использованием системы миографа на каждый день, или каждый раз, когда система была перемещна.
      Примечание: подробная процедура калибровки варьируется в зависимости от модели. В целом на челюсти наносится вес в два грамма, а соответствующая сила должна 9,81 ± 0,1 млн. Если показания выключили более чем на 0,1 mN, преобразователь должен быть перекалиброван. Для системы, используемой в настоящем Протоколе (см. таблицу материалов) операционные значения для преобразователя силы при калибровке должны быть между 3000 и 3500. Если значение датчика выше или ниже, преобразователь силы должен быть заменен.
    2. Отрегулируйте и выровняйте монтажные опоры в каждой камере. Непрерывное и повторное использование миографа может привести к неправильной настройке поддержки монтажа, которая нуждается в периодической корректировке перед экспериментами, чтобы убедиться, что челюсти правильно выровнены.
      Примечание: особое внимание необходимо обратить при корректировке монтажных опор, так как силовые преобразователи очень чувствительные и хрупкие.
    3. Включите нагреватели и газ (95% O2 и 5% CO2) не менее 30 минут до начала эксперимента, чтобы камеры и буферы нагреваться до 37 ± 0,1 ° с и хаотичны с газовой смесью.
      1. Проверьте температуру на термометре, чтобы обеспечить точность нагревателя. Температура может быть изменена для запуска охлаждения или потепление экспериментов. Если температура не является правильной, нанесите функцию смещения машины, чтобы увеличить или уменьшить параметры для достижения требуемой температуры.
    4. В конце эксперимента, очистить все камеры и выключить нагреватель, а также газ работает на установку.
      1. Не выключаем газ, прежде чем все жидкости в камере был высосал из системы, в противном случае кислоты/дистиллированной воды может извергнуть и достичь органной камеры во время следующего использования.
      2. Чтобы очистить камеры провода миографа, наиболее эффективным способом является выполнение кислоты мыть с помощью разбавленного раствора ацетотической кислоты. Очистите край и внутреннюю часть камер ватным тампоном.
      3. После стирки тщательно промойте камеры дистиллированной водой. Протрите вне камер с мокрой тканью для удаления сушеной соли. Этанол можно использовать и при использовании гидрофобных препаратов во время эксперимента.
      4. Примером процедуры стирки является следующее. Заполните камеры с 8% раствор ацетотической кислоты и инкубировать в течение 2 мин. Использование хлопка наконечником аппликатора для механической очистки стальной камеры поверхности. Избегайте контакта с алюминиевой частью миографа.
      5. Аспират ацетической кислоты и мыть миографа камеры и поддерживает несколько раз с дистиллированной водой и высушить поверхностей с использованием абсорбирующей бумаги или хлопка-наконечника.
  3. Расслоение межеечных артериальных колец
    Примечание: Животные, используемые для текущего исследования были с высоким содержанием жиров диеты кормили мужчин ADIPO-SIRT1 мышей и диких типа littermates в качестве элементов управления. Каждое животное весило приблизительно 45 g во время экспериментов.
    1. Усыпить мышь путем интраперитонеальная инъекции препарата Пентобарбитал натрия (50 мг/кг).
    2. С хирургической ножницы и щипцы, выполните средней линии лапаротомии выявить брюшного содержимого.
    3. Соберите брыжеечной аркады в силиконовые покрытием чашку Петри.
    4. Разложите и придавить сетевую сеть в чашке Петри, чтобы выявить разветвление мештерьи и соединительной ткани.
    5. Под микроскопом (10x), и с тонкой ножницы и щипцы, тщательно вскрыть окружающие соединительной ткани. Избегайте повреждения адвентитиал слоя. Кроме того, окружающие жировой ткани могут быть сохранены вокруг кровеносного сосуда для эксперимента (если это необходимо).
    6. Используя тонкие ножницы и щипцы, акцизные вторичные ветви межеечных артерий в ледяной буфер Кребс.
      Примечание: каждый исследователь должен иметь свой собственный набор расслоение комплекта, строки и стремена. Эти инструменты должны храниться надлежащим образом и очищены-вверх каждый раз после эксперимента, как некоторые препараты трудно смыть и остаток может прилипать к ним.
      1. Держите кровеносные сосуды в холодном буфере Кребс, разделяя окружающие соединительные ткани, включая PVAT. Во время обработки кровеносного сосуда, быть нежным, чтобы предотвратить ненужные повреждения эндотелия.
      2. Если эксперимент включает в себя изучение PVAT, сохранить 1,5 до 2 мм диаметр сферы PVAT вокруг кровеносного сосуда. Кроме того, в каждой камере для эксперимента можно добавлять одинаковое количество жировой ткани.
    7. Дополнительный Удалите эндотелий из расчлененных кровеносных сосудов в качестве элемента управления для оценки эндотелия-зависимости ответов. Для брыжеечных артерий удалите эндотелий, аккуратно прокатяв его по проволочной стремя или волосам.
    8. Вырезать кровеносный сосуд, подготовленный выше, в небольшие кольца (~ 2 мм длины) и поместить их в пластиковом блюде, полном газированных (95% O2 и 5% CO2) Кребс буфер для последующего монтажа в камерах провода миограф27.
    9. Передача кольца сосуда в миографа камеры помещены под микроскопом. Кольца должны быть помещены равномерно, с верхней и нижней стремена параллельно. Крепления проволоки (40 мкм) должны быть вновь подготовлены как наркотики могут связываться с строк.
    10. Поток кровеносных сосудов кольцо на подходящей длины (2 см) провода и закрепить на одну челюсть монтажных камеры, привинчивая исправить положение.
    11. Пройдите второй провод через кольцо и якорь к противоположной челюсти.
    12. С кольцами резьбовые и обеспеченных камеры челюсти, смонтировать камеру на установку миографа и превратить микрометр винт по часовой стрелке, чтобы переместить провода близко друг к другу до тех пор, пока сила чтения на пользовательский интерфейс, соответствующий камере установлен равна нулю или просто Ниже.
      Примечание: провод, прикрепленный к верхней челюсти, должен быть минимальной длины, чтобы гарантировать, что напряжение может быть полностью преобразовано к детектору.
    13. Equilibrate препараты на 37 ° c, по крайней мере 30 мин до первого применения силы с помощью регулируемого микрометра.
    14. Оценить жизнеспособность тканей в 115 mM высоким калием ( NCL заменены KCl на молярной основе) Кребс содержащие 4,6 mm перламуговый, 115 mm KCl, 2,5 mm cacl2, 1,17 mm MGSO4, 1,17 mm х2PO4, 25 мм нахуко3 и 11,1 mM D-глюкоза на pH 7,4.
      Примечание: изолированные сосуды считаются жизнеспособными, если сократительной силы и регистрируется как отклонение выше базовой линии в программном обеспечении для регистрации данных миографа системы составляет более 40% от их покоя тон, в ответ на сократителя. Если артерия не контракта надлежащим образом, то либо оптимальное базальное напряжение/стена давление не было должным образом скорректированы или артерии, возможно, были повреждены во время изоляции или монтажа судна.
    15. Дополнительный Оцените целостность эндотелиальных клеток, применяя фенилэфрин, чтобы вызвать сжатие сосуда до 50% от первоначальной реакции на KCl (как записано преобразователь силы в программном обеспечении для записи данных), а затем добавив 1 мкм ацетилхолина.
      Примечание: хороший препарат кровеносных сосудов имеет решающее значение для получения последовательных и точных результатов. Препарат не следует использовать для эксперимента, если тест на целостность эндотелия является неудовлетворительным или он не реагирует на KCl, указывая, что Эндотелиальная функция или сосудистая гладкая мышечная сократимость, соответственно, не являются удовлетворительными. В этом случае препарат следует заменить новым кольцом из того же кровеносного сосуда или нового кровеносных сосудов.

2. Нормализация для определения оптимального начального напряжения

Примечание: процедура нормализации позволяет определить оптимальный внутренний диаметр (IC) артерий, при которых кровеносный сосуд испытывает подходящее покоя Трансмуральное давление (100 мм рт. ст. или 13,3 кПа для мекишечных артерий) и производит максимальную активность сил в ответ на васоактивные агенты.

  1. Включите компьютер и откройте программное обеспечение для записи данных (см. таблицу материалов).
  2. Сохраните эксперимент как "файл данных LabChart" с новым именем, чтобы избежать перезаписи исходного файла настройки.
  3. Откройте окно настроек нормализации и установите коэффициент k как 1. Примите значения по умолчанию для калибровки окуляром (0,3, если длина сосуда неизвестна, или 1, если длина сосуда известна), целевое давление (13,3), онлайн время усреднения (2) и время задержки (60). Щелкните о'кей для того чтобы сохранить установки.
  4. Выберите каналы интереса и введите диаметр провода (40 мкм), конечные точки ткани (a1:0; А2: Длина ткани, измеряемая), начальное считывание микрометра в окне нормализации.
  5. Начало процедуры нормализации, применяя первый пассивный стрейч на кровеносный сосуд (поворот микрометра винт против часовой стрелки).
  6. Подождите, пока судно стабилизируется (3 мин) и введите новый чтении микрометра в окне нормализации. Натяжение стены автоматически вычисляется и отображается как точка на графике.
    Примечание: Микрометр "шаги", используемые во время пассивного стрейч не должны быть одинаковыми. Первые несколько участков могут быть по 20 мкм каждая. Как тянется ближе к изобара линии, шаги могут быть сокращены до 10 мкм, 5 мкм, 2 мкм или даже меньше. Откройте главное окно диаграммы, регулируя настройки микрометра — если появляется большой шип, превысившая изобобую линию на графике длины/натяжения (указывающая точки давления, соответствующая заранее определятому значению), уменьшите напряжение.
  7. После каждого пассивного стрейч, заменить контроль Кребс с ISO-осмотического высокой калия Кребс содержащие 115 mM KCl. Когда сжатие достигает плато (около 3 мин), запишите активную силу (F), вычитая пассивную силу на каждом участке от силы, активированной калием. Расчет натяжения стен, а также значений внутренней окружности (IC).
    1. Измерение активного напряжения как отклонение выше базовой линии. Активное натяжение (T) рассчитывается на основе уравнения F (mN) = T (mN/mm) х 2 х длина сосуда (мм). Значения внутренней окружности (IC) рассчитываются из данных микрометра (IC = 205,6 мкм + 2 х "пробел").
  8. Удалите высокое состояние калия, заменив его свежим Кребс. Повторите стирку в течение трех раз в течение 5 минут.
  9. Повторите шаги 2,5 до 2,8 (путем индуцирования пассивных участков с последующим активным сокращением в альтернативных поворотах) до тех пор, пока активное напряжение не начнет уменьшаться (рис. 2).
  10. После многократных раундов чередующихся отрезков, пассивные длины/натяжные кривые придают значению IC100, внутренней окружности сосуда при трансмуральном давлении 100 мм рт. ст., как контрольно-пропускной пункт с изобобовой линией.
    Примечание: каждый микрометр значение во время пассивных участков вручную вводится в Модуль нормализациипрограммного обеспечения. Программа автоматически записывает соответствующее измерение силы для генерации пассивной длины/напряжения кривой, которая дает значение IC100 как контрольно-пропускной пункт с изобара линии (рис. 2, справа панелей). Чем ближе последний пункт к изобары линии, но чуть выше лучшей нормализации без повреждения сосудов. Точка слишком далеко выше изобара линия может физически повредить установленный сосуд, вызывая ненадежных результатов во время эксперимента.
  11. Создайте активные кривые длины/натяжения, чтобы определить значения IC1 и рассчитать коэффициент нормализации k как соотношение IC1/IC100, которое будет использовано для этого типа кровеносного сосуда в последующих миографический экспериментах.
    Примечание: активные кривые длины/напряжения создаются путем построения значений IC, рассчитанных на данные микрометра на оси x и активные напряжения на оси y. IC1-это значение, лежащее в пределах пика региона плато (красные следы на рисунке 2, правильные панели). После построения кривых активной длины/натяжения и определения IC1 коэффициент нормализации k рассчитывается как соотношение IC1/IC100. Исходя из фактора нормализации , оптимальный ИК для базового уровня, обозначающийся как IC1, покажет на пассивной кривой длины/натяжения. Настройка микрометра для этого IC появляется под кривой и должна использоваться для установки микропозиционера для последующих миографических экспериментов. Начальная напряженность (T) равна целевому давлению (PI) x IC/2π, а оптимальная сила (F), применная к судну, равна длине сосуда T x 2 x.
  12. Тщательно промыть высокий калий Кребс и устанавливаются подготовки еще на 30 до 45 мин. сбросить базальную напряженность на "ноль", так что только активные сократительную реакцию будут записаны в ходе последующего эксперимента.

3. фенилэфрин-индуцированных сокращений

Примечание: препараты, которые могут быть выбраны для индуцирования вазоконстриктивные ответы включают неспецифической адренопептид агонистом норадреналина, селективный адренорецепторов-1 агонистом, фенилэфрин, пептидный гормон ангиотензин II, и моноамин Нейромедиатор 5-гидроциттриптамин. Фенилэфрин используется в настоящем Протоколе для экспертизы (таблица материалов).

  1. Подготовьте и установите спаренные артериальные кольца как описано в разделе 1,3, одно с PVAT неповрежденным и другое с PVAT извлекано, от смежных разделов каждой артерии для эксперимента.
  2. После нормализации (описано в разделе 2), предварительно контракта артериальных сегментов с высоким калием Кребс буфер, добавив 115 mM KCl решение камеры, содержащей Кребс.
  3. Подождите сокращения на плато (3 мин), промыть высокий калий и заменить свежим газированные Кребс буфер. Повторите стирку три раза в течение 5 минут.
  4. Повторите KCl стимуляции и стиральная три раза и записывать максимальный сократительной реакции/напряжение к KCl путем вычитания базового напряжения от напряжения из-за стимуляции KCl.
  5. После последнего сжатия и стирки, пополнить камеру с теплым, газированные Кребс буфер и позволяют артерии восстановиться в течение примерно 30 мин до выполнения следующей задачи.
  6. Для каждой палаты добавьте кумулятивное количество фенилэфрин (половинчатые приращения от 10-10 до 10-4 м), чтобы побудить концентрация-зависимое увеличение в изометрической напряженности препаратов покоя.
  7. Начните с добавления низкой концентрации агониста в камере. После предоставления достаточного количества времени для стабильного сжатия (3 – 5 мин), добавьте следующую концентрацию. Повторите шаги с увеличением концентрации фенилэфрин.
  8. После добавления последней дозы агониста (Фенилэфрин) тщательно промыть препарат и наполнить камеру свежим буфером Кребс. График концентрации-зависимых ответов, как увеличение доли KCl-индуцированной максимальных сокращений (рис. 3).
  9. Дополнительный Для оценки вклада NO, инкубировать препараты с ингибитором NO синтазы, L-NAME (10-4 м), за 30 минут до добавления фенилэфрин. L-NAME усиливает фенилэфрин индуцированных сокращений в спокойной подготовки мекишечных артерий (рис. 4).
    Примечание: ингибиторы или антагонисты должны иметь достаточно времени для достижения уравнивание, обычно 30 – 45 мин (быть последовательными для любого набора экспериментов).
  10. Для выполнения второй кривой реакции концентрации последовательно, мыть камеру полностью и неоднократно, чтобы удалить все предыдущие агонисты, пока никаких дальнейших изменений в тоне наблюдаются.
    Примечание: параллельные эксперименты обнажает по крайней мере два кольца, полученные из того же кровеносного сосуда агонист, один в условиях контроля и один в присутствии ингибитора (ы); в каждом кольце кривая реакции концентрации будет выполнена только один раз. Он предпочитает проводить параллельные эксперименты, так как это обеспечивает лучший контроль за действием препарата и чувствительность кровеносных сосудов. Серийные эксперименты получают кривую реакции на агонист в одном кольце; Стираем, меняем экспериментальные условия (например, добавляем ингибитор), а затем повторяем кривую реакции концентрации на одном и том же кольце. В этом случае, контроль времени необходимо, чтобы показать, что реакции препарата не из-за изменения ткани с течением времени. Никогда нельзя быть уверенным, что ткань находится в точно таком же состоянии после контакта с экспериментом по реакции концентрации. Достаточно времени (не менее 30 – 60 мин) должно быть дано, чтобы позволить сосуду сегментов вернуться к их покоя (базальной) напряженности, хотя в некоторых случаях, это не может произойти мгновенно после диссоциации агониста высокой сродства от рецепторов. Кроме того, высокий калий Кребс может быть применен между кумулятивной кривые реакции концентрации для снижения десенсибилизации28. Вспомните что большинств антагонисты нельзя помыть вне вполне, таким образом держите добавить его для остальноев эксперимента.

4. эндотелия зависимых релаксуций/сокращений

  1. Предварительный контракт с недавно смонтированный артериальный сегмент (как описано в шагах от 3,2 до 3,5). Опять же, запишите максимальный сократительной ответ/напряжение к KCl путем вычитания базового напряжения от напряжения из-за стимуляции KCl.
  2. Дополнительный Инкубировать препараты с ингибитором NO синтазы, L-NAME (10-4 м), за 30 мин до добавления U46619.
  3. Добавить предварительно рассчитанные концентрации U46619 в камере и обеспечить стабильное, устойчивое сокращение сегментов артерии.
    Примечание: сосудорасширяющие ответы индуцированные в мезекарных артерий предварительно контракту около 80% от максимальной реакции на 115 mM KCl. различные агонисты могут быть использованы для стимулирования сжатия путем активации их специфических рецепторов. Здесь сегменты кровеносных сосудов с или без PVAT предварительно заключены с U46619 (1 – 3 x 10-8 м; Таблица материалов), агонистом рецептора тромбоксана А2, чтобы вызвать стабильные и устойчивые гладких мышечных сокращений.
  4. Добавьте кумулятивные концентрации ацетилхолина (10-10 до 10-4 м) в палату органа. Концентрация-зависимые сосудорасширяющих ответы сегментов артерии представлены в процентах от U46619-индуцированных сократческих реакций (рис. 5).
    Примечание: для большинства эксперимента, следующая концентрация расслабляющий агонист должен быть добавлен сразу же, когда плато наблюдается для предотвращения отскока в напряжении. Концентрация-зависимые сосудорасширяющих ответы сегментов артерии нормализуются в процентах от U46619-индуцированных сократческих реакций, чтобы приспособиться к незначительным различиям в иннервации и диаметре между сегментами артерии (Рисунок 5). Небольшие вариоспособности в оперативности между отдельными кольцами, полученными из одного и того же кровеносного сосуда, становятся минимальными, когда статистически анализируется группа из шести или более экспериментов. При выражении ответов в процентах от собственных максимальных сокращений ткани, целесообразно использовать сопряженный анализ (например, т-тест парного студента) для сравнения реакций одного и того же типа тканей от разных животных, чтобы сравнить реакции одной ткани до и после вмешательства. При анализе влияния PVAT используется двухподобная Анова, сопровождаенная множественным сравнением теста.
  5. После добавления окончательной дозы расслабляющего агониста, удалите препарат из каждой камеры и наполните его свежим буфером Кребс. Вымойте камеру тщательно с буфером Кребс и пусть артерии стабилизировать, по крайней мере 45 мин перед выполнением каких-либо дополнительных экспериментов.

Результаты

Изучение отношений длины/напряжения для получения коэффициента нормализации к

Количество простирания, применяющего к сегменту сосуда, влияет на масштаб взаимодействия актин-миоин и, следовательно, на развитом максимал...

Обсуждение

Помимо эндотелиальных клеток, сигналы, получаемые от PVAT, играют важную роль в регуляции реакционной способности гладкого мышечного тонуса30. Здоровые pvat релизы нет и противовоспалительное адипонектин оказывать анти-сократительное воздействие на артерии, которая теряется...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была финансово поддержки грантов от научно-исследовательский грант Совета Гонконга [17124718 и 17121714], Гонконг здравоохранения и медицинских исследований фонда [13142651 и 13142641], совместные научно-исследовательский фонд Гонконга [C7055-14G], и национальный базовый Исследовательская программа Китая [973 программа 2015CB553603].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetylcholineSigma-AldrichA6625Stock concentration: 10-1 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)Sigma-AldrichN5751Stock concentration: 3 x 10-2 M
Working concentration: 10-4 M
PhenylephrineSigma-AldrichP6126Stock concentration: 10-2 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)EnzoBML-PG023-0001Stock concentration: 10-5 M
Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myographDanish MyoTechnology (DMT)620M
PowerLab 4/26ADInstrumentsML848
Labchart7ADInstruments-
Adipo-SIRT1 wild type miceLaboratory Animal Unit, The University of Hong KongCULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishesDanish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wiresDanish MyoTechnology (DMT)300331
Surgical tools

Ссылки

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  2. Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
  3. Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
  4. Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
  5. Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
  6. Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153 (1997).
  7. Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
  8. Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
  9. Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
  10. Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
  11. Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
  12. Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
  13. Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
  14. Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
  15. Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
  16. Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3 (2018).
  17. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  18. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  19. Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415 (2008).
  20. Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
  21. Gao, Y. -. J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
  22. Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
  23. Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
  24. Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
  25. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
  26. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  27. del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
  28. Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
  29. Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
  30. Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
  31. Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
  32. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  33. Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
  34. Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
  35. Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
  36. Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
  37. Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
  38. Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
  39. Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
  40. Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
  41. Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200 (2015).
  42. Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены