Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы представляем протокол для введения крикет яйца, метод, который служит в качестве основополагающего метода во многих экспериментах в крикет, в том числе, но не ограничиваемся, РНК вмешательства и геномных манипуляций.
Изменение функции генов в развивающемся организме занимает центральное место в различных видах экспериментов. В то время как чрезвычайно мощные генетические инструменты были разработаны в традиционных модельных системах, трудно манипулировать генами или РНК-мессенджером (мРНК) в большинстве других организмов. В то же время эволюционные и сравнительные подходы опираются на изучение функции генов у многих различных видов, что требует разработки и адаптации методов манипулирования экспрессией за пределами в настоящее время генетически высоченных Видов. Этот протокол описывает метод инъекций реагентов в яйца крикета, чтобы оценить влияние данной манипуляции на эмбриональное или личиночное развитие. Описаны инструкции по сбору и инъекциям яиц с помощью саженотых игл. Этот относительно простой метод является гибким и потенциально адаптируется к другим насекомым. Можно собрать и впрыснуть десятки яиц в одном эксперименте, а показатели выживаемости для инъекций только буфера улучшить с практикой и может быть выше, чем 80%. Этот метод будет поддерживать несколько типов экспериментальных подходов, включая инъекции фармакологических агентов, in vitro capped mRNA для выражения генов, представляющих интерес, двухцепочечной РНК (dsRNA) для достижения РНК-интерференции, использование кластерных регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPR) в сотрудничестве с реагентами, связанными с CRISPR, белка 9 (Cas9) для геномной модификации, и транспозируемыми элементами для генерации переходных или стабильных трансгенных линий.
Способность изменять геном или влиять на экспрессию генов в организмах является основой для разработки многих типов экспериментов, тестируя функциональную причинность. Также крайне важно для сравнительной и эволюционно-соответствующей работы, чтобы методы геномной и негеномической модификации были доступны в организмах за пределами традиционных генетических лабораторных систем моделей животных (например, Mus musculus, Danio Рерио, Drosophila melanogaster, и Caenorhabditis elegans). Будь то желание понять разнообразие организма1 или свое соответствие принципу Крога, что для каждого биологического вопроса есть организм, наиболее подходящий для его решения 2,3, способность изменять геномы или влияние экспрессии генов имеет важное значение для современных экспериментальных конструкций.
Крикет Gryllus bimaculatus является новой модельной системой. Используется в течение последнего века в нейроэтиологии экспериментов4, за последние два десятилетия стали свидетелями повышенного экспериментального интереса к крикету, особенно сосредоточены на эволюции и развитии этого организма5. Сверчок является геммиметаболовым насекомым, которое ветвит базально хорошо изученных голометаболовых насекомых, таких как D. melanogaster и Tribolium castaneum6. Из-за его полезное положение на эволюционном дереве, ученые заинтересованы в задавать современные, сложные экспериментальные вопросы в этом насекомом, что привело к растущему интересу к адаптации молекулярных инструментов для использования в G. bimaculatus.
Инъекции молекулярных реагентов в яйца крикета могут быть использованы для экспериментов по геномной модификации, а также для негеномических манипуляций с экспрессией генов в эмбрионах. Например, трансгенные G. bimaculatus, несущие вставки eGFP, были созданы с использованием транспозасии piggyBac7,8. Следователи успешно создали нокаут G. bimaculatus с использованием цинк-пальца нуклеазы (ЗФН) и транскрипции активатор-как (TAL) эффектор nucleases (TALENs) ввести двухцепочечные перерывы в конкретных геномных регионах9. Несмотря на то, что ЗФН и TALENs позволяют ориентироваться на животных за пределами систем «большой четверки», эти реагенты быстро превзошли систему CRISPR/Cas9, которая проще в использовании, эффективнее и очень гибкая10. CRISPR был использован в G. bimaculatus для производства нокаут11, а также стук в линии12,13 В дополнение к геномной модификации, dsRNA может быть введен в яйца, чтобы сбить выражение мРНК в развивающихся эмбрионов, что позволяет следователям понять роль конкретных стенограмм на протяжении всего развития14,15. Некоторые ограниченные подробности о том, как вводить яйца крикет были опубликованы ранее12.
Здесь мы описываем подробный протокол для введения ранних яиц G. bimaculatus. Этот протокол эффективен и легко адаптируется к различным лабораторным настройкам, инъекционным материалам и, возможно, к другим насекомым. В то время как дополнительные детали для проектирования и реализации геномных модификаций и нокдаун экспериментов были опубликованы в другом месте12,13, эти подходы в конечном итоге будет опираться на протокол инъекций подробно описано здесь.
1. Установка оборудования и подготовка материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с таблицей 1 и таблицей материалов для подготовки решений, реагентов и деталей оборудования.
2. Изготовление игл для инъекций
3. Коллекция и приготовление яиц
4. Подготовка микроинжектора
5. Инъекции
Сверчки легко откладывают яйца во влажный материал, и предоставление адекватного материала, такого как влажный песок или грязь, побуждает их отложить большое количество яиц. Это особенно эффективно, если сверчки сначала лишены яйцекладучий материал для 8-10 ч. Яйца, зал...
Двумя основными проблемами с этой техникой являются связанные с этим вопросы оптимального размера иглы и живучести. Хотя меньшие иглы улучшить живучесть, иглы с более узкими люминесцентными имеют большую степень капиллярных сил на работе, что делает его более вероятным, что желток буд...
Авторам нечего раскрывать.
Исследования, о которых сообщалось в рамках этого проекта, были поддержаны премией институционального развития (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под грантом P20GM10342 до HH3, а также номером премии NSF IOS-1257217 Цгэ.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
Tubing to connect air source to microinjector | |||
Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
Microwave | various | ||
Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
Camera | Leica | DMC 5400 | |
Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены