Инъекционные яйца Gryllus bimaculatus

Резюме

Здесь мы представляем протокол для введения крикет яйца, метод, который служит в качестве основополагающего метода во многих экспериментах в крикет, в том числе, но не ограничиваемся, РНК вмешательства и геномных манипуляций.

Аннотация

Изменение функции генов в развивающемся организме занимает центральное место в различных видах экспериментов. В то время как чрезвычайно мощные генетические инструменты были разработаны в традиционных модельных системах, трудно манипулировать генами или РНК-мессенджером (мРНК) в большинстве других организмов. В то же время эволюционные и сравнительные подходы опираются на изучение функции генов у многих различных видов, что требует разработки и адаптации методов манипулирования экспрессией за пределами в настоящее время генетически высоченных Видов. Этот протокол описывает метод инъекций реагентов в яйца крикета, чтобы оценить влияние данной манипуляции на эмбриональное или личиночное развитие. Описаны инструкции по сбору и инъекциям яиц с помощью саженотых игл. Этот относительно простой метод является гибким и потенциально адаптируется к другим насекомым. Можно собрать и впрыснуть десятки яиц в одном эксперименте, а показатели выживаемости для инъекций только буфера улучшить с практикой и может быть выше, чем 80%. Этот метод будет поддерживать несколько типов экспериментальных подходов, включая инъекции фармакологических агентов, in vitro capped mRNA для выражения генов, представляющих интерес, двухцепочечной РНК (dsRNA) для достижения РНК-интерференции, использование кластерных регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPR) в сотрудничестве с реагентами, связанными с CRISPR, белка 9 (Cas9) для геномной модификации, и транспозируемыми элементами для генерации переходных или стабильных трансгенных линий.

Введение

Способность изменять геном или влиять на экспрессию генов в организмах является основой для разработки многих типов экспериментов, тестируя функциональную причинность. Также крайне важно для сравнительной и эволюционно-соответствующей работы, чтобы методы геномной и негеномической модификации были доступны в организмах за пределами традиционных генетических лабораторных систем моделей животных (например, Mus musculus, Danio Рерио, Drosophila melanogaster, и Caenorhabditis elegans). Будь то желание понять разнообразие организма¹ или свое соответствие принципу Крога, что для каждого биологического вопроса есть организм, наиболее подходящий для его решения 2,³, способность изменять геномы или влияние экспрессии генов имеет важное значение для современных экспериментальных конструкций.

Крикет Gryllus bimaculatus является новой модельной системой. Используется в течение последнего века в нейроэтиологии экспериментов⁴, за последние два десятилетия стали свидетелями повышенного экспериментального интереса к крикету, особенно сосредоточены на эволюции и развитии этого организма⁵. Сверчок является геммиметаболовым насекомым, которое ветвит базально хорошо изученных голометаболовых насекомых, таких как D. melanogaster и Tribolium castaneum⁶. Из-за его полезное положение на эволюционном дереве, ученые заинтересованы в задавать современные, сложные экспериментальные вопросы в этом насекомом, что привело к растущему интересу к адаптации молекулярных инструментов для использования в G. bimaculatus.

Инъекции молекулярных реагентов в яйца крикета могут быть использованы для экспериментов по геномной модификации, а также для негеномических манипуляций с экспрессией генов в эмбрионах. Например, трансгенные G. bimaculatus, несущие вставки eGFP, были созданы с использованием транспозасии piggyBac7,⁸. Следователи успешно создали нокаут G. bimaculatus с использованием цинк-пальца нуклеазы (ЗФН) и транскрипции активатор-как (TAL) эффектор nucleases (TALENs) ввести двухцепочечные перерывы в конкретных геномных регионах⁹. Несмотря на то, что ЗФН и TALENs позволяют ориентироваться на животных за пределами систем «большой четверки», эти реагенты быстро превзошли систему CRISPR/Cas9, которая проще в использовании, эффективнее и очень гибкая^10. CRISPR был использован в G. bimaculatus для производства нокаут^11, а также стук в линии^12,13 В дополнение к геномной модификации, dsRNA может быть введен в яйца, чтобы сбить выражение мРНК в развивающихся эмбрионов, что позволяет следователям понять роль конкретных стенограмм на протяжении всего развития^14,15. Некоторые ограниченные подробности о том, как вводить яйца крикет были опубликованы ранее¹².

Здесь мы описываем подробный протокол для введения ранних яиц G. bimaculatus. Этот протокол эффективен и легко адаптируется к различным лабораторным настройкам, инъекционным материалам и, возможно, к другим насекомым. В то время как дополнительные детали для проектирования и реализации геномных модификаций и нокдаун экспериментов были опубликованы в другом месте^12,13, эти подходы в конечном итоге будет опираться на протокол инъекций подробно описано здесь.

протокол

1. Установка оборудования и подготовка материалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с таблицей 1 и таблицей материалов для подготовки решений, реагентов и деталей оборудования.

1. Навязайте расчленяющий микроскоп, чтобы увидеть яйца и направить иглу для инъекций. (На рисунке 1А показан расчленяющий микроскоп, оснащенный флуоресценцией.) Способность флуоресценции является выгодным, но не необходимым.
2. Позиция 3-осевой микроманипулятор для маневра инъекционной иглы на место(рисунок 1A).
3. Настройка микроинжектора с трубкой и держатель иглы, чтобы ввести небольшое количество материала(рисунок 1A). Дополнительно используйте педаль ноги, которая не показана на рисунке.
4. Дизайн и создать штамп для создания колодцев для яиц(Рисунок 1С) путем печати обратного желаемого шаблона, либо с 3D-принтером или лазерным гравером.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Показанная 3D печатная штампная марка составляет 4,5 см х 5 см с 128, 3 см х 1 см х 1 мм выступы для создания отдельных колодцев. Подробная информация о том, как сделать различные настраиваемые формы были опубликованы в другом месте¹⁶.
5. Подготовка 10x инъекционных буфера, HEPES буферного соля (HBS), а также фондовый раствор Tetrameththththamine Dextran красителя и хранить при 4 градусах Цельсия.
6. Подготовьте экспериментальные решения, которые будут вводиться, такие как dsRNA, CRISPR/Cas9¹², транспозируемые элементы, in vitro capped mRNA 7,^8,фармакологические агенты¹⁷, ЗФНС, или TALENS⁹.
7. Поместите двухпалую ленту на несколько слоев стандартной лабораторной ленты на слайде стеклянного микроскопа, чтобы создать платформу на 1 мм или около того над стеклянной горкой, которая будет использоваться для проведения игл для оценки.
8. Подготовьте контейнер для крикета размером около 40 см х 60 см с крышкой, обладающей сеткой, покрытым отверстием для циркуляции воздуха.
9. Добавьте продукты питания, воду и материалы для укрытия.
10. Добавьте несколько десятков здоровых мужчин и женщин взрослых сверчков. Определите взрослый крикет по наличию крыльев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон пост-воображаемых возрастов может увеличить урожайность яиц. Плотность сверчков должна быть относительно высокой, чтобы иметь возможность собрать достаточное количество яиц для эксперимента, но не настолько переполнена, что происходит каннибализм. Например, примерно два десятка здоровых сверчков, с примерно равным соотношением мужчин и женщин, в контейнере, указанном выше, должно быть достаточно для сбора около 200 яиц в течение одного-двух часов. Сверчки могут храниться при комнатной температуре, но развитие и поведение будет оптимальным, если сверчки поддерживаются в теплом (23,5-26 градусов по Цельсию), влажном (40 - 60% относительной влажности) инкубатора.

2. Изготовление игл для инъекций

1. Используйте боризикатные стеклянные капилляры с нитью (см. таблицу материалов для деталей размера). Подготовка тянуть иглы в тот же день, или до нескольких дней до инъекции будут завершены.
2. Поместите капиллярное стекло в шкив, центр стекла на нити, и затяните ручки, чтобы обеспечить стекло на месте.
3. Установите температуру шкива вблизи стеклянной температуры рампы (от -5 до 10 градусов по Цельсию).
4. Используйте одноступенчатый, высокотемпературный протокол, чтобы вытащить длинный конус с небольшим отверстием, но избежать плавления закрытых концов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, при использовании микропипетета, подробно описанного в таблице материалов, оснащенных нитью коробки, используйте следующие параметры для стекла с температурой рампы 478: Тепло 478; Вытяните 45; Vel 75; Дель 120. Оптимальные условия для производства иглы с формой, показанной на рисунке 2B, должны быть эмпирически определены каждым пользователем.
5. Bevel иглы советы в рамках подготовки к инъекциям.
6. Влажная прядильной шлифовальной машины плоскости бевелер(Рисунок 2A) с капающей водой. Используйте либо обратный осмос (RO), либо диэтилпирокарбонат (DEPC) обработанные дистиллированной воды.
7. Поместите вытащил иглы в beveler и повернуть на 20 "угол.
8. Опустите иглу, пока она просто не коснется шлифовальной плоскости и скосается в течение 2 до 3 мин.
9. Оцените скошенную иглу, поместив скошенную иглу на двухпалую ленту, которая была приклеена к слайду стеклянного микроскопа.
10. Поместите слайд, держащий иглу, на сцене сложного микроскопа, оснащенного программным обеспечением для приобретения камеры и изображения.
11. Приобретите изображение наконечника иглы, используя цель 20x.
12. Используйте программное обеспечение для визуализации для измерения внутреннего просвет диаметра иглы просто проксимот к скошенной открытия(Рисунок 2C). Оптимальный размер составляет 10 мкм и 2 мкм.
13. Откажитесь от игл, которые имеют отверстие ниже 8 мкм и выше 12 мкм.
14. Храните иглы в контейнере с крышкой, чтобы избежать пыльной. Используйте полоску воска или аналогичный материал, чтобы поднять иглы от нижней части контейнера, чтобы предотвратить нарушение советы(Рисунок 2D).

3. Коллекция и приготовление яиц

1. Увеличьте количество яиц, отложенных, лишив сверчков любого влажного материала для укладки (водяные флаконы, яичные блюда) на ночь или, по крайней мере, 8-10 ч, прежде чем пытаться собрать яйца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Так как женщины имеют возможность внутренне хранить сперму, по-разному приурочен процедура может быть необходимо, если тщательно приурочен оплодотворения экспериментально необходимо¹⁸.
2. Сделать 40 мл 1% агарозы в воде и залить в 10 см петри блюдо.
3. Поместите яичный колодец на поверхность агарозы, прежде чем она затвердеет.
4. Удалите штамп, как только агароза затвердевает, чтобы выявить скважины(рисунок 1C).
5. Заполните агарозную пластину HBS, содержащую 1% пенициллина/стрептомицина.
6. Поместите крышку на блюдо, оберните в parafilm и хранить при 4 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блюда могут храниться в течение нескольких дней при температуре 4 градусов по Цельсию, но должны быть разогреты до комнатной температуры перед использованием, чтобы избежать конденсации.
7. Сделать блюдо сбора яиц для сверчков, чтобы отложить яйца, заполнив 35 мм петри блюдо с белым песком площадка(рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Песок, указанный в таблице материалов, имеет соответствующий размер зерна. Если песчинки слишком большие, песок повредит яйца.
8. Накройте яичную тарелку квадратом бумажного полотенца, вырезаем примерно 18 см х 18 см, и поместите на верхнюю часть блюда песком. Через это бумажное полотенце накрывают заполненную тарелку водопроводной водой.
9. Наклоните чашку Петри и аккуратно сжать сверху, чтобы удалить избыток воды.
10. Tuck углы бумажного полотенца квадрат под блюдо и поместите яйцо блюдо в перевернутой крышкой, которая поможет сохранить крышку бумажного полотенца на месте.
11. Поместите яйцо блюдо в крикет бен и позволяют взрослым самкам oviposit яйца от одного до двух ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Относительно короткое время здесь гарантирует, что все яйца будут похожи на стадии развития во время инъекции. Если инъекция до клетизации важно, инъекции должны произойти в течение 14 ч от яйцеклетки отложить¹⁹.
12. Между тем, позвольте блюдо агарозы (от шага 3.6) согреться до комнатной температуры в рамках подготовки к проведению яйца для инъекции.
13. Удалите блюдо для сбора яиц, теперь содержащее свежеотложенные яйца, из корзины для крикета и удалите крышку с бумажным полотенцем. Поместите ситечко с размером поры 0,5-1 мм над стаканом емкостью не менее 500 мл(рисунок 1B).
14. Промыть содержимое яйцекладка блюдо (песок и яйца) в ситечко под аккуратно работает водопроводная вода позволяя песчинки попадают через сетку ситечко в воду в стакан ниже, но оставляя крикет яйца в корзину ситечко.
15. Заполните контейнер с дро водой и поместите его в лоток. Перевернуть ситечко над контейнером и нажмите его на блюдо, чтобы выбить яйца в воду. Яйца опустятся на дно контейнера.
16. Отрежьте кончик от P1000 pipette наконечник с ножницами, чтобы сделать отверстие примерно 3 мм в диаметре. Поместите этот совет на P1000 пипетки и использовать его для передачи яиц из контейнера в блюдо из яичной формы агарозы, передавая как можно меньше воды, как это возможно.
17. Используйте пластиковые пинцеты, чтобы выровнять яйца в колодцах агарозы заполнены HBS плюс 1% пенициллина / стрептомицина. Каждое яйцо опустится на дно отдельного колодца. Накройте крышкой чашки Петри до готовности к впрыску.

4. Подготовка микроинжектора

1. Прикрепите микроинжектор к источнику сжатого воздуха или газа(этот протокол был оптимизирован с использованием либо сжатого воздуха, либо N 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании портативного воздушного бака, заполнить, по крайней мере 75 пси. Танк потеряет давление воздуха во время инъекций и, возможно, потребуется пополнить; инъекции становятся трудными ниже 40psi.
2. Включите микроинжектор. Установите время инъекции до 0,17 с и давление до 10-15 пси.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное давление, необходимое будет зависеть от открытия иглы и должны быть определены эмпирически для каждого раунда инъекции и / или новой иглы используется.
3. Убедитесь, что ручка balance микроинжектора превращается в 0 (обычно полностью против часовой стрелки) и что микроинжектор находится под давлением и в режиме инъекций.

5. Инъекции

1. Фильтр около 500 л 10-х инъекционных буфера с помощью шприца 1 мл и 0,45 мкм шприц фильтр.
2. Смешайте инъекционные реагенты (детали, которые следуют для инъекции dsRNA подготовлены, как описано в¹²).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть целесообразным для разработки и выполнения нескольких элементов управления, особенно когда один впервые изучает эту технику. Тыкать яйца без инъекций, инъекционных буфера и красителя в одиночку, или инъекционных буфера и красителя и реагента управления (например, eGFP dsRNA) все хорошие тесты о том, как разрушительные различные элементы протокола инъекций может быть. См Рисунок 3 для живучести ряда различных элементов управления.
3. Начните с 4 мл dsRNA aliquot.
4. Добавьте 0,5 мл отфильтрованного 10-x буфера инъекций в dsRNA aliquot.
5. Добавьте 0,5 мл 50 мг/мл Тетраметил родамина Dextran раствор красителя. При работе над рассекающим областью без флуоресценции используйте вместо этого фенол Ред.
6. Храните все материалы на льду в течение периода инъекций.
7. Загрузите раствор впрыска в инъекционную иглу, используя 20 мл погрузочных наконечников и p10 pipet.
8. Нарисуйте раствор для инъекций 1,5 мл и вставьте наконечник нагрузки в широкий конец иглы для инъекций.
9. Избавьтесь от раствора как можно дальше в иглу и устраните пузырьки воздуха, мягко щелкнув; будьте осторожны, чтобы не сломать иглу.
10. Поместите блюдо из яиц под рассекающим микроскопом и выберите низкое увеличение около 10x (1x увеличение рассматривается через 10x глаз целей).
11. Вставьте иглу в инъекционный корпус и затяните.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы игла была правильно и прочно вставлена в корпус. Для этого вытащите широкий конец иглы из металлического корпуса, принося с собой кремниевые трубки в корпусе. Отрегулируйте силиконовые трубки так, чтобы стеклянный конец иглы выступает только за кремнием. Если этого не сделать, кремниевые трубки могут получить ущипнул между стеклом и металлическим корпусом, блокируя конец иглы.
12. Аккуратно вставьте инъекционный корпус с прикрепленной иглой в микроманипулятор. Будьте в курсе резкого конца иглы и будьте осторожны, чтобы она не наткнулась на поверхности и не сломалась.
13. Глядя на яйца и иглу через микроскоп, переместите иглу рядом с яйцами в верхнем левом углу сетки тарелки.
14. Нижняя игла, пока кончик входит HBS плюс 1% пенициллина / стрептомицина буферного раствора в блюде.
15. Центр иглы в поле зрения и переместить яйцо блюдо так, что игла на несколько мм ближе к краю блюда, чем яйца.
16. Не препятствуйте обзору сетки яиц с помощью иглы.
17. Установите микроскоп на фильтр, подходящий для родамина, чтобы можно было наблюдать флуоресценцию в игле и сосредоточиться на кончике иглы.
18. На микроинжекторе медленно поверните ручку BALANCE по часовой стрелке до тех пор, пока раствор инъекций не начнет просачиваться из иглы в раствор подвески. Количество баланса на экране микроинжектора начнет увеличиваться, хотя численное значение не имеет значения. Далее, поверните ручку назад против часовой стрелки немного только до тех пор, пока краситель останавливается утечки из иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно установить этот баланс каждый раз, когда используется новая игла. Без правильного набора баланса, микроинжектор будет продолжать вводить в течение некоторого времени после инъекции срабатывает. Не исключено даже, что одним нажатием кнопки впрыска с несбалансированной иглой выведет все содержимое заряженной иглы.
19. С иглой, по центром в поле зрения, переместить яйцо блюдо так, что игла направлена на яйцо, которое будет введено в первую очередь. Рекомендуется, чтобы инъекции начинались в одном углу сетки расположенных яиц, например, в верхнем левом углу.
20. Отрегулируйте увеличение примерно до 50x; при этом увеличении, одно яйцо будет заполнить большую часть поля зрения.
21. Используйте как микроманипулятор, так и руку на яичной тарелке, чтобы переместить иглу в положение для инъекции.
22. Заранее иглы с помощью микроманипулятора и вставить кончик иглы в первое яйцо, чтобы быть введены.
23. Вставьте иглу на 20-30% длина яйца от задней (тупой) конце яйца(Рисунок 1E), перпендикулярно длинной оси яйца.
24. Введите раствор либо с педалью ноги инъекций, либо с кнопкой впрыска на микроинжекторе. Небольшой болюс флуоресцентного материала внутри яйца будет означать успешную инъекцию(Рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это не редкость для некоторых желтка, которые будут извлечены из яйца во время инъекции(Рисунок 1F), и это не обязательно означает, что вводили яйцо будет нежизнеспособным.
25. Вырежай иглу из яйца. Если яйцо непреднамеренно поднял и его хорошо после опрокидки иглы, используйте небольшие щипцы, чтобы подтолкнуть яйцо обратно в его хорошо, втягивая иглу.
26. Если игла забивает во время инъекции, удалить иглу из яйца и, сохраняя иглу погружен в HBS плюс 1% пенициллина / стрептомицина раствор, охватывающий яйца, очистить засоренные иглы, используя либо clear функции или путем нажатия инъекций Кнопку.
27. Продолжая использовать ту же иглу, повторите процедуру инъекций для как можно больше яиц, как это возможно. Во-первых, это может быть только около 20 или 30 яиц, но увеличится до более чем 100 с практикой.
28. Если игла засоряется и не может быть очищена, отбросьте иглу, заполните новую иглу и начните заново (т.е. вернитесь к шагу 5.7).
29. Храните блюдо из инъекционных яиц в теплом инкубаторе (23,5-26 градусов по Цельсию), которое слегка влажно (для минимизации испарения) до тех пор, пока эмбрионы не достигнут желаемой стадии развития для анализа.
30. По крайней мере, каждые 24 ч, удалить яйца, которые больше не являются жизнеспособными(Рисунок 3A, B), и заменить подвески решение со свежим HBS плюс 1% пенициллин / streptomycin.
31. Через два-три дня после инъекции, перенесите яйца нежным пипеткой или с пластиковыми щипцами в бумажные полотенца, увлажненные HBS плюс 1% пенициллина/стрептомицина в крытом чашке Петри, чтобы продолжить развитие в теплом, влажном инкубаторе.
32. Мониторинг яйца, и удалить яйца, которые больше не являются жизнеспособными каждый день(Рисунок 3A, B).

Результаты

Сверчки легко откладывают яйца во влажный материал, и предоставление адекватного материала, такого как влажный песок или грязь, побуждает их отложить большое количество яиц. Это особенно эффективно, если сверчки сначала лишены яйцекладучий материал для 8-10 ч. Яйца, зал...

Обсуждение

Двумя основными проблемами с этой техникой являются связанные с этим вопросы оптимального размера иглы и живучести. Хотя меньшие иглы улучшить живучесть, иглы с более узкими люминесцентными имеют большую степень капиллярных сил на работе, что делает его более вероятным, что желток буд...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent dissecting microscope	Leica	M165 FC	Stereomicroscope with fluorescence
External light source for fluorescence	Leica	EL 6000
Microinjector	Narishige	IM-300	-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-
mCherry filter cube	Leica	M205FA/M165FC	Filter cube for mCherry or similar red dye will work
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R	Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)
Magnetic stand	Narishige	MMO-202ND
Pipette Holder (Needle holder)	Narishige	HD-21
Tubing to connect air source to microinjector
Egg well stamp	3D printed	custom	3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic
Microwave	various
Incubator or temperature controlled room	various		Temperatures of 23.5-26 °C are needed.
Cricket food	various		cat food or fish flakes are appropriate food.
Cricket water	vairous		Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls
Cricket shelter	arious		Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons
Glass capillary tubes	World Precision Instruments, Inc.	Item no. 1B100F-4	Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament
Micropipette puller	Flaming/Brown	Model P-97	Distributed by Sutter Instrument Co.
Beveller/Micro grinder	Narishige	Model EG-45/EG-400	EG-400 includes a microscope head
Petri dishes	CellTreat	Product code 229693	90 mm diameter
Play Sand	Sandtastik Products Ltd.	B003U6QLVS	White play sand
Agarose	American Bioanalytical	AB000972	Agarose GPG/LE ultrapure
Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers	US Kitchen Supply	Model SS-C123	Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm
Penicillin Streptomycin	Gibco by Life Technologies	Ref 15070-063	Pen Strep
Plastic tweezers	Sipel Electronic SA	P3C-STD	Black Static Dissipative, 118 mm
Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm	Nalgene	725-2545	Use with 1 mL syringe
1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip	Becton Dickinson	309602	Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work
Air tank (optional)	Midwest Products	Air Works®	Portable air tank
Rhodamine dye	Thermofisher	D-1817	dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,
20 mL loading tips	Eppendorf	Order no. 5242 956.003	epT.I.P.S. 20 μL Microloader
Compound microscope	Zeiss	Axioskope 2 plus
20x objective	Ziess	Plan-Apochromat 20x/0.75 M27
Camera	Leica	DMC 5400
Leica Application Suite  software	Leica	LAS	Version 4.6.2 used here