Иммуномаркировка дегенерации миофибра при биопсии мышц

Резюме

Описано здесь протокол для прямой иммуномаркировки некротических миофибы в мышечных криосекциях. Некротические клетки проницаемы белками сыворотки, включая иммуноглобулин G (IgG). Выявление поглощения IgG миофибарами позволяет идентификации и количественной оценки миофидеров, которые проходят некроз независимо от состояния мышц.

Аннотация

Некроз мышечных волокон (мионекрез) играет центральную роль в патогенеза нескольких мышечных состояний, включая мышечную дистрофию. Терапевтические варианты решения причин мышечной дистрофии патогенеза, как ожидается, облегчить дегенерацию мышц. Таким образом, метод для оценки и количественной степени смерти клеток в биопсии мышц необходимо. Обычные методы для наблюдения дегенерации миофипла на месте либо плохо количественные или полагаться на инъекции жизненно важных красителей. В этой статье описывается протокол иммунофлуоресценции, который окрашивает некротические миофиберы, нацеливая на иммуноглобулин G (IgG) поглощение миофиберами. Метод поглощения IgG основан на клеточных особенностях, характеризующих некротическую кончину, включая 1) потерю целостности плазменной мембраны с высвобожденными молекулярными паттернами, связанными с ущербом, и 2) поглощением плазменных белков. В поперечных сечениях, совместноиммуномаркировки миофиберов, внеклеточных матричных белков, и мыши IgG позволяет чистой и прямой идентификации миофиберов с некротической судьбой. Этот простой метод подходит для количественного анализа и применим ко всем видам, включая образцы человека, и не требует инъекций жизненно важного красителя. Окрашивание некротических миофиберов поглощением IgG также может быть сопряжено с другими совместно иммуномаркировки.

Введение

Стриженные скелетные мышцы в основном состоят из мышечных волокон (миофибы), которые отвечают за характерную добровольную контрактную функцию. Эти клетки многоядерных, пост-митотических структур, которые поддерживают механический стресс, происходящих во время сокращения. Структурная стабильность мембраны миофибра (саркольма) и ее внеклеточной матрицы имеют решающее значение для ткани гомеостаза. Спутниковые клетки составляют основную популяцию предтека мышц в зрелой скелетной мышце и существуют в состоянии покоя в здоровых мышцах. После смерти миофибра, регенерация мышц поддерживается спутниковыми клетками после миогенной программы, которая включает в себя активацию спутниковых клеток, пролиферацию, дифференциацию и синтез, чтобы в конечном итоге сформировать новые многоядерные миофибы.

Миофибра кончина может произойти в нескольких мышечных условиях, в том числе механические травмы, ишемия-реперфузии травм, или мышечной дистрофии, и это связано с некротической морфологии мертвых клеток^1,2. Некротическая смерть характеризуется быстрой проницаемостью плазменной мембраны и высвобождением клеточного содержания в внеклеточном отсеке^3. Это может быть результатом либо нерегулируемого процесса, не включающего надлежащей сигнализации клеток (т.е. случайного некроза), либо организованного внутриклеточного пути (т.е. регулируемого некроза). В миофидерах, как регулируемые^4, так и нерегулируемые⁵ процессов могут привести к некрозу. Типичным следствием мионекроза является высвобождение связанных с повреждением молекул, активируя мощный воспалительный ответ⁶. Присутствие макрофагов наблюдается на уровне около 48 ч и 72 ч после травмы⁷. Помимо своей роли в расчистке некротического мусора, они также играют важную роль в регенерации мышц^8,9.

Мышечные дистрофии (МД) представляют собой неоднородную группу патологий, которые часто являются результатом дефекта в структуре сарколеммы. Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является несовершеннолетним X-связанных заболеваний, затрагивающих примерно 1 из каждых 3500 мужских рождений во всем мире¹⁰, и это вызвано отсутствием экспрессии дистрофина в сарколемме. Хроническая дегенерация мышечной ткани у мальчиков DMD приводит к крайней мышечной слабости и ранней смертности. Воспаление в результате некротической смерти повышает цитотоксичность, и способствует мышечный фиброз и потеря мышечной функции^11,12. Лечение в настоящее время в клинических испытаниях ориентации корни мышечных дегенеративных расстройств, таких как генная терапия, как ожидается, облегчить мионекрез. Простые методы для точной количественной оценки мышечной дегенерации, следовательно, необходимы.

Несколько методов обычно используются для мониторинга потери миофибра in vivo. Измерение ферментативной активности креатина киназы (КК) в крови позволяет надежно очислить продолжающийся некроз в мышечных и сердечных тканях. На месте, гематоксилин и эозин (H и E) окрашивание является наиболее популярным методом в настоящее время используется в диагностике для оценки дегенерации регенерации ремоделирования. Тем не менее, молекулярная основа маркировки Н И Е мертвых клеток остается неясной. Кроме того, цветовые изменения, предполагающие смерть миофибра при окрашивании Н и Е, являются относительно тонкими и не способствуют надежной и воспроизводимой количественной оценке. Методы выявления фрагментации ДНК, такие как терминал deoxynucleotidyl transferase dUTP ник конец маркировки (TUNEL), несовершенно ярлык некротической смерти³. Они также плохо приспособлены для мониторинга смерти синцитиальных клеток, таких как миофибы. Инъекции жизненно важных красителей, таких как синий краситель Эвана (EBD), представляет собой полезную альтернативу для оценки миофиберов, которые потеряли целостность сарколеммы, но не обязательно удобно в некоторых экспериментальных протоколов. Например, наличие EBD в образцах крови может повлиять на результаты измерений CK, колористетрического анализа. Кроме того, внутриклеточного поглощения EBD делает совместноиммуномаркировки сложной задачей. Таким образом, представляет интерес альтернативный метод, позволяющий прямое маркировка миофибы, проходящих некроз.

Механизм действия жизненно важных красителей зависит от потери целостности плазменной мембраны в некротических миофимерах и пассивного поглощения инъекционного красителя. Аналогичным образом, некротические миофиберы усваивают белки крови, такие как альбумин, для которого EBD имеет сильное сродство^13,14, иммуноглобулин G (IgG), и IgM¹⁵. Ненормальное присутствие белков крови в myofibers поэтому представляет собой удобные маркеры для мионекроза на месте. Окрашивание этих белков может быть альтернативой для использования жизненно важных красителей.

Используя поглощение IgG в качестве маркера мионекроза на месте, этот протокол используется для оценки мышечной дегенерации в передней tibialis (TA) mdx dystrophin-дефицитных мышей. Этот метод представляет значительные преимущества перед альтернативными методами: 1) он воспроизводим и прост в своем исполнении; 2) он не требует лечения животных до сбора мышц, таких как инъекция циркулирующих жизненно важных красителей, и 3) как любой обычный иммуномаркировки, он совместим с совместной маркировки.

протокол

Эксперименты проводились в соответствии с законодательством Франции и Европейского сообщества (лицензия No 11-00010).

1. Tragacanth препарат десен

1. В стакане растворите 6 г порошка трагаканта в 100 мл деионизированной воды. Накройте фольгой и оставьте не менее 3 ч. Иногда перемешивайте вручную металлическим шпателем, так как смесь быстро становится вязкой.
2. Оставьте трагакантовую смесь на ночь на 60 градусов на водяной бане или в духовке. Тщательно запечатайте стакан, чтобы избежать высыхания. Перемешать по крайней мере один раз, прежде чем aliquoting.
3. Aliquot и хранить при 4 градусах По Цельсию в течение 2 недель.

2. Мышечная коллекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента, 4-недельный мужчина mdx мышь была принесена в жертву вывихшей шейки матки. Эта процедура не требует анестезии и является гуманным методом убийства в соответствии с местным законодательством.

1. Рассечение передней (TA) мышцы tibialis
   1. После бритья мыши ногой положите мышь на спину и прикрепите ноги на пробковую доску с помощью игл. Используя точные ножницы (или скальпель) и щипцы, удалите кожу ноги от стопы до колена, чтобы разоблачить всю длину голени и TA.
   2. С ножницами, сделать разрез между голени и TA. Это облегчит отделение TA от кости и обеспечит легкое сцепление с эпимизием. Используя точные щипцы, тщательно удалите слой эпимизия с поверхности TA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага, TA может быть более восприимчивым к сушке, которые следует избегать.
   3. В области лодыжки, изолировать сухожилие TA от других сухожилий с щипками. Аккуратно поднимите сухожилие TA, чтобы изолировать его от голени и окружающих мышц.
   4. Когда живот TA полностью отделен, удерживайте сухожилие так, чтобы только проксимальная часть мышцы TA прикреплялась к колену. Аккуратно разорвать проксимального сухожилия как можно ближе к коленной кости.
   5. Поместите TA в марлю, которая слегка смоченной с солевым раствором, чтобы избежать высыхания перед замораживанием мышцы.
2. Предварительно охладите 70–100 мл изопентана в пластиковом или политетрафтотриленном стакане, частично окунув его в жидкий азот. Дайте ему остыть до тех пор, пока изопентан в нижней части стакана не станет белым твердым.
3. На круговой кусок пробки (20 мм х 11 мм х 8 мм) поместите 0,5 мл трагакантовой резинки. Тщательно предварительно обозначите другую сторону пробки так, чтобы биопсия была правильно идентифицирована после замораживания шага.
4. Вложить TA в десну с щипками, дистального сухожилия вверх. Чтобы позволить соответствующие поперечные сечения мышцы, удерживайте мышцу своей оси перпендикулярно поверхности пробки. Качество криосекций улучшится, если биопсия не полностью встроена в десну. Разрешить по крайней мере половина TA (тендона стороны), которые будут обнаружены резинки.
5. Быстро окуните пробку со встроенной мышцей в размороженный, холодный изопентановый слой. Обратите внимание, что пробка будет плавать в жидкости изопентан. Держите образец вверх дном, как мышцы должны быть окунуты в изопентан. Оставьте образцы в изопентане около 2 мин, чтобы обеспечить полное замораживание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этого этапа, TA должны оставаться замороженными до криосекции. Храните мышцы в сухом льду перед длительным хранением в морозильной камере -80 градусов.

3. Криосекция

1. Установите температуру криостата при -25 градусов по Цельсию. Держите температуру объекта на уровне около -20 градусов по Цельсию. Исправить объект в криостате с помощью оптимальной температуры резки (OCT) соединения. Обрезать мышцы до достижения мышечного живота, а затем сократить 7'10 мкм разделов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизация температуры объекта требует не менее 10 мин.
2. Храните стеклянные слайды, используемые для сбора криосекций при комнатной температуре (RT). Соберите по крайней мере две секции на каждом слайде. Мышечные секции автоматически прилипают и оттаивают при контакте теплой стеклянной горки. Снимите слайд и держите его на RT.
3. Разрешить разделы высохнуть по крайней мере 20 мин на RT в вентилируемой среде.
4. Храните криосекции на стеклянных слайдах при -80 градусов до использования.

4. Иммуномаркировка

1. Оттепель скользит на RT, по крайней мере 15 минут в вентилируемой среде.
2. Разграничив разделы области гидрофобным пером. Разрешить гидрофобный барьер, чтобы высохнуть.
3. Зафиксировать ткань с 2% параформальдегидом в течение 10 мин во влажной камере.
4. Вымойте разделы с фосфатами буферного солья (PBS) 2x в течение 5 минут каждый.
5. Блок мышечных секций с 10% козьей сыворотки разбавленной в PBS в течение 1 ч на RT во влажной камере.
6. Инкубировать секции в течение 2 ч при РТ (или на ночь при 4 градусах Цельсия) во влажной камере с первичными антителами, разбавленными 5% козьей сыворотки. Для простого поглощения IgG маркировки в myofibers, только инкубировать разделы с кроликом антитела к мыши пан-ламинин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие антигены внеклеточной матрицы могут быть направлены до тех пор, пока они обеспечивают четкую маркировку окружающей внеклеточной матрицы миофиберов. Маркеры для регенерации мышц, воспаления или других параметров могут быть объединены до тех пор, пока антитела не подняты в хосте мыши. Микроскоп, используемый для анализа, должен включать дополнительный цвет флуоресценции.
7. Вымойте разделы с PBS 3x в течение 5 минут каждый.
8. Инкубировать разделы с красным флуоресцентным козьим поликлональным вторичным антителом к кролику IgG H и L и зеленым флуоресцентным козьим поликлональным вторичным антителам мыши IgG H и L. Инкубировать на RT в течение 45 минут во влажной камере.
9. Вымойте pbS 3x по 10 мин каждый.
10. Смонтировать разделы в флуоресцентной монтажной среде, содержащей 100 нг/мл 4 ",6-диамидино-2-фенилиноле (DAPI) и покрыть каждый слайд с крышкой.
11. Разрешить сушки на ночь при 4 градусах Цельсия до изображения.

Результаты

Миофибы окружены ламининосодержащей внеклеточной матрицей. Красное окрашивание разграничает периферию миофиферов и позволяет их идентифицировать. IgG показан зеленым цветом. Ядра окрашены DAPI и находятся синий под микроскопом. Тем не менее, ядра показаны в белом здесь...

Обсуждение

Миофибр некроз является общим следствием травматических упражнений в нормальных мышцах. Он хорошо компенсируется мощной регенеративной способностью местных мышечных прародителей. Однако, в нескольких мышечных условиях, таких как в MDs, регенеративная способность спутниковых клеток с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Circular cork disks	Pyramid Innovation	R30001-E	Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing
Cryostat	Leica	CM3050 sn34	Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers.
Dakopen	Dako	S2002	A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation
Forceps	FST	91117-10	/
Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilution: 1/500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilution: 1/500
Goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.
mdx mouse	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration
Microscope	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Embedding matrix
PFA (Paraformaldehyde)	ThermoFischer Scientific	28908	Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Dilution medium for immunolabeling
Precision scisors	FST	fst 14001-12 and fst 14001-14	Used for the muscle collection
Rabbit antibody to mouse pan-Laminin	Sigma Aldrich	L9393	Dilution: 1/1000
Tragacanth	Sigma Aldrich	G1128	Aliquots to keep at +4°C