JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель протокола состоит в том, чтобы проиллюстрировать различные анализы, связанные с вирусной записи, которые могут быть использованы для выявления кандидатов вирусных ингибиторы входа.

Аннотация

Противовирусные анализы, которые механически изучить вирусный вход уместно различить, на каком этапе оцененные агенты являются наиболее эффективными, и позволяют для выявления кандидатов вирусных ингибиторы входа. Здесь мы представляем экспериментальные подходы к идентификации малых молекул, способных блокировать инфекцию неконвертированным коксакивирусом A16 (CVA16) путем ориентации на частицы вируса или конкретные шаги в начале вирусного вступления. Анализы включают в себя время-оф-наркотик-дополнение анализа, поток цитометрии на основе вирусной связывания анализа, и вирусной инактивации анализа. Мы также представляем протокол молекулярного стыковки с использованием белков капсидов вируса для прогнозирования потенциальных остатков, на которые нацелены противовирусные соединения. Эти анализы должны помочь в выявлении кандидата противовирусных агентов, которые действуют на вирусный вход. Будущие направления могут исследовать эти возможные ингибиторы для дальнейшего развития лекарственных средств.

Введение

Заболевания рук, ног и рта (HFMD) – это заболевание, чаще всего вызываемые коксакивирусом A16 (CVA16) и энтеровирусом 71 (EV71) у детей младшего возраста. В последнее время в Азиатско-Тихоокеанском регионе наблюдается значительный подъем в CVA16-индуцированной HFMD. Хотя симптомы могут быть мягкими, тяжелые осложнения могут возникнуть, которые влияют на мозг и сердце, с потенциальной летальностью1,2. В настоящее время для CVA16 не существует лицензированных противовирусных препаратов или прививок, и поэтому существует настоятельная необходимость в разработке противовирусных стратегий по пресечению будущих вспышек и связанных с ними осложнений.

CVA16 является неконвертированный вирус, который имеет icosahedral capsid собраны из pentamers, что каждый содержит 4 структурных белков, а именно VP1, VP2, VP3, и VP4. Окружающая каждая пятикратная ось в пентамаке является "каньон" области, которая показывает, как депрессия и известен своей ролью в рецепторе связывания3. На дне этого каньона находится гидрофобный карман в регионе VP1, который содержит натуральный жирный лиганд под названием сфингозин (SPH). Сотовые рецепторы, такие как человеческий P selectin гликопротеин лиганд 1 (PSGL-1) и мусорщик рецепторов класса B 2 (SCARB2), было предложено играть роль в вирусной связывания, вытесняя этот лиганд, который приводит к конформационным изменениям капсида и последующее выброса вирусного генома в клетку-хозяина4,5,6. Выявление возможных ингибиторов, которые блокируют последовательные события в процессе вирусного вступления может обеспечить потенциальные терапевтические стратегии против CVA16 инфекции.

Шаги в жизненном цикле вируса могут быть вскрыты с помощью экспериментальных подходов в качестве мишеней, чтобы помочь определить режим конкретных противовирусных агентов. Анализ времени добавления препарата исследует эффект лечения препарата в разное время во время вирусной инфекции, включая предварительное вступление (добавлено до вирусной инфекции), вступление (добавлено одновременно с вирусной инфекцией) и после вступления (добавлено после вирусной инфекции)7. Воздействие может быть оценено с помощью стандартного налета анализ путем количественной оценки количества вирусных бляшек, образуются в каждом из условий лечения. Поток цитометрии основе вирусной связывания асссе определяет, если препарат предотвращает вирусное вложение в клетки-хозяина. Это достигается путем изменения температуры с 37 градусов по Цельсию, при котором происходит большинство вирусных инфекций человека, до 4 градусов по Цельсию, где вирионы могут связываться с поверхностью клетки-хозяина, но не могут войти в клетки7. Частицы вируса, связанные с клеточной мембраной, затем количественно определяются с помощью иммуностоинга против вирусных антигенов и оцениваются цитометрией потока. Вирусная инактивация анализ, с другой стороны, помогает оценить потенциальные физические взаимодействия препарата со свободными частицами вируса, либо экранирование или нейтрализации virions, или вызывая агрегации или конформационные изменения, которые делают их неактивными для последующие взаимодействия с поверхностью клетки-хозяина во время инфекции8,9. В этом эксперименте, вирусный инокулум разрешается сначала инкубировать с препаратом, прежде чем разбавленной титрировать препарат до заражения монослойной клетки хозяина и выполнения стандартного зубного налета асссее8. Наконец, молекулярная стыковка является мощным инструментом для прогнозирования потенциальных мест взаимодействия наркотиков на поверхности вириона, включая вирусные гликопротеины от окутанных вирусов и вирусные капсидные белки от неконвертированных вирусов, с помощью вычислительных Алгоритмы. Это помогает механически определить цели способа действия препарата и предоставить полезную информацию, которая может быть дополнительно проверена вниз по течению анализов.

Недавно мы использовали описанные выше методы для выявления противовирусных соединений,которые эффективно блокировали инфекцию неохваченным CVA16 9. В этом вопросе описаны и обсуждены подробные протоколы, которые были использованы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные культуры и вирусные инфекции должны проводиться в сертифицированных капюшонах биобезопасности, которые подходят для уровня биобезопасности обрабатываемых образцов. Два танина класса малых молекул хебулагиновой кислоты (CHLA) и punicalagin (PUG), которые наблюдались эффективно блокировать CVA16 инфекции9, используются в качестве примеров кандидата ингибирующих агентов. Для основных принципов в методах вирусологии, распространение вируса, определение вируса титр, и понятия бляшки формирования единиц (PFU) или множественность инфекции (МВД), читатель ссылается на ссылку10.

1. Культура клеток, подготовка вируса, подготовка соединения и совонки цитотоксичность

  1. Клетки рабдомиосаркомы человека (РД) являются клетками-хозяевами, разрешительными для инфекции CVA1611. Выращивайте RD-клетки в 10 мл модифицированной среды Орла (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), 200 U/mL пенициллина G, 200 мкг/мл стрептомицина и 0,5 мкг/мл амфотерицина В в т-75 фляги при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубаторе.
  2. Подготовка CVA16 путем распространения вируса в клетках RD и определить вирусный титр в PFU/mL. Для оптимизированного протокола, пожалуйста, обратитесь к ссылке11.
  3. Подготовьте испытательные соединения и элементы управления с помощью соответствующих растворителей: например, растворите CHLA и PUG в диметилсульфодокси (DMSO). Для всех этапов инфекции базальная среда состояла из DMEM плюс 2% FBS и антибиотиков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация DMSO в тестовых соединений лечения равна или ниже 0,25% в экспериментах; 0,25% DMSO включен в качестве отрицательного контроля лечения в анализы для сравнения.
  4. Выполните анализ цитотоксичности испытательных соединений на RD-клетках с помощью жизнеспособности клеток, определяющих реагент, такой как XTT ((2,3-метокси-4-нитро-5-сульфофенил-5-фениламино)-углеродил-2H-тетразолий гидроксид). Для получения подробного протокола, пожалуйста, обратитесь к ссылке12. Определите концентрацию цитотоксичности испытательных соединений с помощью аналитического программного обеспечения, такого как GraphPad Prism в соответствии с протоколом производителя. Концентрации наркотиков, которые не оказывают существенного влияния на жизнеспособность клеток (95% жизнеспособных клеток), используются для оставшейся части исследования.

2. Время-оф-наркотик-дополнение Ассай

  1. Оценить влияние препаратов на клетки-хозяина до вирусной инфекции (предварительное лечение)
    1. Семена RD-клеток в 12-колодцах при плотности посева 2 х 105 клеток/хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатордля для получения монослой.
    2. Лечить RD-клетки с тестовыми соединениями в нецитотоксических концентрациях (определяется со ступени 1,4) в 1 мл базального объема носителя на 1 ч или 4 ч.
    3. Вымойте клетки с 1-2 мл PBS перед добавлением 50 PFU/well вируса в базальной среде (окончательный объем инокулума составляет 300 л) на 1 ч. Рок пластины каждые 15 минут.
    4. После инфекции, мыть монослой снова с помощью PBS, затем наложение с 1 мл базальных носителей, содержащих 0,8% метилцеллюлозы для дальнейшей инкубации при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатора.
    5. После 72 ч инкубации удалите накладные носители и промойте скважины с помощью 2 мл PBS.
    6. Закрепите скважины с помощью 0,5 мл 37% формальдегида в течение 15 мин.
    7. Удалите супернатант и снова помойте с помощью PBS.
    8. Пятно скважин с помощью 0,5 мл 0,5% кристаллофийно-фиолетового раствора. Затем удалите пятнового раствора в течение 2 мин и промойте колодцы мягким потоком воды перед высыханием воздуха.
    9. Посчитайте вирусные бляшки, поместив пластину на коробку с белым светом. Рассчитать процент (%) CVA16 инфекции следующим образом: (Средний ) бляшки вирус-препарат / Средний ) налета вирус -DMSO контроль)
  2. Оценить эффект одновременного добавления лекарств и вируса (совместное добавление)
    1. Семена RD-клеток в 12-колодцах при плотности посева 2 х 105 клеток/хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатордля для получения монослой.
    2. Лечить RD-клетки с испытательными соединениями в соответствующих концентрациях и 50 PFU/well CVA16 (окончательный объем инокулума составляет 300 кл) одновременно в течение 1 ч. Рок пластины каждые 15 минут.
    3. Вымойте клетки с 1 мл PBS, а затем наложить с 1-2 мл базальных носителей, содержащих 0,8% метилцеллюлозы для дальнейшей инкубации при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатора.
    4. Пятно вирусных бляшек с кристаллофийным после 72 ч после инфекции и определить% CVA16 инфекции, как описано выше.
  3. Оценить эффект медикаментозного лечения после вирусного вступления (после инфекции)
    1. Семена RD-клеток в 12-колодцах при плотности посева 2 х 105 клеток/хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатордля для получения монослой.
    2. Прививать RD-клетки с 50 PFU/well CVA16 (окончательный объем инокулума составляет 300 л) на 1 ч. Рок пластины каждые 15 минут.
    3. Вымойте скважины 1-2 мл PBS и налейте клетки с базальными носителями, содержащими 0,8% метилцеллюлозы и соответствующие концентрации испытательных соединений.
    4. Пятно вирусных бляшек с кристально фиолетовой и рассчитывать после 72 ч после инфекции и определить% CVA16 инфекции инкубаций, описанных выше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все PBS смает осторожно, чтобы избежать подъема клеток.

3. Поток цитометрии основе связывания ассе

  1. Семена RD-клеток в 12-колодцах при плотности посева 2 х 105 клеток/хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатор для достижения монослой.
  2. Предварительно охладите монослой клеток при 4 градусах по Цельсию на 1 ч.
  3. Заразить RD-клетки CVA16 (MOI No 100) при наличии и отсутствии испытательных соединений в течение 3 ч при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните вирусную прививку на льду и последующую инкубацию в холодильнике 4 градусов по Цельсию для поддержания температуры при температуре 4 градусов по Цельсию, что позволяет вирусную связывание, но не вход.
  4. Удалить вирус инокулум и промыть один раз с 1-2 мл ледяной PBS.
  5. Поднимите клетки, добавив 1 мл ледяного буфера диссоциации к скважинам на льду в течение 3 мин, прежде чем собирать клетки и повторно приостанавливать их в ледяном потоке цитометрии буфера (1x PBS плюс 2% FBS).
  6. Дважды вымойте клетки с помощью ледяного цитометрии и зафиксировать клетки с 0,5 мл 4% параформальдегида в течение 20 минут на льду.
  7. Вымойте клетки с помощью PBS, чтобы удалить любые несвязанные или слабо связанные вирусы, а затем пятно клеток с 1 мл анти-VP1 антитела (1:2,000; разбавленные в PBS, содержащие 3% BSA) на льду в течение 1 ч, а затем инкубации со вторичным Alexa 488-конъюгированных анти-мышь IgG (1:250; разбавленный в PBS, содержащий 3% BSA) на льду в течение 1 ч. Выполните PBS смыляет (3 раза) после каждого лечения антителами.
  8. Resuspend клетки в 0,5 мл ледяного потока цитометрии буфера и выполнять циклометрический анализ потока цитометр с помощью стандартных процедур. Представляйте данные в гистограммах с использованием связанного с этим программного обеспечения и квантитировать для представления барного графика.

4. Вирусный инактивации Ассай

  1. Выполните вирусную инактивацию, как описано ранее12, используя следующие условия:
    - Стартовая концентрация 106 PFU/mL CVA16.
    - RD-клеточные монослои в 12-колодных пластинах от плотности посева 2 х 105 клеток/колодца.
    - 50-кратное разбавление для титрирование из лекарственных соединений в результате чего окончательная концентрация вируса 50 PFU/ хорошо.
    - Мыть шаги с использованием 1-2 мл PBS.
    - Наверсы в средствах массовой информации, содержащей 0,8% метилцеллюлозы.
  2. Выполните окончательное считывание вирусной инфекции с использованием кристально фиолетового окрашивания вирусных бляшек процедуры, как описано выше.

5. Молекулярный стыковочный анализ

  1. Скачать 3D молекулы испытательных соединений из PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Если молекулы не имеют 3D-структуры загружены, загрузите 2D структуры или используйте последовательность строк SMILES и преобразуйте в 3D молекулы через молекулярную программу (например, CORINA).
  2. Скачать вирусную биологическую сборочную единицу от RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) и подготовить модель вирусной структуры с помощью биокомпьютерной программы (например, UCSF Chimera). Например, в случае CVA16 зрелая кристаллическая структура virion (PDB: 5C4W)3, удалить растворители из файла PDB, заменить неполные боковые цепи с использованием данных из библиотеки Dunbrach 2010 Rotamer, и добавить водороды и заряды в структуру как ранее сообщалось13. Стыковочные мишени могут быть любыми соответствующими вирусными белками для предполагаемого анализа с информацией о биологической сборке (Protein Data Bank).
  3. Док-тест соединений на подготовленный вирус единицы, используя, например, UCSF Chimera, и анализировать выходные файлы с визуализацией программного обеспечения (например, Autodock Vina, PyMol):
    1. Загрузите файл испытательного соединения в UCSF Chimera как «лиганд» и выполните слепую стыковку, выбрав весь подготовленный вирусный белок в качестве «рецептора». Используйте компьютерную мышь или трекпад, чтобы изменить размер объема поиска на весь "рецептор". В "Расширенных опциях" позволяет максимально еколичество режимов связывания. Стыковочные рамы будут автоматически ранжированы от самой высокой до самой низкой привязки энергии.
    2. (Необязательно) В дополнение к слепой стыковке, ограничить стыковки на вирусный белок в регионах, представляющих интерес, полученных от слепых результатов стыковки с помощью мыши или трекпад снова уменьшить объем поиска (например, 100 х 100 х 100 евро). Этот шаг помогает подтвердить результаты слепой стыковки и увеличивает специфичность.
    3. Используйте молекулярную графическую систему (например, PyMol) для анализа положения связывающих режимов путем загрузки стыковочного файла. Найти полярные контакты от соединения к вирусному белку, выбрав «лиганд» и идентифицируя полярные контакты с вариантом «к любым атомам»; изучить результаты.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Время-оф-наркотик-дополнение анализ указан на рисунке 1 и показывает влияние от лечения с использованием малых молекул CHLA и PUG на CVA16 инфекции либо предварительно вирусной записи (предварительное лечение), во время вирусного вступления (совместное доба?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом докладе мы описали протоколы, которые полезны для идентификации противовирусных кандидатов, нацеленных на вирусную запись, в частности против неконвертированных CVA16. Анализы разработаны таким образом, чтобы вскрыть ранние события во время вирусной записи, что полезно для уточн?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарны доктору Джошуа Бекхэму (Joshua Beckham) из Техасского университета в Остине за техническую поддержку с помощью молекулярной стыковки. Это исследование было частично поддержано за счет финансирования со стороны Министерства науки и техники Тайваня (MOST107-2320-B-037-002 до C.-J.L. и L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 и MOST107-2320-B-038-034-MY3 в Л.-Т.Л.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydeSigmaAL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgGInvitrogenA11029
Amphotericin BGIBCO15290-018
Anti-VP1 antibodyMerck-MilliporeMAB979Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter CytometerBeckman CoulterFC500
CorinaMolecular Networks GmbH
Crystal violetSigmaC3886-100G
DMEMGIBCO11995-040
DMSOSigmaD5879
FBSGIBCO26140-079
FormaldehydeSigmaF8775
Graphpad PrismGraphPad
Heparin sodium saltSigmaH3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-basedSigmaTOX2
MethylcelluloseSigmaM0512-100G
PBS pH 7.4GIBCO10010023
Penicillin-StreptomycinGIBCO15070-063
PyMolSchrödinger
UCSF ChimeraUniversity of California, San Francisco

Ссылки

  1. Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
  2. Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
  3. Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
  4. Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
  5. Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
  6. Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
  7. Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
  8. Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187(2013).
  9. Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162(2018).
  10. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  11. Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
  12. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124(2015).
  13. Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
  14. Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65(2017).
  15. Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149PyMolUCSF Chimera

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены