Генетическое картирование различий термотерпимости между видами дрожжей Сахаромицес с помощью геномно-широкого взаимного анализа гемизигоси

Резюме

Взаимная гемизигоity через секвенирование (RH-seq) является мощным новым методом для картирования генетической основы черта разница между видами. Бассейны гемизиготов генерируются транспозонным мутагенезом, и их пригодность отслеживается за счет конкурентного роста с использованием высокой последовательности. Анализ полученных данных выявляет гены, лежащие в основе этой черты.

Аннотация

Главная цель современной генетики – понять, как и почему организмы в дикой природе отличаются фенотипом. На сегодняшний день, поле продвинулось в основном на прочность связи и ассоциации картирования методов, которые прослеживают связь между вариантами последовательности ДНК и фенотипа через рекомбинантные потомство от спаривания между отдельными лицами вида. Эти подходы, хотя и мощные, не очень хорошо подходят для различия между репродуктивно изолированных видов. Здесь мы описываем новый метод для рассеивания генома в ширину естественной вариации черт, которые могут быть легко применены к несовместимым видам. Наша стратегия, RH-seq, является реализацией взаимного теста гемизигот. Мы использовали его для выявления генов, ответственных за поразительный высокий рост температуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae по отношению к его сестра видов S. paradoxus. RH-seq использует транспозонный мутагенез для создания пула взаимных гемизиготов, которые затем отслеживаются через высокотемпературную конкуренцию с помощью высокой пропускной способности секвенирования. Наш RH-seq рабочий процесс, как изложены здесь обеспечивает строгий, беспристрастный способ вскрыть древние, сложные черты в подающий надежды дрожжевой кладе, с оговоркой, что ресурсоемкие глубокого секвенирования необходимо для обеспечения геномного покрытия для генетического картирования. По мере снижения затрат на секвенирование этот подход открывает большие перспективы для использования в будущем в эукариотах.

Введение

С самого начала поля, она была главной целью в генетике, чтобы понять механистическую основу вариации между дикими особями. По мере того как мы сопозываем локусы, лежащие в основе интересующей черты, возникающие гены могут быть немедленно использоваться в качестве мишеней для диагностики и лекарств, и могут пролить свет на принципы эволюции. Отраслевой стандарт в этом направлении заключается в том, чтобы проверить связь между генотипом и фенотипом среди населения через связь или ассоциации¹. Мощные, как эти подходы, они имеют одно ключевое ограничение- они полагаются на большие панели рекомбинантных потомство от крестов между межплодными лицами. Они не имеют смысла в изучении видов, которые не могут спариваться, чтобы сформировать потомство в первую очередь. Таким образом, поле было мало возможностей для беспристрастного вскрытия черт различия между репродуктивно изолированных видов².

В этой работе мы сообщаем о технических основах нового метода, RH-seq³, для генома масштаба обследований генетической основы вариации черты между видами. Этот подход является массово параллельной версией взаимного теста гемизиготе^4,5, который был впервые задуман как способ оценки фенотипических эффектов аллельных различий между двумя генетически различными фонами на частности, локус(рисунок 1A). В этой схеме, два расходящихся лиц сначала спариваются, чтобы сформировать гибрид, половина которого генома исходит от каждого из соответствующих родителей. На этом фоне генерируются несколько штаммов, каждый из которых содержит прерванную или удаленную копию аллеля локуса каждого родителя. Эти штаммы являются hemizygous, поскольку они остаются diploid везде в геноме, за исключением локуса интересов, где они считаются гаплоидными, и называются взаимными, поскольку каждый не хватает только аллеля одного родителя, с его оставшимся аллелем, полученным из другого родителя. Сравнивая фенотипы этих взаимных штаммов гемизигот, можно сделать вывод, способствуют ли варианты последовательности ДНК в манипулируемом локусе черту интереса, так как варианты в локусе являются единственной генетической разницей между взаимными гемизигот штаммов. Таким образом, можно связать генетические различия между видами с фенотипической разницы между ними в хорошо контролируемой экспериментальной установки. На сегодняшний день применение этого теста было в рамках кандидата-гена, то есть, случаи, в которых гипотеза уже в руках, что естественные изменения в кандидат локус может повлиять на черту.

В следующем, мы выкладываем протокол для генома масштаба взаимной гемизигосности экрана, используя дрожжи в качестве модели системы. Наш метод создает геномное дополнение мутантов гемизигота, генерируя жизнеспособные, стерильные гибриды F1 между видами и подвергая их транспозонному мутагенезу. Мы объединяем гемизиготы, измеряем их фенотипы в анализах на основе секвенирования и проверяем различия в частоте между клонами бассейна, несущими аллели двух родителей данного гена. Результатом является каталог локусов, на которых варианты между видами влияют на черту интереса. Мы реализуем rh-seq рабочий процесс, чтобы выяснить генетическую основу термопереносимости различия между двумя начинающими видами дрожжей, Saccharomyces cerevisiae и S. paradoxus, которые разошлись 5 миллионов лет назад⁶.

протокол

1. Подготовка копилк-содержащей плазмиды для преобразования

1. Полоса из одной колонии Штамм кишечной палочки укрывательство плазмид pJR487 на LB и carbenicillin агар пластины. Инкубировать в течение 1 ночи при 37 градусах Цельсия или до появления отдельных колоний.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описание того, как плазмид pJR487 был клонирован можно найти в нашей предыдущей работе³.
2. Прививать 1 л lb и карбенициллин на 100 мкг/мл с одной колонией кишечной палочки, содержащей pJR487 в 2 L стеклянной колбе. Расти на ночь при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин до насыщения (OD₆₀₀ и 1,0).
3. Очистите плазмидную ДНК от культуры с помощью крупномасштабного плазмидного подготовительного комплекта в соответствии с опубликованным протоколом производителя (см. Таблицу Материалов для деталей). Выясните ДНК после 10-минутной инкубации с 5 мл элюционного буфера, прогретого до 37 градусов по Цельсию.
4. Измерьте количество и качество плазмидной ДНК с помощью спектрофотометра (подробнее см. Таблицу Материалов).
5. Повторите шаги 1.2 - 1.4 до того, как в общей сложности не будет не менее 11 мг плазмидной ДНК при коэффициенте A_260:A280, по крайней мере 1,8, изолированы. Это может занять несколько подготовители, в зависимости от эффективности.
6. Смешайте все плазмиды preps вместе в одну трубку и довести общий объем до 20 мл с elution буфера или воды. Измерьте окончательное количество и качество снова с спектрофотометром. Концентрация плазмиды должна быть не менее 538 нг/Л в этом окончательном объеме 20 мл. Если концентрация выше 538 нг/Л, разбавьте плазмид буфером elution или водой до 538 нг/Л. Плазмид может храниться при 4 градусах Цельсия до нескольких недель до использования.

2. Создание пула нецелевых генома всей взаимной гемизиготы

1. Подготовка гибридных дрожжевых клеток для трансформации
   1. Полоса из JR507 от -80 градусов морозильной камеры склада деформации в отдельных колоний на YPD агар пластины. Инкубировать при 26 градусах Цельсия в течение 2 дней или до появления колоний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: JR507 является гибридным штаммом, сделанным через одноклеточный спаривание гаплоидных спор S. cerevisiae DBVPG1373 и S. paradoxus No1 (с помощью тетрад-рассечения микроскопа)³.
   2. Прививать 100 мл жидкой YPD в стеклянной колбе 250 мл с одной колонией JR507 и встряхнуть при 28 градусах Цельсия, 200 об/мин в течение 24 часов, или до тех пор, пока не будет достигнута стационарная фаза.
   3. На следующий день измерьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD₆₀₀) ночной культуры. Создайте новую культуру, разбавляя некоторых ночных культур свежей жидкой YPD в новую стеклянную колбу объемом 1 л до_{OD 600} от 0,2 и объемом 500 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример расчета обратного разбавления, если ночная культура имеет OD₆₀₀ из 5.0, где C является оптической плотностью, а V объемом:
      
      Таким образом, 20 мл насыщенной ночной культуры будет добавлено к 480 мл жидкой YPD, чтобы сделать в общей сложности 500 мл культуры на OD₆₀₀ из 0,2.
   4. Повторите шаг 2.1.3 еще три раза, чтобы сделать в общей сложности четыре 500 мл культур на OD₆₀₀ из 0,2 в четырех 1 l стеклянные колбы, используя ту же ночь культуры для всех четырех новых культур. Инкубировать их все при 28 градусах по Цельсию в течение 6 часов (2-3 поколения) встряхивая при 200 об/мин.
   5. Объедините две из 500 мл культур для создания культуры 1 l. Объедините оставшиеся две культуры 500 мл, чтобы создать еще 1 l культуры. На данный момент, Есть две 1 L культур. Каждая из этих культур 1 L будет подвергаться преобразованию с pJR487 в следующих шагах.
2. Преобразование pJR487 в гибридные дрожжевые клетки
   1. Разделите каждую из культур 1 L на двадцать 50 мл aliquots в 20 пластиковых конических труб в общей сложности 40 труб. Отложите 20 трубок и выполните следующие шаги на 20 трубах за один раз.
   2. Центрифуга каждая из двадцати труб в течение 3 мин на 1000 х г, чтобы гранулы дрожжевых клеток. Отбросьте супернатант.
   3. Приготовь каждый гранулы с 25 мл стерильных H₂O путем вихря. Центрифуга в течение 3 мин при 1000 х г. Отбросьте супернатант.
   4. Отрежь каждый гранулы с 5 мл 1x TE, 0,1 М LiOAc буфера вихрем. Центрифуга в течение 3 мин при 1000 х г. Отбросьте супернатант.
   5. Повторите шаг 2.2.4. В то время как клетки центрифугирования, подготовить по крайней мере 120 мл раствора 39,52% полиэтиленгликоль, 0,12 М ЛиОАк и 1,2x Tris-EDTA буфер (12 мм Tris-HCl и 1,2 мМ EDTA). Хранить на льду.
   6. Чтобы подготовить плазмид ДНК для преобразования, сначала кипятить 4 мл ДНК спермы лосося при 100 градусах по Цельсию в течение 5 мин и немедленно охладить его на льду в течение 5 мин. Затем смешайте 20 мл pJR487 (получено в разделе 1) в концентрации 538 нг/Л с 4 мл охлажденных ДНК спермы лосося для общего объема 24 мл. Держите на льду до использования.
   7. Добавьте 600 л плазмидной ДНК, смешанной с ДНК спермы лосося, поверх каждой клеточной гранулы. Не resuspend еще.
   8. Добавьте 3 мл раствора PEG-LiOAc-TE, сделанного в шаге 2.2.5 к каждой грануле. Resuspend гранулы путем pipetting вверх и вниз и вихря.
   9. Инкубировать каждую трубку в течение 10 минут при комнатной температуре.
   10. Тепловой шок каждой трубки в течение 26 минут в водяной бане установлен до 39 градусов по Цельсию.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Каждые несколько минут, инвертировать каждую трубку, чтобы предотвратить клетки от урегулирования на нижней части трубки.
   11. Центрифуга каждая трубка в течение 3 мин при 1000 х г. Отбросьте супернатант и отдохните каждую гранулу в 10 мл YPD путем вихря. Объедините все двадцать трубок в новую стеклянную колбу. Общий объем ячеек должен сосчитываться 200 мл.
   12. Перенесите 66,6 мл ячеек в новую стеклянную колбу объемом 1 л и доведите до объема 500 мл с жидким YPD. Повторите еще два раза, чтобы использовать все 200 мл преобразованных клеток. Измерьте OD₆₀₀ каждой новой культуры 500 мл (ожидайте_{OD 600} от 0,35-4).
   13. Встряхните все три фляги при 28 градусах по Цельсию в течение 2 часов, чтобы восстановиться (1 поколение) при 200 об/мин.
   14. Добавьте 0,5 мл 300 мг/мл G418 к каждой из трех колб, к конечной концентрации 300 мкг/мл G418 и положить обратно, чтобы встряхнуть при 28 градусах По Цельсия, 200 об/мин.
       ПРИМЕЧАНИЕ: До этого шага преобразованные гибридные клетки восстанавливались после трансформации. После добавления G418, присутсвие plasmid pJR487 выбрано для. Любые клетки, которые не занимались плазмидом во время трансформации, начнут умирать.
   15. Повторите шаги 2.2.2 - 2.2.14 с остальными 20 коническими трубками клеток. На данный момент должно быть шесть 1 l стеклянные колбы, каждый с 500 мл клеток с G418 добавил.
   16. Инкубировать все шесть колб клеток при 28 градусах Цельсия, встряхивая при 200 об/мин, в течение примерно 2 дней или до тех пор, пока в каждой колбе не будет достигнут OD₆₀₀ из 2,3 евро. Объедините все шесть колб вместе, чтобы создать единую культуру.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя все ячейки в этой культуре не будут использоваться в ступенях вниз по течению, цель использования таких больших объемов заключается в том, чтобы создать как можно больше уникальных событий преобразования, как это возможно и нормализовать любые предубеждения через одну трансформацию, объединяя их все Вместе.
   17. Используйте культуру, созданную в 2.2.16, чтобы привить две новые колбы 1 l с 500 мл YPD и G418 (300 мкг/мл) к OD₆₀₀ из 0,2. Там будет оставшихся культуры, которые могут быть отброшены.
   18. Инкубировать обе колбы 1 л при 28 градусах Цельсия в одночасье, с тряской при 200 об/мин, пока каждый не достигнет_{OD 600} из 2,2 евро (3,5 поколения). Объедините обе культуры в единую культуру и снова измерьте OD₆₀₀ объединенной культуры.
       ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, культура должна быть почти полностью состоит из клеток укрывательство плазмид pJR487. В части популяции клеток транспон PiggyBac будет перенесен из плазмиды в геном транспозасом, выраженным плазмидом. Однако продолжающееся выражение транспозазии может привести к транспозиции в ходе отбора, что затмит связь между генотипом и фенотипом. Цель следующих нескольких шагов состоит в том, чтобы выполнить контротбор против присутствия плазмиды, чтобы убедиться, что больше нет выражения транспозасии. Полученный пул представляет собой смесь клеток с транспозоном или без нее, интегрированных в геном, но только клетки, содержащие транспозон, обнаруживаются на последующих этапах картирования. Время в преобразовании, во время которого транспозаза выражается, прежде чем плазмид кодирования теряется, может регулировать вероятность того, что данный клон после мутагенеза гавани более одного транспозона вставки. Частота этих, которые проявляются как "вторичные" мутации в анализе любого одного гена за один раз, может быть оценена путем массивирования определенного числа колоний после мутагенеза, а затем объединения их ДНК и последовательности,подтверждающей количество независимой вставки позиции в бассейне.
   19. Центрифуга 25 мл этой культуры в течение 3 мин при 1000 х г. Рассчитайте количество общих OD₆₀₀ единиц ячеек, которые находятся в 25 мл (см. пример расчета ниже). Отбросьте супернатант и отразите достаточно H₂O, чтобы создать клеточную подвеску 1,85 OD_600/mLпутем вихря.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Пример расчета для повторного подвески клеток в воде, если OD₆₀₀ комбинированной культуры было 2.2:
       
       Таким образом, после вращения 25 мл клеточной культуры и отбрасывания супернатанта, добавьте достаточно H₂O в клетки, чтобы довести общий объем клеток и воды до 29,7 мл (так как клеточные гранулы также будут иметь объем, добавьте менее 29,7 мл H₂O).
   20. Используя стеклянные бусинки, пластина 1 мл перекрываемых клеток в воде на каждом из 12 больших квадратных полных синтетических агарных пластин с 5-FOA. Инкубировать каждую тарелку при 28 градусах По Цельсию в течение 1-2 дней или до тех пор, пока газон не образуется на тарелке.
   21. Используя небольшие стерильные squeegees, соскребать клетки от каждой из 6 пластин и в трубку с 35 мл стерильной воды. Повторите с другими 6 пластин в общей сложности две трубки клеток и воды. Объедините все клеточные суспензии в одной трубке. Измерьте OD₆₀₀ этой подвески, используя воду в качестве пробела. Доведитеконцентрацию од. 600/мл клеток до 44,4 OD₆₀₀ единиц/мл с водой. По нашему опыту, эффективность транспозиционирования (доля клеток КАНЗ, которые являются URA-) составляет в среднем 50%.
   22. Определите количество -80 градусов по Цельсию запасы ячеек для хранения. Каждый aliquot может быть использован в будущем для одного эксперимента.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, как много времени генерации пула, хранить несколько флаконов в случае случайного неправильного использования или для выполнения повторных экспериментов. 20-30 акций являются разумным числом.
   23. Каждый морозильной камеры будет содержать 40 OD₆₀₀ единиц клеток в 1 мл 10% DMSO. Добавьте 900 кл клеток к 100 Л DMSO. Повторите для общего числа созданных запасов морозильной камеры. Храните каждый на -80 градусов по Цельсию для будущего использования.

3. Выбор взаимных гемизиготов в объединенном формате

1. Оттепель из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию один аликот объединенных взаимных гемизиготей из раздела 2 при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте aliquot сидеть долго при комнатной температуре, как только он оттаивает, использовать его немедленно.
2. Используйте весь 1 мл aliquot, чтобы привить 150 мл жидкости YPD в стеклянной колбе 250 мл. Измерьте OD₆₀₀ этой культуры, а затем инкубировать при 28 градусах Цельсия, встряхивая при 200 об/мин, в течение 7 часов, или до тех пор, пока культура не проиграет 2-3 удвоения численности населения. На данный момент культура готова к использованию для прививок культур, проходящих отбор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пример расчета: Если OD₆₀₀ из первоначальной колбы меры 0,25, инкубировать культуру, пока она не достигнет OD_600, по крайней мере 1.0. Если какие-либо точки выборки желательно на "Время-ноль" (T-0), как способ исследовать популяцию гемизигот до выбора, клеточные гранулы могут быть приняты в настоящее время центрифугирование 5-10 мл культуры на гранулы на 1000 х г в течение 3 мин, отбрасывая супернатант и замораживание при -80 градусах По Цельсию.
3. Используйте выращенный бассейн гемизиготе для привить культуры для выбора в подходящей схеме репликации, как при высокой температуре (39 градусов по Цельсию), так и при разрешительной температуре (28 градусов по Цельсию). Как минимум, создать три биологические культуры отбора репликации при каждой температуре, в общей сложности шесть культур отбора.
   1. Создайте каждую культуру выбора с общим объемом 500 мл в стеклянной колбе объемом 2 л с жидким YPD и привить к OD₆₀₀ 0.02. Встряхните каждую культуру выбора при 100 об/мин при 28 градусах или 39 градусах по Цельсию до 6-7 удвоений популяции (соответствующие OD₆₀₀ из 1,28-2,56 евро). Постарайтесь как можно ближе сопоставить окончательный OD₆₀₀ всех культур отбора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культура выбора при 28 градусах Цельсия будет расти быстрее, чем культуры отбора при 39 градусах Цельсия. Следовательно, культуры отбора при 39 градусах Цельсия будут проводить в инкубаторе более длительный период времени. Продолжайте следующие шаги с каждой колбы, как она становится готовой, независимо от общего количества часов, проведенных в инкубаторе. По нашему опыту, культурам при 28 градусах или 39 градусах по Цельсию потребовалось 12 или 18 часов, соответственно, чтобы достичь ОД в 2,0 евро. Длинные выборы могут иметь преимущество усиления небольших фитнес-эффектов, но также позволяют de novo фоновые мутации возникать, что приведет к шуму в окончательное распределение фитнесов через транспозонных мутантов в любом одном гене / аллеле. Таким образом, важно ограничить время отбора в эксперименте RH-seq.
4. Урожай клеточных гранул из каждой культуры отбора. Рассчитайте объем, необходимый для получения 7 OD₆₀₀ единиц клеток и центрифугна на 1000 х г в течение 3 мин по крайней мере четыре гранулы этого объема от каждой культуры отбора в качестве технических репликаторов для подготовки и секвенирования библиотеки (см. разделы 4 и 5 , ниже). Откажитесь от супернатанта и храните при -80 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пример, если колба выбора имеет окончательный OD₆₀₀ из 2.0:
   

4. Строительство библиотеки Tn-seq и секвенирование Illumina для определения обилия транспозонных мутантов гемизиготы

1. Оттепель на льду каждая клетка гранулы из раздела 3, который будет секвенирован.
2. Изолировать полную геномную ДНК (gDNA) из каждой клетки гранулы с помощью дрожжевого комплекта очистки gDNA в соответствии с инструкциями производителя. Повторное увеличение ДНК в 50 ql элуционного буфера нагревается до 65 градусов по Цельсию.
3. Количественное количество гДНК от каждой гранулы с помощью фторметра. Минимальное общее количество гДНК, необходимое для каждой клеточной гранулы для создания библиотеки секвенирования следующего поколения (NGS) для Tn-seq с использованием следующей процедуры составляет 1 мкг.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Менее 1 мкг гДНК может быть использовано для создания библиотеки, но окончательное количество и качество библиотеки будет страдать.
4. Следуйте установленному протоколу для создания библиотек Tn-seq⁷. Обратите внимание на следующую соответствующую информацию, которая является уникальной для этого протокола:
   1. После стрижки gDNA, конечный ремонт и перевязка адаптера, усиливают gDNA, содержащий транспосон через ПЦР. Для этого ПЦР используйте следующий передний и обратный грунтовку, которые специфичны для транспозонных транспозонов PiggyBac и NGS, соответственно:
      Вперед (N - случайный нуклеотид)
      5' ATGATACGGCGACCGAGATTACACTACTTCTTCCCTACACGACGCG
      CTCTTGATCTNNNNNНАГЦААТАТТТЦААГААТГКГГГГЦЦААТ 3'
      Обратный (участок Ns представляет собой уникальный 6-б. индекс, используемый для мультиплексирования. Ниже приведена информация об индексах)
      5' CAAGCAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTCAG
      ACGTGTGTCTCTCTCTGATCT 3'
   2. Используйте включенные шаги очистки с размером селективного бисера, чтобы свести к минимуму долю клонированных фрагментов в окончательной библиотеке, которая была бы слишком коротка, чтобы включить mappable геномную последовательность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как минимальные требования репликации до сих пор для культур ы отбора, будет 24 отдельных образцов gDNA для секвенирования. Учитывая текущие затраты на секвенирование, маловероятно, что каждый образец будет работать сам по себе. Чтобы объединить образцы на одной полосе, создайте несколько обратных грунтов, каждый из которых имеет уникальный 6-базовый индекс пары. Образцы с различными индексами могут быть объединены в одну и ту же полосу секвенирования и разделены вычислительно после этого.
5. Последовательность одного конца 150 bp читается из каждой библиотеки с использованием технологий NGS через восемь полос.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество требуемых секвенирования в значительной степени зависит от качества библиотек, подготовленных на предыдущем этапе (т.е. доля ДНК в библиотеке, фактически содержащей транспозовую ДНК, представляющую ДНК, поступающую от взаимных гемизиготов). Этому способствуют два основных фактора. Во-первых, поскольку ячейки без интегрированного транспосона не противопоставить во время создания пула, каждая культура будет смесью ячеек с транспозоном и без нее. Во-вторых, даже в геномах транспососодержащих взаимных гемизиготов большая часть генома не является транспозоном, содержащей последовательность, и эта гДНК неизбежно будет частью подготовки библиотеки. Целью окончательного усиления ПЦР транспозонно-содержащей ДНК является увеличение соотношения транспозонно-содержащей ДНК к этим двум источникам фоновой гДНК. Чем эффективнее это усиление, тем выше доля считывателей будет использоваться в анализе ниже по течению. Чем ниже качество библиотек, тем больше последовательности потребуется сделать, так как все большая доля считывания не будет содержать транспосон ДНК и не будет полезна. С учетом вышеуказанных ограничений восемь полос последовательности были способны отслеживать взаимное изобилие гемизигот в разумной степени. Более последовательное ирование позволит проделать более глубокий анализ.

5. Сопоставление местоположения вставок транспосонов и анализ RH-seq

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий анализ данных был выполнен с помощью пользовательских скриптов Python (найденных в Интернете в https://github.com/weiss19/rh-seq), но может быть переделан с помощью других языков сценариев. Ниже изложены основные шаги в этом процессе. Выполните следующие шаги на каждом отдельном файле репликации, если не указано, что они объединены.

1. Обрезка адаптера последовательности от считывает и отделить каждого репликации читает в соответствии с индексом.
2. Найти считывания, содержащие транспозонно-геномные соединения. Для достижения этой цели, поиск в каждом чтении за последние 20 базовых пар транспозона, CAGACTATCTTTTTAGGTAAA. Отбросьте все считывания, не содержащие эту последовательность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, доля считывает отображение до конца транспосона составляет 83-95%.
3. Обрезка остальных, транспозонсодержащих читает содержать только последовательность вниз по течению 3 'конец транспосона. Отображая эту последовательность в геном дрожжей, определить геномный контекст вставки транспосона для каждого чтения (шаг 5.4 ниже).
4. Используйте BLAT или эквивалентный инструмент отображения для картирования последовательности вниз по течению транспозона к S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus No1 гибридный геном (имя скрипта: map'и'pool-BLAT.py).
   1. Отбросьте любые считывания, для которых существует менее 50 базовых пар пригодной для упокоительности последовательности ниже 3' конца транспосона. Короткие последовательности трудно сопоставить однозначно.
   2. При использовании BLAT используйте следующие параметры: идентификация No 95, размер плитки - 12.
   3. Создайте базовый гибридный геном для картирования путем сопоставления последних версий эталонных геномов S. cerevisiae S288c и S. paradoxus CBS432.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базовый аннотационный файл, описывающий геномные границы отдельных генов в гибридном геноме, можно найти в репозитории Github, перечисленных выше (Filename: YS2-CBS432-плазмид-чистый). Только использование читает, какая карта в одном месте в гибридном геноме (т.е. уникальны либо для S. cerevisiae или S. paradoxus). Ожидается единая частота событий вставки в геноме; распределение вставок позиций по геномам сообщается в другом месте³.
5. Подсчет общее количество считывает отображение каждого уникального места вставки транспозона, который мы выводим все возникли из клеток одного клона-мутанта вставки транспозона. Сумма всех таких значений из одной библиотеки называется общим количеством отображеных считываемых для этой библиотеки.
6. В тех случаях, когда существует несколько вставок, отображающих в пределах 3 базовых пар друг от друга, объедините их все в одну точку вставки, назначив все считывания в одном месте с самым высоким количеством прочитано. Это значение, n_{вставить}, представляет обилие, что вставка клона в клетке гранулы, из которых gDNA была секвенирована. На данный момент, будут списки n_{вставки}, каждый обилие уникальной отображечной вставки транспозона, один список для каждой клетки гранулы секвенированных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Транспозон PiggyBac вставляет в последовательности TTAA в геноме, последовательность 4 базовых пар. Таким образом, мы делаем вывод, что вставки отображения в пределах 3 базовых пар друг от друга должны были возникнуть из того же сайта TTAA.
7. Так как будет немного различное количество общего количества считываемых, поступающих из каждой последовательной библиотеки, нормализовать значения n_{вставки} во всех файлах, если они должны быть сравнены. Сделайте это путем табуляции общее количество отображеных считываний из каждой отдельной библиотеки, n_{гранулы}, и принять в среднем все n_{гранулы} во всех библиотеках, lt;n_{гранулы} Умножьте каждую_{n вставку} в данных отдельной библиотеки по соотношению_гранулы lt;n,_чтобы вычислить_{вставку,}нормализованное изобилие данного клона вставки транспозона.
   
   Кроме того, размер библиотеки можно оценить с помощью доступных инструментов, таких как DESeq2⁸ (имя скрипта: total'reads и-normalize.py).
8. Табулировать набор всех вставок, отображаемых во всех библиотеках. Для вставок, найденных в некоторых библиотеках, но не в других, установите_{вставку} No 1 для расчетов ниже по течению.
9. Фильтр считывания, чтобы найти те вставки, которые попадают в гены в соответствии с аннотационным файлом (имя скрипта: удалить-NC и plasmid-inserts.py).
10. Для каждой уникальной вставки, рассчитать среднее изобилие через технические репликации каждого выбора (каждая культура либо на 28 градусов по Цельсию или 39 градусов по Цельсию), lt;a_insertsgt;_{технические} (имя сценария: combine'tech'reps'V2.py).
11. Для каждой уникальной вставки, рассчитать среднее изобилие через биологические репликации каждой температуры, lt;a_{вставки,}итог , взяв среднее всех lt;a_{вставки}при каждой температуре. В то же время, рассчитать коэффициент вариации для каждой вставки, CV_{вставки, всего} через lt;a_{вставки(название} сценария: combine'bio'reps.py).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, для каждой температуры, 28 градусов по Цельсию и 39 градусов по Цельсию, есть список уникальных вставок транспосонов, их среднее изобилие и коэффициент вариации между биологическими репликациями для каждого. Эти данные для нашего эксперимента сообщается в другом месте³.
12. Фильтр улистивай список всех вставок для тех, которые имеют, либо на 28 кВ или 39 градусов по Цельсию, lt;a_insertsgt;_всего 1,1, и CV_{вставки},_всего 1,5 (имя сценария: filter'inserts.py).
13. Для каждой уникальной вставки, вычислить журнал₂(злт;_{вставка}йgt;_{всего,28 КК} / lt;a_insert'gt;_{всего,39 КК}). Это значение представляет собой "термопереносимость" данного клона-мутанта-вставки транспозона (название сценария: fitness'ratios.py).
14. Сортировать все уникальные вставки по гену и аллель (S. cerevisiae или S. paradoxus), и табулировать количество вставок в каждом аллеле. Фильтр генов так, что только гены, которые имеют по крайней мере 5 вставок в каждом аллеле анализируются (Название сценария: организовать и-фильтра генов.py).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько уникальных вставок через каждый аллель позволяют более точное измерение термотерпимости, что взаимные гемизигота. Снижение количества вставок, необходимых для аллеля возможно, но поставит под угрозу точность этой меры и увеличит многократное бремя тестирования, позволяя больше генов, которые будут проверены. Кроме того, отфильтровывание генов с слишком небольшим количеством вставок на аллель поможет уменьшить влияние на результаты испытаний любого отдельного клона гемизигота, укрывающего вторичную мутацию сайта, которая дает очень разрозненный фенотип.
15. Для каждого гена, оставшегося в наборе данных после вышеуказанной фильтрации, сравните термопереносимости (коэффициенты_{журнала} 2) всех вставок в Аллеле S. cerevisiae с теми, которые есть в аллеле S. paradoxus с помощью теста Mann-Whitney U. Кроме того, можно было бы внедрить регрессионную модель, адаптированную из DESeq2⁸ (имя скрипта: mann'whitney-u.py).
16. Правильные значения pдля нескольких испытаний с использованием метода Бенджамини-Хохберга.
17. Гены со значительными значениями p(скажем, 0,01) являются кандидатами на гены, важные для различий в термопереносимости между двумя видами.

Результаты

Мы спаривали S. cerevisiae и S. paradoxus, чтобы сформировать стерильный гибрид, который мы подвергли транспозозому мутагенезу. Каждый мутагенизированный клон был гемизиготом, диплоидным гибридом, в котором нарушается один аллель одного гена(рисунок 1A,

Обсуждение

Преимущества RH-seq по сравнению с предыдущими статистически-генетическими методами в несколько раз. В отличие от анализа связей и ассоциаций RH-seq обеспечивает разрешение картирования с одним геном; как таковой, он, вероятно, будет значительным полезным даже в исследованиях изменения чер...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-2 plasmid Gigaprep kits	Zymo Research	D4204	The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA.
10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA)	Any	N/A	Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use.
1M LiOAc	Any	N/A	Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use.
300 mg/mL Geneticin (G418)	Gibco	11811023
52% polyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma	1546547	Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer
Autoclaved LB liquid broth	BD Difco	244620	Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use.
Carbenicillin stock in water (100 mg/mL)	Any	N/A	Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use.
Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA]	5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco	5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919
DMSO	Any	N/A
E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid)	N/A	N/A	Request from Brem lab.
Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)	N/A	N/A	Request from Brem lab.
Illumina Hiseq 2500			used for SE-150 reads
Large shaking incubators with variable temperature settings	Any	N/A
LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL)	Agar: BD Difco	Agar: 214010	Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying.
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit Fluorimeter	Thermo Scientific	Q33240
Salmon sperm DNA	Invitrogen	15632011
Water bath at 39°C	Any	N/A
Yeast fungal gDNA prep kit	Zymo Research	D6005
Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media	BD Difco	Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750	Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving.
YPD + G418 agar plates (300 μg/mL)	Agar: BD Difco	Agar: 214010	Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying.
YPD agar plates	Agar: BD Difco	Agar: 214010