Электропорация Метод для In Vivo Доставка плазмидной ДНК в взрослых зебрафиш теленефалион

Резюме

Здесь представлен метод электропорации для плазмидной доставки ДНК и эпендимолиальной маркировки клеток во взрослой теленцефалоне зебры. Этот протокол является быстрым и эффективным методом визуализации и отслеживания отдельных эпендимолиальных клеток и открывает новые возможности для применения электропорации к широкому спектру генетических манипуляций.

Аннотация

Электропорация является методом трансфекции, при котором электрическое поле применяется к клеткам для создания временных пор в клеточной мембране и повышения ее проницаемости, тем самым позволяя различным молекулам быть введены в клетку. В этой работе, электропорация используется для введения плазмиды эпиддийных клеток, которые выстраиваются в желудочковой зоне взрослого теленцефалона зебры. Часть этих клеток показывает свойства стволовых клеток и генерирует новые нейроны в мозге зебры; Поэтому, изучение их поведения имеет важное значение для определения их роли в нейрогенезе и регенерации. Внедрение плазмидов с помощью электропорации позволяет долгосрочно маркировать и отслеживать одну эпендимолиальную клетку. Кроме того, плазмиды, такие как рекомбиназа cre или Cas9, могут быть доставлены в одиночные эпендимолиальные клетки, что позволяет рекомбинации генов или редактирования генов и предоставляет уникальную возможность оценить функцию автономного гена клетки в контролируемой, естественной Среды. Наконец, этот подробный, пошаговой протокол электропорации используется для успешного внедрения плазмидов в большое количество одиночных эпиддимолиальных клеток.

Введение

Зебрафиш являются отличными моделями животных для изучения регенерации мозга после травмы раны. По сравнению с млекопитающими, на эволюционной лестнице, менее развитые виды, такие как зебра, как правило, показывают более высокие показатели составного нейрогенеза и более широкие области взрослого нейронных стволовых клеток жительства, что приводит к постоянному генерации новых нейронов во всем большинство областей мозга во взрослой жизни. Эта особенность, как представляется, коррелируют со значительно более высокой регенеративной способности зебры по сравнению с млекопитающими¹, как зебрацы имеют замечательный потенциал для эффективного создания новых нейронов в большинстве моделей травмы мозга изучены^{2, 3,4,5,6,7,8}. Здесь изучается теленцефалон зебры, так как это область мозга с выдающимся нейрогенезом во взрослом возрасте. Эти зоны взрослого нейрогенеза гомологичны к нейрогенным зонам в взрослом мозге млекопитающих^9,10,11.

Обильные нейрогенные области в теленефалион зебрафиш присутствуют из-за существования радиальной глии, как клетки или клетки эпиндимолии. Эпендимоглиальные клетки действуют как резиденты взрослых нервных стволовых клеток и несут ответственность за генерацию новых нейронов как в нетронутой и регенерирующей мозга^3,5. Эксперименты по отслеживанию линии показали, что желудочковая эпендимолия реагирует на травмы, затем размножается и генерирует новые нейробласты, которые мигрируют на место поражения^5. Из-за вечной природы теленефалиона зебры, эпендимолиальные клетки выстраиваются в линию поверхности желудочка и строят стенку желудочков. Стенка желудочковых суставов образуется слоем эпидимальных клеток(рисунок 1A). Важно отметить, что зебрафиш ependymoglia воплощают характеристики как млекопитающих радиальной глии и эпендимальных клеток. Длинные радиальные процессы являются типичной особенностью клеток радиальной глии, в то время как клеточные расширения и плотные соединения (а также их желудочковые положения) являются типичными особенностями эпендимальных клеток^12,13,14. Таким образом, эти клетки называются эпедимолийными клетками.

Чтобы следить за поведением in vivo одиночных эпедимолиальных клеток во время регенерации, они должны быть надежно помечены. Различные методы in vivo маркировки клеток для флуоресцентной микроскопии были ранее описаны, такие как эндогенные репортеры или липофильные красители¹⁵. Эти методы, в отличие от электропорации, могут потребовать более длительных периодов времени и часто не дают возможности маркировки одной клетки или постоянного долгосрочного отслеживания. Электропорация, однако (кроме одноклеточной маркировки), предлагает возможность введения новой ДНК в клетку-хозяина. Кроме того, по сравнению с другими методами передачи ДНК в клетки, электропорация была продемонстрирована как один из самых эффективных методов^16,17,18,19.

Представлен протокол электропорации, который был усовершенствован с целью маркировки отдельных эпеничных клеток во взрослом теленефалии зебры. Этот протокол позволяет маркировки одного эпенимолитальных клеток для того, чтобы следовать за ними в течение длительного периода²⁰ или манипулировать конкретными путями в клеточной автономной манере^21,22.

протокол

Все животные, используемые в этом протоколе, содержались в стандартных условиях, и эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами ЕС и правительства Верхней Баварии (55,2-1-54-2532-0916).

1. Подготовка плазмидной смеси для электропорации

1. Разбавить плазмид интереса в стерильной воде и добавить быстрый зеленый раствор пятен запаса (1 мг/мл). Убедитесь, что конечная концентрация плазмиды составляет 1 мкг/л. Добавить пятно в концентрации не более 3%, так как его единственной целью является цвет раствора и визуализация инъекций желудочков.
2. После того, как подготовлены, смешать плазмидный раствор, пипетка вверх и вниз несколько раз или по пальцам постукивания. Хранить при комнатной температуре (RT) до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для коэлектропосации двух плазмидов в одну и ту же клетку убедитесь, что концентрация каждой отдельной плазмиды, используемой в смеси, составляет не менее 0,8 нг/Л с молярным соотношением 1:1 для получения эффективности совместного электропора 80%-90%.

2. Подготовка к инъекционному и электропорации

1. Подготовьте стеклянные капилляры (внешний диаметр 1 мм, внутренний диаметр 0,58 мм), необходимые для инъекции в иголку потянув аппарата.
2. Для того, чтобы ввести правильное количество плазмиды (см. выше), потяните капилляр при температуре 68,5 градусов с двумя легкими и двумя тяжелыми весами (см. Таблицу Материалов для спецификаций шкива).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае использования другого шкива, калибруйте капилляр, чтобы обеспечить соответствующий объем электропорации смеси.
3. Вручную установите инъекционное устройство под давление инъекций 200 hPa (путем поворота ручки Pi) и постоянное давление 0 hPa. Вручную установите время впрыска в ручной режим и контролируйте давление педалей ноги.
4. Установите электропорационное устройство в режим "LV" с пятью импульсами при 54-57 V (по 25 мс каждый с интервалом 1 с интервалом). Подключите электроды к устройству.
5. Приготовьте один аквариум с чистой рыбной водой, где рыба будет пробуждена от анестезии после процедуры электропорации. Произваем воду, сохраняя воздушный камень, прикрепленный к воздушному насосу в течение всего периода восстановления, пока рыба полностью не пробудится.
6. Возьмите обычную кухонную губку и сделайте продольную нарезку в губке, чтобы держать рыбу во время инъекций и процедуры электропорации (см. предыдущую публикацию³).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кухонная губка должна регулярно мыть или обмениваться для того, чтобы удалить потенциальные токсичные химические вещества.
7. Поместите небольшое количество высокопроводящего многоцелевого ультразвукового геля рядом с инъекционной и электропорационной установкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит адекватную электрическую проводимость и, следовательно, распределение электропорированных клеток по всей теленефалии.

3. Анестезия зебрафиш

1. Перед анестезией подготовьте запасной раствор анестезии с 0,2% MS222 в дистиллированной воде и отрегулируйте рН до 7 с буфером Tris-HCl. Разбавить этот запас 1:10 (т.е. до 0,02% MS222) с помощью рыбной воды.
2. Обезболилизировать рыбу, удерживая их в этом рабочем растворе до тех пор, пока движение тела и жабры не утихнет (обычно в течение нескольких минут).

4. Плазмидное решение инъекций

1. Заполните подготовленный стеклянный капилляр 10 злицу плазмидного раствора с помощью микрозагрузчика советы. Избегайте образования пузырьков воздуха внутри капилляра.
2. Меню нажмите/Измените капилляр на устройстве впрыска. Вставьте и закрепите иглу в держатель иглы.
3. Под стереомикроскопом с увеличением 3,2x или 4x, вырезать только кончик капилляра с помощью тонкой части щипцы. Переключите устройство впрыска из режима Change Capillary в режим inject, а затем нанесите давление педалей ноги, чтобы убедиться, что плазмидное решение легко выходит из иглы и беспрепятственно.
4. Перенесите рыбу из цистерны с животноводством в контейнер (пластиковую коробку) с обезболистым раствором. Подождите несколько минут, пока движение жабры спадает.
5. Поместите рыбу в предварительно увлажненный губки с нижней стороны вверх. Выполните все следующие шаги инъекции под стереомикроскоп, чтобы обеспечить точность процедуры.
6. Используя рассекающий микронож из нержавеющей стали с 40 мм режущей кромкой и толщиной 0,5 мм, создайте небольшое отверстие в черепе рыбы на задней стороне теленефалии(рисунок 1B),рядом с границей с оптическим тектумом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен тщательно, так как отверстие должно быть очень маленьким и поверхностным, проникая исключительно в череп, чтобы избежать повреждения мозга.
7. Наклоните рыбу по мере необходимости и ориентируйте кончик стеклянного капилляра к черепу под правильным углом, чтобы облегчить проникновение капиллярного наконечника через отверстие.
8. Вставьте кончик капилляра через отверстие в черепе тщательно, пока он не достигнет телецефалического желудочка (см. Рисунок 1B). Это потребует проникновения через слоем царных эпиндимальных клеток. Будьте особенно осторожны, чтобы не вставить капилляр слишком глубоко, чтобы избежать контакта с тканью мозга. Держите капилляр точно между полушариями, оставаясь внутри желудочка сразу после пронизы соднего эпендимального слоя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень деликатный шаг. Точность этой процедуры улучшается с помощью пигментации мутантных линий, таких как медный²⁴, что позволяет лучше визуализации положения стеклянных капилляров во время инъекции.
9. С капиллярным наконечником внутри желудочка вводят плазмидный раствор, применяя давление с педалью ноги примерно на 10 с, что соответствует примерно 1 злу плазмидного раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При изменении иглы шкив, капилляры или инжектор, система должна быть откалибрована для того, чтобы всегда доставить 1 л плазмидного раствора. Калибровка может быть выполнена путем измерения диаметра капли плазмида, выбрасываемого в минеральное масло (например, парафина) и последующего расчета объема капли. После 10 с инъекций, не должно быть 1 qL плазмидной жидкости выбрасывается в минеральное масло.
10. Подтвердите успех предыдущего шага, наблюдая за распространением жидкости по всему желудочку.

5. Электропорация

1. Удалите рыбу из инъекции настройки в то же время держа его в губке.
2. Погрузите внутреннюю сторону кончика электродов в ультразвуковой гель.
3. Обложка рыбы теленефалии с небольшим количеством ультразвукового геля.
4. Расположите голову рыбы между электродами, поместив положительный электрод на брюшной стороне головы рыбы и отрицательный электрод на стороне доза(рисунок 1С),сохраняя при этом тело рыбы в губке. Это определяет направление потока тока, необходимого для электропората эпендимолиии, расположенной в субвентрикулярной зоне.
5. Нажимаете электроды мягко и точно против теленцефалона(рисунок 1С). Администрирование тока с педалью ноги. Держите электроды на месте до тех пор, пока все пять импульсов не будут закончены.

6. Восстановление рыбы

1. Пусть рыба восстановить в заранее подготовленных, непрерывно атерированный бак, пока он не проснется. Лидокаин гель может быть применен на черепе для того, чтобы облегчить любые возможно развитых боли.

Результаты

Описанный метод электропорации позволяет доставлять плазмидную ДНК в эпендимолиальные клетки, которые расположены поверхностно в теленецефалии зебры и чуть ниже зеронного эпендимального клеточного слоя(рисунок 1A).

Е...

Обсуждение

Этот протокол электропорации является надежным методом in vivo для маркировки отдельных эпиндимольных клеток. Протокол может потребоваться дальнейшая адаптация для обозначения других типов клеток, таких как нейроны или олигодендроциты. Для достижения успешной маркировки можно использ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258-25G	For coloring plasmid solution
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Electrode Gel
Equipment
Air pump	TetraTec APS 50, 10l-60l		Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1 mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Injection device	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Model No: G100-4
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micro-knife	Fine Science Tools	10056-12
Joystick micromanipulator	Narishige Japan	MN - 151
Needle holder	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device	Narishige Japan	Model No: PC-10	The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes	Greiner Bio-One International	633161