JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Макрофаги, особенно первичные макрофаги, являются сложными для трансфекта, поскольку они специализируются на обнаружении молекул несобственного происхождения. Мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию первичных макрофагов с мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды.

Аннотация

Макрофаги являются фагоцитическими клетками, специализирующимися на обнаружении молекул несобственного происхождения. С этой целью они оснащены большим массивом рецепторов распознавания образов (PRRs). К сожалению, это также делает макрофаги особенно сложными для трансфекта, как трансфекционный реагент и транс-инфицированных нуклеиевых кислот часто признаются PRRs как не-самостоятельно. Поэтому трансфекция часто приводит к активации макрофагов и деградации трансинфицированных нуклеиновых кислот или даже к самоубийству макрофагов. Здесь мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию основных макрофагов, таких как перитонеальные макрофаги (ТЧ) и макрофаги костного мозга (BMDM) с мРНК в пробирке, транскрибированной из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. С помощью этого простого протокола, трансфекционная скорость около 50-65% для ТЧ и около 85% для BMDM достигаются без цитотоксичности или иммуногенности наблюдается. Мы подробно описываем генерацию мРНК для трансфекции из конструкций ДНК, таких как плазмиды и процедура трансфекции.

Введение

Макрофаги являются фагоцитическими клетками, которые специализируются на обнаружении, глотании и деградации микробов, апоптотарных клеток и клеточного мусора. Кроме того, они помогают организовать иммунную реакцию, выделяя цитокины и хемокины и представляя антигены Т-клеток и В-клеток. Макрофаги также играют важную роль во многих других процессах, таких как заживление ран, атеросклероз, опухолевие и ожирение.

Чтобы быть в состоянии обнаружить не-самостоятельно молекул, таких как патогенные молекулярные модели (PAMPs) и вне места молекул, таких как повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPs), макрофаги оснащены большим массивом рецепторов распознавания образов (PRR)1. К сожалению, это также делает макрофаги особенно сложными для трансфекта2 как трансфекционный реагент3 и трансинфицированных нуклеиновых кислот4,5,6,7часто признаются PRRs как не-самостоятельно. По этой причине трансфекция макрофагов с использованием химических или физических методов8 обычно приводит к активации макрофагов и деградации транс-инфицированных нуклеиных кислот или даже в самоубийстве макрофагов с помощью пироптоза, формы запрограммированной гибели литикических клеток, вызванной после распознавания цитосолильных PAMPs/DAMPs, таких как ДНК или чужая РНК9. Биологическая трансфекция макрофагов с использованием вирусов, таких как аденовирусы или лентивирусы в качестве переносчиков часто более эффективна, но строительство таких вирусных векторов занимает много времени и требует биобезопасности уровня 2 оборудования10,11.

Таким образом, хотя макрофаги являются предметом интенсивных исследований, анализ их функций на молекулярном уровне затруднен, поскольку один из важнейших инструментов молекулярной биологии, трансфекция нуклеиновой кислоты строит для экзогенного выражения белки, вряд ли применимы. Это часто заставляет исследователей использовать макрофаговые клеточные линии, а не добросовестные макрофаги. Приложения для трансфекции конструкции нуклеиновой кислоты включают экспрессию мутировавших или помеченных белковых версий, переэкспрессию конкретного белка, повторное выражение белка в соответствующем фоне нокаута и экспрессию белков других видов (например. , Крем рекомбиназы или руководство РНК и Cas9 для целевого нокаута гена).

Здесь мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию (обычно трудно трансфектные) первичные макрофаги, то есть мурин перитонеальных макрофагов (PM) и макрофагов костного мозга (BMDM) с мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. Важно отметить, что в пробирке транскрибируется мРНК, генерируемых с помощью этого протокола содержит естественные модифицированные нуклеозиды 5-метил-CTP и псевдо-UTP, которые снижают иммуногенность и повышают стабильность4,6,7,12,13. Кроме того, 5'-концы в пробирке транскрибируется мРНК дефосфорилированы антарктической фосфатазы, чтобы предотвратить признание RIG-I комплекс14,15. Это сводит к минимуму врожденное иммунное распознавание в пробирке транскрибированной мРНК. С нашим простым в выполнении протокола, скорость трансфекции между 50-65% (перитонеальные макрофаги (PM)) и 85% (BMDM) достигаются в то время как, что важно, нет цитотоксичности или иммуногенности наблюдается. Мы подробно описываем (i) как иммунологически заглушенная мРНК для трансфекции может быть получена из конструкций ДНК, таких как плазмиды и (ii) сама процедура трансфекции.

протокол

Макрофаг изоляция от мышей была проведена в соответствии с Законом германии о защите животных в соответствии с Комитетом по этике Кельнского университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняй все ступени в перчатках. Выполняй все этапы трансфекции под ламинарным капотом для предотвращения загрязнения клеток. Перед работой с мРНК очистите все инструменты, такие как пипетки и каждую поверхность с 70% этанола и/или RNAse-унизительным сурфактантом(Таблица Материалов). Убедитесь, что все реакционные трубки не являются РНС и стерильны. Используйте только стерильную, безРНК воду для разбавления. Исключительно использовать пипетки советы с фильтрами. Изменение пипетки советы после каждого шага пипетки.

1. Поколение шаблона ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон ДНК для транскрипции in vitro mRNA с помощью этого протокола должен содержать промоторную последовательность T7, позволяющую стыковку РНК-полимераза. Если плазмида, содержащая последовательность ДНК интересуемого белка, уже содержит правильно сориентированный промоторный последовательность T7 непосредственно вверх по течению последовательности интереса, необходимо выполнить линейную линию плазмиды (см. шаг 1.1.). В противном случае прикрепите промотор T7 к последовательности интереса путем полимеразной цепной реакции (PCR, см. шаг 1.2.).

  1. Линейная денализация промоторосодержащих плазмидов Т7
    1. Линейная плазмиды, уже содержащая правильно ориентированную промоторную последовательность T7 путем пищеварения с ферментом ограничения, вырезающий вниз по течению стоп-кодон последовательности интереса. В противном случае, транскрипция не закончится должным образом после последовательности интересов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего использовать ферменты ограничения оставляя тупые концы или 5' свесы.
    2. Подтвердите полную линейную дисмидацию агарозным гелем электрофораса непереваренной против переваренной плазмидной ДНК.
    3. Очистка линейной плазмидной ДНК до использования в качестве шаблона ДНК для транскрипции in vitro mRNA с помощью комплекта для очистки ДНК(Таблица материалов).
  2. Прикрепление промотора T7 пЧР
    1. Используйте передний грунт, содержащий следующие компоненты (в указанном порядке от 5'до 3'): около 5 случайных bp вверх по течению промотора (например, GAAAT); промоторная последовательность Т7 (TAATACGACTACTACTATAG); два дополнительных Gs для повышения эффективности транскрипции (GG); целевая последовательность-специфическая часть, которая гомологична к плазмидной последовательности, окружающей стартовый кодон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Она должна состоять из: 3-6 bp вверх по течению последовательности KO'АКИи и начать кодон, последовательность KO'АКИ и начать кодон (обычно GCCACC ATG G), 12-18 bp вниз по течению стартового кодона. Если последовательность интересов уже не содержит последовательность KO'A или начала кодона, они могут быть прикреплены в этом шаге, просто включив их в последовательность грунтовки.
    2. Рассчитайте тм переднего грунтовки только с учетом гомологии детали в целевой последовательности.
    3. Для оценки димеров/формирования шпильки используйте всю последовательность грунтовки, которая легко может превышать 50 б.п.
    4. Используйте обратную грунтовку, расположенную где-то ниже по течению от стоп-кодона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если последовательность интересов уже не содержит стоп-кодон, она может быть прикреплена в этом шаге, просто включив его в последовательность грунтовки.
    5. Используйте передние и обратные грунтовки для выполнения ПЦР с использованием полимеразы высокой точности с корректуры (Таблица материалов).
    6. Подтвердите генерацию одного продукта и размер амплитона с помощью электрофореза агарозного геля (например, используйте 1% геля агарозы и 100 В постоянного тока).
    7. Очистите продукт ПЦР перед использованием в качестве шаблона ДНК для транскрипции in vitro mRNA с помощью комплекта для очистки ДНК.

2. поколение мРНК

  1. Оттепель все компоненты комплекта транскрипции in vitro mRNA (см. Таблицу материалов). Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г. Держите на льду до использования.
  2. Подготовьте реакционную смесь для транскрипции in vitro mRNA в микроцентрифуге объемом 0,5 мл в следующем порядке (общий объем 40 зл): 20 кЛ 10-x ARCA/NTP смеси (входит в комплект транскрипции in vitro mRNA); 0,25 л 5-метил-КТП (окончательная концентрация (f.c.) составляет 1,25 мМ; 50% от общего объема CtP); 0,25 л псевдо-UTP (f.c. составляет 1,25 мМ; 50% от общего объема UTP); X Зл шаблона ДНК; 2 зл и l смеси полимеразов T7 РНК (входит в комплект транскрипции in vitro mRNA); Y ЗЛ без РНАЗ Н2О.
    ПРИМЕЧАНИЕ: X - это объем, содержащий не менее 1 мкг ДНК. Например, 1,6 л от 625 нг/Л биржевого раствора. Y является запасным объемом в общем объеме 40 Зл.
  3. Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин при 400 об/мин на тепловом миксере для транскрипции in vitro.
  4. Затем добавьте 2 Зл dNase I непосредственно в смесь реакции для удаления шаблона ДНК. Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  5. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин при 400 об/мин на термальных смесителях. Возьмите аликот из 2 л для контрольного геля (шаг 3.3) и храните при -80 градусов по Цельсию.
  6. Для поли(A) хвостохранилища добавьте следующие компоненты непосредственно в предыдущую смесь реакции (до конечного объема 50 Зл): 5 кЛ 10x полимеразы реакции буфера и 5 Зл поли(A) полимеразы (оба включены в комплект транскрипции in vitro mRNA). Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  7. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин при 400 об/мин на термомиксере. Возьмите аликот из 2 л для контрольного геля (шаг 3.3) и храните при -80 градусов по Цельсию.
  8. Для дефосфорилирования 5 и концей мРНК добавьте следующие компоненты непосредственно в предыдущую реакционную смесь (до окончательного объема 60 Зл): 3 КЛ без РНАЗа H2O; 6 кл. 10-ти антарктического буфера реакции фосфатазы; 3 зЛ антарктического фосфатазы (15 единиц при 60 мл объема реакции). Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  9. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин при 400 об/мин на термальных смесителях.
  10. Теплоинактивирует антарктическую фосфатаза путем инкубации при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале используйте отдельный термомикс, не ждите, пока первый миксер достигнет желаемой температуры.

3. Очистка мРНК

  1. Очистите in vitro транскрибированной мРНК с помощью специального комплекта очистки РНК(Таблица материалов).
    1. Добавьте X Зл раствора elution в смесь реакции мРНК со ступени 2.10. Смешайте путем инвертирования 5 раз. Добавьте 300 л связывающего стена раствора. Смешайте нежным пайпеттингом 5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: X является запасной объем в общей объеме 100 Л. Например, добавьте раствор elution 40 л л к 60 мРНК-смеси реакции.
    2. Добавьте 100 л этанола без РНАза. Смешайте нежным пайпеттингом 5 раз.
    3. Поместите столбец фильтра в одну из поставляемых коллекторских труб. Передача мРНК реакции смесь осторожно на центр фильтра, не касаясь фильтра. Центрифуга при температуре 15 000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре (RT).
    4. Аккуратно поднимите столбец фильтра и отбросьте проточный поток в трубке для сбора. Поместите столбец фильтра обратно в ту же трубку сбора.
    5. Добавьте 500 л раствора для мытья (не забудьте добавить 20 мл этанола без РНАза перед использованием раствора для мытья в первый раз).
    6. Центрифуга при 15 000 х г в течение 1 мин на RT. Повторите шаги 3.1.4-3.1.6 для мытья еще раз.
    7. Центрифуга на полной скорости (17900 х г)в течение 1 мин на RT, чтобы удалить любую остаточную жидкость из столбца фильтра. Аккуратно возьмите столбец фильтра из трубки для сбора. Поместите столбец фильтра в новую трубку для сбора.
    8. Добавьте 50 зл буфера элюции в центр фильтра, не касаясь фильтра. Инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение 10 минут на термальный миксер.
    9. Центрифуга при 15 000 х г в течение 1 мин на RT. Удалите столбец фильтра и отбросьте ее.
  2. Измерьте концентрацию и чистоту элетированной мРНК, например, с помощью микротомного спектрофотометра для измерения абсорбции на уровне 260 и 280 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент A260/A280 1,8-2,1 свидетельствует о высокоочищенной мРНК.
  3. Проверить наличие одного продукта, правильной длины стенограммы и поли(A) хвостохранилища путем анализа aliquots из шагов 2.5 и 2.7 по агарозного геля электрофорез в условиях денатурирования (например, использовать 1,2% агарозный гель, содержащий 20 мМ 3-(N-морфино) пропанесульфоновая кислота «MOPS», ацетат натрия 5 мМ, 1 мМ EDTA и 20% формальдегид и работают в 20 mM MOPS, 5 мМ ацетат натрия, 1 мМ EDTA и 0,74% формальдегида при 100 V постоянном токе).
  4. Храните очищенную мРНК в трубке elution при -80 градусах По Цельсию до трансфекции. При использовании только низких количеств мРНК для трансфекции, то aliquot мРНК, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттепели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: мРНК может храниться при -80 градусов по Цельсию в течение 1 года.

4. Подготовка макрофагов

  1. Эвтаназия C57/BL6 мышей (использование мышей того же пола и 6-24 недель возраста) путем вывиха шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Те же мыши могут быть использованы для изоляции ТЧ (шаг 4.2) и генерации BMDM (шаги 4.3 и 4.4). Для изоляции ТЧ используйте как минимум двух мышей. Если только BMDM должны быть сгенерированы одной мыши, как правило, достаточно.
  2. Иммуномагнитное обогащение перитонеальных макрофагов.
    1. Заполните 10 мл шприц с 0,9 х 40 мм канюли с 8 мл ледяной фосфат-буферный солей (PBS) и 2 мл воздуха. Промыть перитонеальной полости с ПОМОЩЬю PBS. Воздух образует пузырь, который минимизирует утечку PBS.
    2. Быстро соберите перитонеальный промывку с тем же шприцем и перенесите в коническую центрифугацию 50 мл трубки. Объедините перитонеальные клетки нескольких мышей, если это необходимо. Держите клеточную подвеску на льду.
    3. Суспензия центрифуг и цельсия при 650 х г в течение 5 мин при 4 градусах По кв. Откажитесь от супернатанта и resuspend клеточной гранулы в 5 мл 0,2 % NaCl для 30 с лиза красных кровяных телец.
    4. Добавьте 5 мл 1,6% NaCl к общему объему 10 мл для восстановления изотонических условий. Центрифуга при 650 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
    5. Откажитесь от супернатанта и повторно отретим в клеточные гранулы в 97,5 л сортировки магнитных клеток (MCS) буфер (2 мМ этиленденедиацетическая кислота "EDTA", 5% бычьей сыворотки альбумина в PBS) на 1 перитонеальной проваглицательной (например, если три мыши были промыты, resuspend в 292,5 л. ).
    6. Добавьте 2,5 л парамагнитных бусинок, спряжение к антителу, специфичному для CD11b на 97,5 л клеточной подвески (например, добавьте 7,5 л до 292,5 л).
    7. Инкубировать на льду 15 мин при 150 об/мин на орбитальном шейкере.
    8. Суспензия клеток Centrifuge на уровне 650 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию, отбросить супернатант и отложить клеточные гранулы в 1 мл буфера MCS.
    9. Добавьте 4 мл буфера MCS в общий объем 5 мл и промойте клетки, аккуратно потянив вверх и вниз три раза.
    10. Повторите шаги 4.2.8 и 4.2.9 еще два раза в общей сложности три шага мытья.
    11. Во время стирки шаги место LS колонки в магнитных клеток сепаратора (см. Таблица материалов). Промыть столбец с 3 мл буфера MCS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков, поскольку они могут засорить столбец.
    12. Отрежь пеллетку ячейки в 1 мл буфера MCS. Добавьте 3 мл буфера MCS в общий объем 4 мл, смешайте путем трижды смешайте трубку вверх и вниз.
    13. Перенесите 4 мл клеточной подвески на промытую колонку LS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, избежать каких-либо пузырьков, поскольку они могут засорить столбец.
    14. Подождите, пока резервуар колонны полностью пуст. Не добавляйте дополнительную жидкость до тех пор, пока столбец не прекратит капать.
    15. Добавьте 3 мл буфера MCS в столбец. Затем подождите, пока резервуар колонны полностью опустеет. Повторите шаг 4.2.15 еще два раза.
    16. Поместите колонну LS в коническую центрифугацию 15 мл. Нанесите 5 мл буфера MCS на столбец. Подождите, пока 2 мл жидкости прошла через колонку, а затем использовать поршень, чтобы осторожно нажать оставшуюся фракцию в трубку.
    17. Центрифуги подвески клеток на 650 х г в течение 5 мин при 4 кв и отбросить супернатант.
    18. Приостанавливайте действие клеточной гранулы в 1 мл DMEM, дополненной 10% теплоинактивированной сывороткой плода (FCS) (DMEM-FCS).
    19. Определите количество жизнеспособных клеток, отсчитав в трипан синем растворе в камере подсчета Нойбауэра и семенных клетках в DMEM-FCS в культурные пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семенной PM при плотности 100 000 клеток/колодца в плоской нижней микротитерной пластине. Не используйте ткани культуры обработанных пластин, как PM не может быть отделена от них. Вместо этого используйте необработанные пластины.
  3. Поколение БМДМ
    1. Удалить кожу и мышцы с задних ног с помощью ножниц. Вымойте каждую ногу коротким погружением в 70% этанола.
    2. Отсоедините ноги и откройте оба конца бедренной кости и голени, разрезая ножницами.
    3. Заполните 5 мл шприц заполнены 0,6 мм х 30 мм канюли с 5 мл очень низкого эндотоксина (VLE) RPMI 1640 и промыть костного мозга из открытых костей в культуре блюдо.
    4. Объедините костный мозг нескольких мышей, если требуется, повторяя шаги 4.3.1-4.3.3. Перенесите костный мозг в коническую центрифугацию 50 мл.
    5. Centrifuge суспензии костного мозга на 650 х г в течение 5 мин при 4 кв и отбросить супернатант.
    6. Приостановить клеточные гранулы в 5 мл крови лизовых буфера (8,3% NH4Cl, 0,1 М Tris) и инкубировать в течение 5 минут на RT, чтобы линза красных кровяных телец.
    7. Centrifuge подвески клетки на 650 х г при 4 "C в течение 5 минут и отбросить супернатант.
    8. Повторное действие клеточных гранул в 1 мл VLE RPMI 1640 средний дополнен 10% FCS, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% HEPES, 1% пируват натрия и 10 нг /мЛ рекомбинантных макрофаг колонии стимулирующий фактор (M-CSF) (RPMI.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
    9. Добавьте 4 млRPMI к общему объему 5 мл.
    10. Приготовьте 5 92 мм х 16 мм необработанных блюд Петри с кулачками (см. таблицу материалов) на мышь путем пайпетики 7 мл RPMI.
    11. Перенесите 1 мл клеточного раствора в 5 приготовленных культурных блюд и инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
    12. Через 4 дня кормите клетки, добавляя 4 млRPMI. Через 6-7 дней клетки костного мозга полностью дифференцированы в БМДМ.
  4. Сбор бМДМ
    1. Полностью удалить медиум из культуры блюд. Добавьте 5 мл теплой 0,2 мм EDTA в PBS к каждому блюду.
    2. Аккуратно соскребите всю тарелку с помощью клеточного скребока, чтобы отсоединить БМДМ. Объедините клеточные суспензии в конической центрифугальной трубке 50 мл.
    3. Промыть все 5 блюд снова. Используйте тот же объем 5 мл теплой 0,2 мм EDTA в PBS для всех 5 блюд. Объедините эту подвеску ячейки с той, что была на предыдущем этапе.
    4. Centrifuge клеточной подвески на 650 х г в течение 5 мин при 4 "C и отбросить супернатант.
    5. Повторное использование клеточных гранул в 1 мл VLE RPMI 1640 средних дополнен 10% FCS, 1% HEPES, 1% пируват натрия и 10 нг/мл рекомбинантных M-CSF, но без антибиотиков (RPMI)).
    6. Определите количество жизнеспособных клеток, подсчитав в трипан синем растворе в камере подсчета Нойбауэра и семенных клетках вRPMI в культурные пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семена BMDM при плотности 50000 клеток / хорошо максимум в плоской нижней микротитер пластины. Не используйте ткани культуры обработанных пластин, как BMDM вряд ли может быть отделена от них. Вместо этого используйте необработанные пластины.

5. Трансфекция макрофагов с мРНК

  1. Рассчитайте необходимый объем буфера трансфекционного промена мРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объем буфера трансфекции мРНК зависит от размера скважины: используйте 200 л для трансфекции в 6-колодецной пластине, 100 л в 12-колодской пластине и так далее. Всегда добавляйте немного запасного объема из-за потери трубаций (но не слишком много, чтобы предотвратить неоправданное разбавление мРНК). Например, используйте 450 qL вместо 4 х 100 л и 400 л для трансфекта в 4 скважинах 12-колодца пластины.
  2. Рассчитайте необходимый объем трансфекционного реагента мРНК. Трансфекционный реагент mRNA добавляется в соотношении 1:50. Например, для окончательного объема в 450 л требуется 9 л трансфекционного реагента мРНК.
  3. Рассчитайте общее количество требуемых мРНК. По крайней мере 100 нг на 100 000 макрофагов необходимы для эффективного трансфекции, 200 нг работает еще лучше (например, 800 нг мРНК для трансфекта 400 000 макрофагов).
    1. Умножьте расчетное количество мРНК, необходимое, с общим количеством скважин, которые должны быть трансинфицированы (например, 4 скважины с 400 000 макрофагов каждый: 4 х 800 нг и 3200 нг мРНК требуется в общей сложности для всех скважин). Например, если ваш запас мРНК составляет 426,8 нг/Л, для оптимального трансфекции 4 скважин с 400 000 макрофагов требуется 7,49 л.
  4. Добавьте расчетный объем буфера трансфекционного переноса мРНК (шаг 5.1.) за вычетом объемов для реагента трансфекционного реагента мРНК (шаг 5.2) и мРНК (шаг 5.3) к реакционной трубке. Например, 450 л - 9 л - 7,49 л и 433,51 л.
  5. Оттаиваете запас мРНК и смешайте его нежным переворачиванием трубки элютации. Добавьте расчетный объем мРНК (шаг 5.3) в реакционную трубку с буфером реакции мРНК (в приведенном выше примере: 7,49 л в 433,51 л).
  6. Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  7. Vortex мРНК трансфекционный реагент для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  8. Добавьте расчетный объем реагента трансфекционного реактива мРНК (шаг 5.2) в реакционную трубку, содержащую буфер трансфекционного мРНК и мРНК (в приведенном выше примере: 9 ЗЛ трансфекционного реагента мРНК).
  9. Vortex трансфекционной смеси для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  10. Инкубировать в течение 15 минут на RT.
  11. Между тем, замените культурную среду макрофагов свежей, теплой культурой среды (см. шаги 4.2.18. и 4.4.5).
  12. После инкубационного шага 5.10 добавьте трансфекционную смесь в скважины, содержащие макрофаги, в объеме, соответствующем размеру скважины (см. шаг 5.1). Добавить трансфекционную смесь dropwise в круг снаружи к середине скважины.
  13. Аккуратно раскачивать пластину, сначала в вертикальном, а затем в горизонтальном направлении, чтобы обеспечить равномерное распределение трансфекционной смеси в скважине. Затем, инкубировать при 37 градусах По цельсии и 5 % CO2. Синтез белка, кодированного трансинфицированной мРНК, начнется вскоре после трансфекции. Для достижения наилучших результатов, инкубировать, по крайней мере 6 ч.
  14. После инкубации, анализ эффективности трансфекции с помощью (иммуно) флуоресценции микроскопии, потока цитометрии или иммуноблот16, или использовать транс-инфицированных макрофагов для эксперимента выбора.

Результаты

Мы успешно использовали этот протокол для создания кодирования мРНК для вариантов NEMO и IKK, отмеченных FLAG, для трансфекции первичных макрофагов16. Плазмиды, кодирующие для FLAG-tagged дикого типа (NEMOWT)и C54/347A мутант NEMO (NEMOC54/374A) (см. Таблица материало...

Обсуждение

Здесь мы представляем протокол для высокоэффективного трансфекции обычно труднопередаваемых первичных макрофагов с транскрибированной мРНК in vitro. Важно отметить, что трансфекция макрофагов с помощью этого протокола не вызывает гибель клеток и не активирует провоспалительные сигнал...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5-methyl-CTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1138Sstored at -20 °C
Antarctic phosphataseNew England BioLabsM0289stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x)New England BioLabsB0289stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibodyInvitrogenMA1-41046stored at -20 °C
anti-β-actin antibodySigma-AldrichA2228stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with camsSarstedt821,473stored at RT
CD11b Microbeads mouse and humanMiltenyi Biotec130-049-601stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primerSigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primerSigma-Aldrich5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification KitQiagen28104stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primerSigma-Aldrich5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primerSigma-Aldrich5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x)Thermo ScientificB64stored at -20 °C
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-PolymeraseNew England Biolabs IncM0491Sstored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primerSigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primerSigma-Aldrich5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)New England BioLabsE2060stored at -20 °C
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401stored at RT
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGERPolyplus transfection409-0001DEstored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmidAddgene11105stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmidAddgene27268stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmidAddgene62043stored at -20 °C
poly(I:C)Calbiochem528906stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmidF.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1139Sstored at -20 °C
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugatedBioLegend101212stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugatedeBioscience12-4801-82stored at 4 °C
Recombinant M-CSFPeprotech315-02stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kitThermoFisher ScientificAM1908stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAPSigma-AldrichR2020stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4Invivogenstored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmidAddgene11103stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmidAddgene27268stored at -20 °C

Ссылки

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены