JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы подвергли воздействию микрофизиологическую систему (MPS) с органоидами кишечника и печени на ацетаминофен (APAP). В данной статье описаны методы производства органоидов и оценки фармакокинетической и токсикологической собственности АПАП в MPS. В нем также описаны анализы функциональности тканей, необходимые для проверки результатов.

Аннотация

Недавно введенные микрофизиологические системы (MPS), культивирующие человеческие органоиды, как ожидается, будут работать лучше, чем животные, на доклинологической фазе испытаний процесса разработки наркотиков, поскольку они генетически являются человеческими и подыгрывать взаимодействию между тканями. В этом исследовании, кишечный барьер человека (эмулируется совместно культуры Caco-2 и HT-29 клеток) и печени эквивалент (эмулируется сфероидов из дифференцированных клеток гепаРГ и человеческих печеночной стеллат клетки) были интегрированы в двухорганический чип (2-OC) микрофлюидное устройство для оценки некоторых ацетаминофен (APAP) фармакокинетических (APAP) MPS было три сборки: кишечник только 2-OC, печень только 2-OC, и кишечник / liver 2-OC с теми же средствами, perfusing обоих органоидов. Для оценок ПК, мы dosed APAP в средствах массовой информации на заданных времени после введения его либо над кишечным барьером (эмуляция устного маршрута) или в средствах массовой информации (эмуляция внутривенного маршрута), на 12 МКМ и 2 МКМ соответственно. Образцы средств массовой информации были проанализированы с помощью жидкой хроматографии высокого давления (HPLC). Органоиды анализировались на экспрессию генов, значения TEER, экспрессию и активность белка, а затем собирали, чинить и подались на набор морфологических оценок. Техника MTT хорошо справились с оценкой жизнеспособности органоидов, но анализы высокого содержания (HCA) смогли обнаружить очень ранние токсичные события в ответ на лечение APAP. Мы проверили, что поток мультимедиа не влияет на поглощение APAP, в то время как он значительно улучшает функциональность эквивалента печени. APAP поглощения кишечника человека и печеночным метаболизмом может быть подражания в MPS. Связь между данными MPS и силико-моделированием имеет большой потенциал для повышения предсказуемости методов in vitro и обеспечения лучшей точности, чем модели животных в фармакокинетических и токсикологических исследованиях.

Введение

Из-за геномных и протеомных различий модели животных имеют ограниченную прогностический значение для нескольких исходов человека. Кроме того, они относят много времени, дорогие и этическисомнительные 1. MPS является относительно новой технологией, которая направлена на улучшение прогностический мощности и сократить расходы и время, проведенное с доклинических испытаний. Это микрофлюидные устройства, культивирующие органоиды (искусственные миметические функциональные единицы органов) под потоком мультимедиа, который способствует органоидно-органоидной коммуникации. Органоиды из клеток человека увеличивают транстулятнуюактуальность 2,3,4. MPS, как ожидается, будет работать лучше, чем тесты на животных, потому что они генетически человека и повторить взаимодействие между тканями. При полной функциональности, MPS обеспечит более значимые результаты, на более высокой скорости и более низкие затраты ириски 4. Многие группы разрабатывают MPS для нескольких целей, особенно модели заболеваний для проверки эффективности препарата.

Уровень воздействия является одним из наиболее важных параметров для оценки эффективностии токсичности препарата 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS позволяет органоидной интеграции, которая эмулирует системное воздействие и, как ожидается, будет работать лучше, чем традиционные 2D культуры тканей человека. Эта технология может значительно улучшить прогнозирование поглощения соединения кишечника и метаболизма печени4.

MPS интеграции человеческой эквивалентной модели кишечника и печени является хорошей отправной точкой, учитывая центральную роль этих двух органов в биодоступности наркотикови системного воздействия 13,14,15. APAP является привлекательным препаратом для изучения MPS без эквивалента почек, потому что его метаболизация делается восновном печенью 16,17.

2-OC представляет собой двухкамерное микрофлюидное устройство, подходящее для культуры двух различных человеческих эквивалентных тканей/органоидов, взаимосвязанных микроканалами16. Для того, чтобы подражать in vitro человека устные / внутривенное введение препарата и оценить влияние перекрестного разговора между кишечником и печенью эквиваленты на APAP фармакокинетики, помимо функциональности и жизнеспособности органоидов, были выполнены три различных сборки MPS: (1) "Intestine 2-OC MPS", состоящий из эквивалента кишечника, основанного на культурной вставке, содержащей кокультуру клеток Caco-2 и HT-29, интегрированную в устройство 2-OC; (2) "Liver 2-OC MPS", состоящий из сфероидов печени, сделанных из HepaRG и HHSteC (Человеческие печеночные клетки Stellate), интегрированные в устройство 2-OC; и (3) "Intestine/Liver 2-OC MPS", состоящий из эквивалента кишечника в одном отсеке устройства, общаясь с эквивалентом печени в другом потоком средств массовой информации через микрофлюидные каналы.

Все анализы проводились в статических (без потока) и динамических (с потоком) условиях из-за воздействия механических стимулов (сжатие, растяжение и стрижка) на жизнеспособность клеткии функциональные возможности 18,19,20. В настоящей статье описывается протокол для APAP устной / внутривенной эмуляции введения и соответствующих абсорбции / метаболизма и токсикологических анализов в 2-OC MPS, содержащих кишечника человека и печени эквивалентных моделей.

протокол

1. Производство тканевых эквивалентов для выращивания в 2-OC

  1. Производство эквивалента тонкого кишечника
    1. Поддерживайте клетки Caco-2 и HT-29 с использованием эквивалентной кишечника среды: DMEM дополнен 10% FBS, 1% пенициллина и стрептомицина, и 1% несущественных аминокислот, который называется "DMEM S" в этой рукописи.
    2. Удалите среду, мыть дважды с 1x DPBS и добавить 8 мл 0,25% трипсина / ЭДТА, чтобы отмежеваться Caco-2 клеток, выращенных в колбах клеточной культуры (175 см2). Инкубировать в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию и остановить реакцию, добавив по крайней мере двойной объем ингибитора трипсина. Выполните ту же процедуру для клеток HT-29, регулируя объемы реагентов, так как меньшее количество этих клеток необходимо, и они поддерживаются в небольших колбах (75см 2).
    3. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин, удалить супернатант из обеих трубок, и повторное использование клеточных гранул в 10 мл DMEM S. Граф клеток, обеспечивая жизнеспособность клеток выше 80%. Асептически интегрировать клеточной культуры вставки в 24-хорошо пластины ранее заполнены 400 йл DMEM S на хорошо в базолатеральной стороне (которая представляет собой человеческий кровоток).
    4. Совместно культивировать како-2 и HT-29 клетки в соотношении 9:121. Используйте 2.25 x 105 Caco-2 и 2.5 x 104 HT-29 клеток к каждому эквиваленту кишечника в окончательном объеме 200 МКЛ DMEM S. Отрегулируйте количество клеток и объем в соответствии с желаемым количеством органоидов. Тщательно перемешать.
    5. Pipette 200 МКЛ клеточного раствора в апикалической стороне каждой вставки (которая представляет человека кишечной люмен стороны), посев 250000 клеток на вставку. Совместно культивировать клетки в вставки в течение трех недель22. Изменение среды по крайней мере три раза в неделю, аспирации его как с апической и базолатеральной стороны с стерильной пипетки Пастер, заботясь, чтобы не повредить нетронутыми барьер клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжить с устремлением на апической стороне, чтобы не коснуться клеточного барьера (аспират, поддерживая пастер пипетку на пластиковом ободе клетки вставки).
    6. Проверьте плотное образование монослой, измеряя TEER (трансепителиальное электрическое сопротивление) каждые три дня спомощью вольтметра 23,в соответствии с инструкциями производителя.
      1. Выполните пустой, измерения сопротивления через клеточной культуры вставить без клеток, но с той же среде клеток и на той же пластине клетки.
      2. Рассчитайте устойчивость тканей, вычитая пустую устойчивость из ткани эквивалентной устойчивости, и умножить на эффективную площадь поверхности фильтровальной мембраны (0,6см 2). Хорошая устойчивость к барьеру кишечника находится в диапазоне от 150 до 400 Ω см2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После 21 дней клетки должны быть полностью дифференцированы и кишечный барьер формируется, так что кишечник эквиваленты готовы быть интегрированы в MPS.
  2. Производство эквивалентов печени
    1. Поддерживайте клетки HepaRG с использованием среды эквивалента печени, которая является средней E Уильяма дополнены 10% плода бычьей сыворотки, 2 мМ Л-глутамин, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицин, 5 мкг / мл человеческого инсулина и 5 х 10-5 М гидрокортизон, и называется "Williams E S" в этой рукописи. Возобновление HepaRG средств массовой информации каждые 2-3 дней и поддерживать культуру клеток в течение двух недель, чтобы инициировать дифференциацию в гепатоцитов и холангиоцитов.
    2. После первых двух недель, добавить 2% DMSO в среде HepaRG в течение еще двух недель, чтобы завершить дифференциациюклеток 24,25. Выращивайте HHSTeC в Stellate Cell Media (SteC CM), используя колбы с покрытием поли-L-лизина, меняя средства массовой информации каждые два-три дня.
    3. Удалите среду, мыть дважды с 1x DPBS и добавить 8 мл 0,05% трипсина / ЭДТА, чтобы разобщить клетки гепаРГ, выращенные в колбах клеточной культуры (175 см2). Инкубировать в течение 5 до 10 минут при 37 градусов по Цельсию и остановить реакцию, добавив по крайней мере в два раза объем ингибитора трипсина. Выполните то же самое для HHSTeC, адаптируя объем реагента, так как меньшее количество этих клеток необходимы, и они могут быть сохранены в небольших колбы (75см 2).
    4. Центрифуга как при 250 х г в течение 5 мин, удалить супернатант и повторно гранулы клеток в Уильямс E S среды. Подсчитайте клетки, обеспечивая жизнеспособность клетки выше 80%.
    5. Создание сфероидов печени, сочетающих клетки HepaRG и HHSTeC в соотношении 24:1, соответственно, в Williams E Smedium 16. Добавьте 4,8 x10 4 дифференцированных HepaRG и 0,2 x 104 HHSTeC, чтобы составить каждый сфероид печени из 50 000 клеток, в объеме 80 МКЛ. Отрегулируйте количество клеток и объем в соответствии с желаемым количеством сфероидов. Тщательно перемешать.
    6. Используя многоканальный пипетку, обойтись 80 йл комбинированного пула клеток в каждой колодец из 384 сфероидных микропластов, которые имеет круглую геометрию хорошо дна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через четыре дня образуются сфероиды около 300 мкм.
    7. Используя широкосовременные наконечники, перенесите сфероиды печени на сверхнизкие пластины 6 скважин, что позволяет считать требуемый "один за другим".

2. Интеграция эквивалентов кишечника и печени в 2-OC MPS

  1. Сборка intestine 2-OC MPS для анализа абсорбции
    1. Pipette 500 йл DMEM S в больший отсек 2-OC и 300 йл в меньшем. Аспирировать базолатеральные и апические средства массовой информации каждого кишечного барьера эквивалента в 24 пластины хорошо. Используя стерильные типсы, интегрируйте одну вставку на 2-OC цепи, в частности, в больший отсек. Нанесите 200 МКЛ среды кишечника на апиальной стороне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков при интеграции органоидов в MPS.
    2. Подключите MPS к блоку управления, который должен быть подключен к герметичной подачи воздуха. Установите параметры: давление около ±300 бар и частота перекачки 0,3 Гц. Запуск потока 24 ч до введения испытательного вещества. На следующий день выполните лечение APAP.
  2. Печень 2-OC MPS сборки для анализа метаболизма
    1. Pipette 650 йл Williams E S в большой отсек и 350 йл в меньший отсек, который будет получать сфероиды. В ультра-низкой крепления 6 пластин скважины, рассчитывать сфероиды с помощью широкой родила советы. Каждый эквивалент печени состоит из двадцати сфероидов26. Интегрируйте двадцать эквивалентов печени на цепь, используя широко скважинные наконечники, которые позволяют передавать только органоиды, в меньший отсек 2-OC.
    2. Подключите MPS к блоку управления, который должен быть подключен к герметичной подачи воздуха. Установите параметры: давление около ±300 бар и частота перекачки 0,3 Гц. Запуск потока 24 ч до введения испытательного вещества. На следующий день выполните лечение APAP.
  3. Сборка intestine/Liver 2-OC MPS для анализа абсорбции и метаболизма
    1. Объедините два средства массовой информации (кишки и печени) в пропорции 1:4, что означает 200 МКЛ DMEM S в кишечнике апической стороне и 800 йл Уильямс e S в базолатеральной стороне. Интеграция кишечника и печени эквиваленты, одновременно, в 2-OC.
    2. Подключите MPS к блоку управления, который должен быть подключен к герметичной подачи воздуха. Установите параметры: давление около ±300 бар и частота перекачки 0,3 Гц. Запуск потока 24 ч до введения испытательного вещества. На следующий день выполните лечение APAP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех экспериментов выполните каждую точку времени в тройном, что означает три разделенных 2-OC цепи (т.е. 1 и 1/2 2-OC устройств). Общий объем каждой 2-OC цепи составляет 1 мл.

3. Ацетаминофен (APAP) препарат

  1. Подготовь решение ПОАП, растворив APAP в абсолютном этаноле. В день эксперимента разбавляют АПАП в соответствующей среде (решение APAP) концентрацией 12 МКМ для "устного введения" и 2 МКМ для "внутривенного введения".
  2. Убедитесь, что окончательная концентрация этанола в растворе управления и обработки транспортных средств составляет 0,5% для обеих администраций. Для положительного контроля (100 мМ APAP) концентрация этанола составляет 2%.

4. Тестирование администрирования веществ и отбора проб средств массовой информации

  1. APAP "устное" администрирование и выборка средств массовой информации
    1. Аспирировать базолатеральные и апические средства массовой информации каждого эквивалента кишечного барьера в 2-OC. Pipette 500 йл соответствующей среды культуры в большой отсек на органоидной базолатеральной стороне и 300 йл в небольшой отсек.
    2. Проверьте наличие пузырьков и приступайте к равной обработке кишечным барьером с помощью испытательного вещества в апиальной стороне, подражая пероральному администрированию. Подражать APAP "устной" администрации, добавив 200 йл из 12 ЗМ APAP решение на апической стороне кишечной культуры вставки, которая представляет собой кишечную "люмен сторону" (Рисунок 1B). Подключите MPS к блоку управления.
    3. Соберите общий объем с апикалов и с базолатеральных сторон в следующих точках времени: 0 ч, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 12 ч и 24ч 15,27. Выполните все эксперименты в тройном, в статических и динамических условиях, и соберите каждый образец, каждого тройного, в отдельной микротрубки. Проанализируйте образцы с помощью HPLC/UV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные апические и базолатеральные образцы.
  2. APAP "внутривенное" администрирование и выборка средств массовой информации
    1. Подражать "внутривенный" маршрут, внося 2 МК APAP раствор непосредственно в печени отсека. Аспирировать все 2-OC среднего содержания. Pipette 650 йл Из Williams E S, содержащий испытательное вещество в большом отсеке и 350 МКЛ из тех же средств массовой информации в меньший отсек, который содержит 20 сфероидов. Соберите все объемы в следующих точках времени: 0 ч, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 6 ч, 12 ч и 24ч 27,28.
    2. Выполняем все эксперименты в тройном, статичном и динамическом условиях. Соберите каждый образец, каждого тройного, в отдельной микротрубки. Проанализируйте образцы с помощью HPLC/UV.

5. Инструментальные и хроматографические условия

  1. Анализ HPLC
    1. Установите все соответствующие параметры для анализа HPLC в соответствии с таблицей 1.
    2. Фильтровать мобильную фазу через мембранный фильтр на 0,45 мкм в вакууме. Фильтруйте образцы через фильтр для шприца PVDF размером 0,22 мкм (диаметр 13 мм) и храните их во флаконе. Начало измерения.
  2. Фондовые решения, стандарты калибровки и образцы контроля качества (КК)
    1. Подготовьте 10 мМ. фондовых решений APAP в буфере ацетата аммония (100 мМ, рН 6,8) и еще больше разбавляйте DMEM S и Williams E S клеточными культурами, разбавленными ацетатным буфером аммония (1:1, v/v) для достижения рабочих решений в диапазоне от 0,25 до 100,00 МКМ.
    2. Включите набор образцов калибровки в тройном, а также образцы контроля качества на четырех уровнях в три раза. Подготовь эти стандарты к серийному разбавлению.
    3. Создание кривых калибровки пиковых областей APAP по сравнению с номинальными стандартными концентрациями APAP. Определите линейную регрессию, пригодную для каждой кривой калибровки. Оцените доброту различных калибровочные модели с помощью визуального осмотра, коэффициента корреляции, внутри- и межунимной точности и точности значений.
    4. Инъекции пустых образцов СРЕДСТВ массовой информации DMEM S и Williams E S, разбавленных ацетатным буфером аммония (1:1, v/v) в секступликате. Подготовь трипликаты образцов контроля качества в DMEM S и Williams E S-средствах массовой информации, разбавленных ацетатным буфером аммония (1:1, v/v) для концентраций APAP 0,50 (ЛОЗ), 4,50, 45,00 и 90,00 МКМ.
    5. Убедитесь, что образцы контроля качества готовятся из нового решения запасов, отличается от того, которое используется для создания стандартной кривой. Используйте образцы контроля качества для изучения внутри- и межрегионных вариаций.
  3. Процедуры проверки
    1. Выполните биоаналитическую проверку метода после ранее сообщенных процедур29,30. Проведение хроматографических работает в пяти или шести отдельных случаях, учитывая Уильямс E S и DMEM S ячейки культуры средств массовой информации, соответственно.
    2. Убедитесь, что калибровочные точки в диапазоне от 0,25 до 100,00 МКМ APAP, в DMEM S или Williams E S клеточных культур СМИ разбавленных ацетат буфера аммония (1:1, v/v), построены на основе пиковых областей APAP (оси y) против соответствующих номинальных концентраций (оси x). Сравните склоны этих стандартных кривых калибровки со склонами кривой калибровки, подготовленной в буфере ацетата аммония. Убедитесь, что все кривые калибровки имеют значение корреляции не менее 0,998.
    3. Определите точность и точность (внутри- и межголовые) для анализа в суррогатной матрице с помощью репликаций на четырех различных уровнях LLO, низкого, среднего и высококачественного контроля в течение пяти или шести различных дней. Выполняйте внутриутробные измерения точности и точности в тот же день в средствах культуры клеток DMEM S или Williams E S, разбавленных ацетатным буфером аммония (1:1, v/v), содержащим концентрации 0,50, 4,50, 45,00 и 90,00 ЗМ АПАП (n'3).
    4. Оцените каждый набор образцов контроля качества, содержащих концентрации APAP из недавно полученных кривых калибровки. Проверьте избирательность анализов по степени разделения соединения интереса и возможных других хроматографических пиков, вызванных вмешательством компонентов.
  4. Нижний предел количественной оценки (ЛЛОЗ) и предел обнаружения (LOD)
    1. Определите нижний предел количественной оценки (LLO) на основе стандартного отклонения ответа и наклонного подхода. Рассчитайте с помощью формулы 10 "/S, где α является стандартным отклонением у-перехвата и S является наклон прямой линии, полученной путем построения кривыхкалибровки 29,30. Оцените предел обнаружения (LOD) с учетом в 3,3 раза стандартного отклонения заготовки, разделенного наклоном кривойкалибровки 29,30.

6. Ткань эквиваленты жизнеспособности / функциональности

  1. Mtt
    1. Выполните анализ MTT для оценки органоидной жизнеспособности во всех точках анализа MPS. В качестве отрицательного контроля используйте сотовые медиа плюс транспортное средство. В качестве положительного контроля, лечить органоиды с 100 мМ APAP и 1% NaOH разбавленной в клеточной среде.
    2. Передача 20 сфероидов каждой репликации для отдельных скважин в 96 хорошо пластины, и клеточной культуры вставки, содержащие эквиваленты кишечника, на 24 хорошо клеточных пластин, размещение одного кишечника эквивалент на скважину. Вымойте эквиваленты ткани три раза с 1x DPBS.
    3. Добавьте 300 л раствора МТТ 1 мг/мл, разбавленного в соответствующей клеточной среде, на колодец. Инкубировать пластины в течение 3 ч в стандартных условиях культуры клеток.
    4. Удалите решение MTT из каждого хорошо тщательно pipetting. Экстракт МТТ formazan из кишечника и печени эквиваленты с использованием 200 йл изопропанола на ночь при 4 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Печать крышки, чтобы предотвратить испарение.
    5. Передача 200 МКЛ каждого супернатанта в соответствующие предварительно идентифицированные хорошо в 96 хорошо микро-тестовой пластины. Используйте изопропанол в качестве пробела.
    6. Прочитайте абсорбанс formazan в читателе плиты на 570 nm. Рассчитайте относительную способность ячеек уменьшать МТТ (%) использование средней оптической плотности каждой точки времени, по сравнению с отрицательным контролем, считается 100% жизнеспособности клеток.
  2. Цитохимия/гистология
    1. Исправить кишечника и печени эквиваленты, в течение 25 мин при комнатной температуре, используя 4% (ж / в) параформальдегид в 0,1 М фосфат-солевой буфер, рН 7,4. Вымойте органоиды 5 раз в буфере PBS в течение 10 минут каждый раз. Пятно кишечника и печени эквиваленты с тетраметилфодамин изотиоцианат-фаллоидин или Alexa Fluor 647 фаллоидин, 1:50 в PBS31.
    2. Перенесите их в ОКТ замораживания среды в течение нескольких минут, чтобы акклиматизироваться на RT перед передачей их в жидкий азот до полного замораживания. Выполните криозы печени криозеции около 10-12 мкм толщиной, используя криостат.
    3. Намонтировать секции тканей в монтажной среде с DAPI. Изучите их с помощью конфокальные микроскопии флуоресценции.
    4. Заморозить органоиды после фиксации для выполнения гематоксилина и эозин окрашивания в соответствии с установленными протоколами. Намонтировать слайды с монтажной среды после нарезки ткани, как описано выше, и принять гистологические изображения с помощью оптического микроскопа.
  3. Анализ высокого содержания
    1. Митохондриальное и ядерное окрашивание клеток
      1. Восстановить лиофилизированный порошок в DMSO, чтобы сделать 1 мМ митохондриального окрашивания фондового раствора (например, MitoTracker Deep Red FM). Храните раствор для акций с aliquoted при -20 градусов по Цельсию, защищенный от света. Разбавить 1 мМм митохондриального окрашивания стокового раствора до конечной концентрации (200 нМ) в предварительной (37 градусов по Цельсию) среде культуры тканей без сыворотки.
      2. Удалите мультимедиа культуры ячейки. Добавьте митохондриальный раствор окрашивания, чтобы полностью покрыть образец и инкубировать клетки в течение 15-45 мин при 37 градусов по Цельсию во влажной атмосфере с 5% CO2.
      3. Тщательно удалите митохондриальное окрашивание рабочего раствора и замените его 2-4% параформальдегидом фиксации в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.
      4. Промыть фиксированные клетки осторожно с PBS в течение 5 минут. Повторите процесс стирки дважды.
      5. Приготовьте раствор нуклеиновой кислоты с нуклеиновой кислотой 10 мг/мл (16,23 м), растворив 100 мг красителя Hoechst 33342 в 10 мл ультрапурной воды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковое решение должно быть aliquoted и храниться защищены от света при -20 градусов по Цельсию.
      6. Подготовьте 0,2-2,0 мкг/мл нуклеиновой кислоты, окрашивая рабочий раствор в PBS и инкубировать зациклененные клетки нуклеиновым кислотным окрашиванием рабочего раствора в течение 10 минут при комнатной температуре.
      7. Удалить нуклеиновой кислоты окрашивания рабочий раствор и промыть клетки осторожно с PBS в течение 5 минут три раза. Клетки должны храниться в PBS при 4 градусах Цельсия, защищенных от света.
    2. Анализ митохондриального и ядерного окрашивания
      1. Анализируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа с помощью наборов фильтров, подходящих для пятна нуклеиновой кислоты («Екс/Ем: 361/497 нм») и митохондриального пятна («Ex/»Em: 644/665 nm). Найти клетки нуклеиновой кислоты положительное окрашивание и количественное число клеток. Количественная оценка интенсивности митохондриальной флуоресценции пятен в митохондриях.
  4. Морфометрические измерения (расчеты сфероидов) в ImageJ
    1. Экспорт высококонтентного анализа (HCA) изображения, как .flex файлов из программного обеспечения Columbus. Импорт .flex файлов в качестве серого масштаба в ImageJ с помощью плагина Bio-Formats32: Файл
    2. В окне Параметры импорта выберите просмотр Hyperstack и включите каналы Split под Split в отдельные окна. Эта опция позволит получить доступ ко всем файлам в определенном канале (например, DAPI, mitotracker и т.д.). Не выберите использовать виртуальный стек под управлением памяти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительнее использовать канал DAPI в качестве "пыли" в изображениях, так как среда культуры уменьшается в ультрафиолетовой длине волны (например, 405 нм).
    3. Отрегулируйте размерпикселей (Analyze и Set Scale),если он не был загружен в соответствии со встроенными значениями в файле .flex. Нанесите gaussian Blur фильтр, чтобы удалить избыток шума и избежать нарушений в контуре формы. Процесс йgt; Фильтры Высокое значение Sigma (радиус) между 2.0 и 3.0 идеально подходит для большинства случаев. Если стек имеет несколько изображений, примените ко всем из них (выберите окно Да в окне Process Stack).
    4. Создайте двоичное изображение для отдельного фона и органоидов (объектов) с помощью порога. Нажмите на изображение, чтобы настроить Используйте красную маску, чтобы настроить значения в зависимости от интенсивности изображения, чтобы соответствовать органоидной форме, сохраняя морфологию нетронутой. Отключите темный фон, если изображение имеет белый фон. Нажмите Применить.
    5. В стеке преобразования в двоичное окно выберите метод Порога. Как правило, по умолчанию или треугольник предпочтительнее в этом виде обработки изображений. Держите фон, как темный. Выберите порог расчета для каждого изображения, если в стеке есть несколько изображений.
    6. Выберите Процесс юgt; Двоичный По желанию удалите отверстия из фона. В процессе юgt; Двоичный йgt; Вариантs, выберите черный фон и выполнить Заполнить отверстия снова. Отключите опцию Черного фона, прежде чем приступить к следующему шагу.
    7. Отдельные объекты. Для органоидов, метод водораздела является хорошим выбором. Нажмите Процесс юgt; Двоичный Выполните анализ формы.
      1. Выберите Анализ и установить измерения. Доступно несколько вариантов (подробная информация в https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Для органоидов, выберите площадь, Среднее серое значение, Мин и макс серое значение и формы дескрипторов. Дополнительно выберите метку Display для идентификации объектов на изображении и научной нотации. Нажмите OK.
      2. Выберите Анализ и анализ частиц. Выберите пределы размера и круговорота. Держите 0-бесконечность и 0.00-1.00, соответственно, чтобы измерить все объекты на изображении. В Showвыберите контуры, чтобы объекты были идентифицированы. Включить результаты отображения к результатам вывода; Исключить по краям, чтобы исключить объекты, касаясь границ; Включите отверстия так в конечном итоге внутренние отверстия в объектах рассматриваются как часть основной формы.
    8. Повторите анализ форм для каждого стека изображений, и результаты будут приложены в одной таблице. Таблица результатов экспорта в файле «Сохранить как...», как файл «Запятая разделенные .csv» (.csv).
  5. ПЦР в режиме реального времени
    1. Извлекайте РНК из тканевых эквивалентов с использованием монофазного раствора фенола и гуанидина изотиоцианата, следуя инструкциям производителя.
    2. Выполните синтез кДНК путем обратной транскрипции от 1 до 2 мкг общей РНК.
    3. Усильте все цели с помощью генно-специфических праймеров(таблица 5) длявыполнения количественного ПЦР в режиме реального времени. Каждый qRT-PCR содержит 30 нг обратной транскрибируется РНК и 100 нм каждого грунтовка.
    4. Следуйте условиям ПЦР: 50 градусов по Цельсию в течение 3 минут (1 цикл); 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут (1 цикл); 95 градусов по Цельсию в течение 30 секунд, 59 градусов по Цельсию в течение 45 секунд и 72 градусов по Цельсию в течение 45 секунд (35 - 40 циклов).
  6. CYP анализ
    1. Следуйте разделу 2.2 для печени 2-OC сборки. Экспериментальными группами являются нет-клеточный контроль, APAP 2 ЗМ лечения 12 ч, 24 ч, и управление транспортным средством. Следуйте разделам 3.3 и 4.2 для подготовки и лечения APAP 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что все образцы будут готовы в то же время для анализа CYP, начать 12 ч лечения 12 часов после начала 24 ч лечения. Относитесь к нетклеточному контролю активности CYP с раствором этанола 0,5%, а также к управлению транспортным средством.
    2. Оттепель 3 мМм люминогенный субстрат запас раствор при комнатной температуре и сделать 1:1000 разбавления в William's E S. Защитите от света.
    3. Соберите сфероиды и перенесите каждую экспериментальную группу в колодец из 96-хорошо пластины. Удалите среду, мыть дважды с 100 йл 1x DPBS и добавить 80 МКЛ из 3 МКГ субстрат раствор на колодец. Держите не-клеточный контроль в среде E S Уильяма. Сохранить хорошо без сфероидов или субстрат решение для фонового контроля. Инкубировать в течение 30-60 мин при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2, защищены от света.
    4. Эквилибррат лиофилинизированный реагент обнаружения люциферина (LDR) с помощью буфера восстановления с эстеразой. Смешайте путем закрученного или инвертирования. Храните присвоенный объем при комнатной температуре до следующего шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановленный LDR может храниться при комнатной температуре в течение 24 часов или при температуре 4 градусов по Цельсию в течение 1 недели без потери активности. Для длительного хранения храните при -20 градусов по Цельсию.
    5. Передача 25 МКЛ супернатанта нетронутых сфероидов в трех различных скважинах белой непрозрачной микроплоцы 96 скважин после инкубации. Добавьте 25 л LDR на колодец и гомогенизируйте.
    6. Инкубировать белую тарелку при комнатной температуре в течение 20 минут. Прочитайте люминесценцию на люминометре. Не используйте флюорометр.
    7. Рассчитайте чистые сигналы, вычитая значения фоновых люминесценций (без клеточного контроля) из тестовых обработанных соединений и необработанных (контроль транспортных средств) значений. Рассчитайте процентное изменение активности CYP3A4 путем деления чистых обработанных значений на чистые необработанные значения и умножения на 100.
  7. Западный blotting
    1. Перенесите сфероиды печени на идентифицированную микротрубосеку 1,5 мл. Удалите среду и мыть дважды с 100 йл 1x DPBS.
    2. Лизате сфероиды печени в 100 мкл буфера лиза клетки RIPA при 4 градусов по Цельсию в течение 20 мин. Центрифуга в течение 15 мин, 4 градусов по Цельсию и 11000 об/мин. Перенесите супернатант на другой идентифицированный микротрубок 1,5 мл.
    3. Количественная оценка количества белка, полученного методом Брэдфорда. Загрузите от 10 до 50 мкг белка из количественного лисата клетки на колодец градиентного полиакриламинида геля 3-15% и выполните SDS-PAGE.
    4. Перенесите загруженный белок из геля в мембрану PVDF на 0,22 мкм через полусухое системное оборудование. Используйте раствор переноса 50 мМ Трис-ХКл и глицин 192 мМ. Установите параметры оборудования в зависимости от количества гелей, которые будут переданы (от 1 до 2 за один раз).
    5. Блок неспецифических взаимодействий на мембране PVDF с 3-5% обезжиренного молочного раствора в буфере TBS-T: Tris-Buffered Saline (50 мМ Трис рН 7,6, 150 мМ хлорида натрия) дополнен 0,1% Tween 20. Держите мембрану под нежно постоянной тряской в течение 1 часа при комнатной температуре.
    6. Вымойте TBS-T под нежно постоянной тряской в течение 3-5 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг стирки дважды.
    7. Разбавить альбумин и винкулин первичных антител до 1:1000 и 1:2000 соответственно на TBS-T. Инкубировать мембрану с первичными антителами на ночь при 4 градусов по Цельсию, под мягко постоянной тряской.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда следуйте инструкциям производителя, чтобы разбавить антитела.
    8. Удалить первичное антитело и мыть мембрану 3 раза (шаг 6.7.6). Разбавить ECL анти-мышь IgG вторичного антитела до 1:5000 на TBS-T. Инкубировать мембрану вторичным антителом под нежно постоянной тряской в течение 2 часов при комнатной температуре.
    9. Удалить вторичное антитело и промыть мембрану (шаг 6.7.6). Выполните обнаружение белка с помощью ECL Western Blotting Substrate. Разоблачить авторадиографические пленки от 30 с до 30 мин. Выполните иммуноблоттинг обнаружения в тройном.

Результаты

Для выполнения испытаний PK APAP в 2-OC MPS, первым шагом является производство кишечника человека и печени эквиваленты (органоиды). Они интегрированы в 2-OC микрофлюидное устройство(рисунок 1A) 24 ч до начала анализа PK APAP. На следующий день среда изменена, и модель подвергается APAP....

Обсуждение

Точная и надежная оценка фармакологических свойств новых препаратов имеет решающее значение для снижения риска на следующих этапах развития. MPS является относительно новой технологией, которая направлена на улучшение прогностической мощности и сокращение затрат и времени, затраченн...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Кристи Гуген-Гийозо, д-ра Филиппа Грипона в подразделении 522 INSERM и доктора Кристиана Трепо в подразделении 271 INSERM за использование биологического материала (клетки Hepa RG) и за то, что он был доступен для нас для проведения научных исследований.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235No calcium, no magnesium
2-OCTissUse GmbHTwo-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% ParaformaldehydeUse to fix cell
AcetaminophenSigma AldrichA7085Use to MPS assays
AcetonitrileTediaUsed to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientificconfocal experiment
Ammonium acetateSigma AldrichUsed to perform HPLC
Caco-2 cellsSigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasksSarstedt
Confocal Fluorescence microscopeLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM high glucoseThermo Fisher Scientific12800017Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSOSigma AldrichD4540Add 2% to HepaRG media
EthanolSynth
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12657029
Freezing medium OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cellsBiopredic InternationalHPR101Undifferentiated cells
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cells and all culture supplements
Hoechst 33342HCA experiments
HT-29 cellsSigma Aldrich85061109
Human InsulinInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 guard column SSPhenomenexUsed to perform HPLC
MicroscopeLeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µm pore size insertsMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 meterMerckMERS00002Used to TEER measurement
MitoTracker Deep RedHCA experiments
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systemAgilent Technologies
Neubauer chamberCounting cells
Operetta High Content Imaging SystemPerkin ElmerUsed to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063Cell culture
PermountThermo Fisher ScientificHistology
PrimersRT-qPCR
PVDF membraneBioRad
PVDF Syringe filter0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 columnPhenomenexUsed to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse TranscriptaseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
TRizol TM reagentThermo Fisher ScientificTrizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solutionThermo Fisher ScientificR001100
Ultra-low-attachment platesCorningCLS3471-24EA6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well MicroplatePerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams EPan BiotechP04-29510Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

Ссылки

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  24. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  25. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  26. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  27. Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
  28. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  29. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  30. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  31. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
  32. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  33. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
  34. OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
  35. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
  36. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  37. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  38. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

166ADMETox

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены