JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом докладе описывается микрофлюидный чип-метод для создания эксперимента на одной культуре клеток, в котором может быть достигнут высокоэффективный спаривание и микроскопический анализ нескольких одиночных клеток.

Аннотация

Клеточная ко-культура анализы были широко использованы для изучения клеточных взаимодействий между различными типами клеток, чтобы лучше понять биологию заболеваний, включая рак. Однако прояснить сложный механизм межклеточного взаимодействия в высокоразногенных популяциях клеток с помощью обычных систем совместной культуры сложно, поскольку неоднородность клеточной субпопуляции затушевывается средними значениями; обычные системы совместной культуры могут использоваться только для описания сигнала популяции, но неспособны отслеживать поведение отдельных клеток. Кроме того, обычные одноклеточные экспериментальные методы имеют низкую эффективность в манипуляции ячейками из-за распределения Пуассона. Микрофабрикаты устройства являются новой технологией для одноклеточных исследований, потому что они могут точно манипулировать одиночными клетками с высокой пропускной мощностью и могут уменьшить потребление образцов и реагентов. Здесь мы описываем концепцию и применение микрофлюидного чипа для нескольких одноклеточных кокультур. Чип может эффективно захватывать несколько типов одиночных ячеек в культурной камере (46%) и имеет достаточное пространство культуры, полезное для изучения поведения клеток (например, миграция, пролиферация и т.д.) при взаимодействии клеток на одноклеточном уровне. Лимфатические эндотелиальные клетки и оральные плоскоклеточные карциномы были использованы для выполнения одноклеточного эксперимента совместной культуры на микрофлюидной платформе для живых нескольких одноклеточных исследований взаимодействия.

Введение

Эффективный захват различных типов одиночных ячеек и обеспечение достаточного пространства культуры необходимы для экспериментов одноклеточной совместной культуры нескольких типов одиночных ячеек1. Ограничение разбавления является наиболее часто используемым методом подготовки одиночных ячеек для таких экспериментов, из-за низкой стоимости необходимого оборудования. Однако, из-за ограничения распределения Poisson, максимальная вероятность приобретения одной ячейки составляет всего 37%, что делает экспериментальную операцию трудоемкой и трудоемкой2. В отличие от этого, с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) может преодолеть ограничение распределения Пуассона для высокоэффективной подготовки одиночных ячеек3. Однако FACS может быть недоступен для некоторых лабораторий из-за дорогостоящих затрат на оборудование и техническое обслуживание. Микрофабрикаты устройства были недавно разработаны для одной ячейки захвата4, одноклеточных сопряжения5, и одноклеточных приложений культуры. Эти устройства являются выгодными на основе их способности точно манипулировать одиночными ячейками6,выполнять высокопроизводительные эксперименты, или уменьшить потребление образцов и реагентов. Тем не менее, выполнение одноклеточных экспериментов совместной культуры с несколькими типами клеток с текущими микрофлюидными устройствами по-прежнему является сложной задачей из-за ограничения распределения Пуассон1,7,8, или неспособность устройства для захвата более двух типов одиночных ячеек4,5,6,9,10.

Например, Yoon et al. сообщили о микрофлюидном устройстве для исследования взаимодействия клеток11. Это устройство использует вероятностный метод для сопряжения ячеек в одной камере. Тем не менее, он может достичь только сопряжения двух различных типов клеток из-за геометрических ограничений в структуре устройства. Другой доклад От Ли и др. продемонстрировали детерминированный метод захвата и сопряжения одиночных ячеек12. Это устройство повышает эффективность сопряжения с помощью детерминированного метода, но оно ограничено длительным временем работы, требуемым для сопряжения клеток. В частности, второй захват ячейки может быть выполнен только после того, как первая захваченная ячейка прикреплена к поверхности после 24 ч. Чжао и др. сообщили о микрофлепированном устройстве на основе капель для захвата двух типов одной ячейки13. Мы можем обнаружить, что микрофлюидное устройство на основе капель по-прежнему ограничено распределением Пуассона и может использоваться только на неподключенных клетках, и изменить культурное решение в процессе выращивания невозможно.

Ранее мы разработали микрофлюидный "гидродинамический челночный чип", который использует детерминированные гидродинамические силы для захвата нескольких типов одноклеточных в камеру культуры и может впоследствии выполнять эксперимент клеточной кокультуры для анализа поведение миграции отдельных клеток при взаимодействии клеток14. Гидродинамический челночный чип состоит из массивных наборов юнитов, каждый из которых содержит серпантинный объездной канал, место захвата и культурную камеру. Используя разницу в сопротивлении потока между серпантинным объездным каналом и культурной камерой, и специально разработанную процедуру работы, различные типы одиночных ячеек могут быть повторно захвачены в камеру культуры. Примечательно, что достаточное пространство камеры культуры может не только предотвратить промывку клетки во время захвата клеток, но и обеспечить достаточное пространство для клеток, чтобы распространяться, размножаться и мигрировать, что позволяет наблюдать живые одноклеточные взаимодействия. В этой статье мы сосредоточимся на производстве этого устройства и подробных протокольных шагах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Изготовление вафельной формы с помощью мягкой литографии

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные шаблона маски доступны в нашей предыдущей публикации14.

  1. Обезвоживать 4-дюймовую кремниевую пластину в духовке 120 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
  2. Спин пальто 4 г SU-8 2 отрицательный photoresist на 4-дюймовый кремниевой пластины на 1000 об/мин в течение 30 с, чтобы создать 5 мкм толщиной слоя (слой #1).
  3. Мягкий слой выпечки #1 на горячей пластине 65 градусов по Цельсию в течение 1 мин, а затем передать слой #1 до 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин.
  4. Прохладный слой #1 комнатной температуры, поместите его на держатель полуавтоматической маски выравниватель, и выровнять с слоем #1 хромированные фотомаски (захват-сайт слой).
  5. Экспозиция слоя #1 с 365 нм УФ-излучения в дозе 150 мДж/см2.
  6. Удалите слой #1 с выравнивателя и пост-испечь на 65 градусов по Цельсию hotplate в течение 1 мин. Передача слоя #1 до 95 градусов по Цельсию hotplate в течение 1 мин.
  7. Прохладный слой #1 до комнатной температуры. Погрузитесь в пропиленгликоль монометилэфирный эфирный раствор, чтобы смыть неперекрестный фотоустойчивость в течение 2 мин. Мягко высушите азотным газом, чтобы выявить слой #1 знак выравнивания.
  8. Обложка слой #1 выравнивание знак клейкой лентой, спина пальто 4 г SU-8 10 отрицательных фотоустойчивость на слой #1 на 1230 об /мин в течение 30 с, чтобы создать 25 мкм толщиной слоя #2.
  9. Снимите ленту, мягкий слой выпекать #2 на 65 градусов по Цельсию hotplate в течение 3 мин, а затем передать слой #2 на 95 градусов по Цельсию hotplate в течение 7 мин.
  10. Прохладный слой #2 до комнатной температуры, поместите слой #2 на держатель полуавтоматического выравнивателя маски и выровняем слой #2 хромированной фотомаской (объездным слоем канала) к #1 знаку выравнивания слоя.
  11. Экспозиция слоя #2 с 365 нм УФ-излучения в дозе 200 мДж/см2.
  12. Удалите слой #2 с выравнивателя и пост-испечь на 65 градусов по Цельсию hotplate в течение 1 мин и передачи слоя #2 на 95 градусов по Цельсию hotplate в течение 3 мин.
  13. Прохладный слой #2 до комнатной температуры и покрывают слой #1 знак выравнивания клейкой лентой. Спинпальто 4 г SU-8 2050 отрицательного фотосопротивления на слой #2 при 1630 об/мин на 30 с, чтобы создать слой толщиной 100 мкм #3.
  14. Снимите ленту, мягкий слой выпекать #3 на 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем передать слой #3 на 95 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
  15. Прохладный слой #3 комнатной температуры, поместите слой #3 на держатель полуавтоматической маски выравниватель, и выровнять слой #3 хромированные фотомаски (культурный слой камеры) слой #1 знак выравнивания.
  16. Экспозиция слоя #3 с 365 нм УФ-излучения в дозе 240 мДж/см2.
  17. Удалите слой #3 с выравнивателя и пост-испечь на 65 градусов по Цельсию hotplate в течение 5 мин. Передача слоя #3 до 95 градусов по Цельсию hotplate в течение 10 мин.
  18. Прохладный слой #3 комнатной температуры. Погрузитесь в пропиленгликоль монометилэфирный этер ацетат, чтобы смыть неперекрестный фотоустойчивость в течение 10 мин и осторожно высушить с помощью азотного газа.

2. PDMS подготовки устройства для нескольких одноклеточных захвата

  1. Поместите форму вафельии и тарелку для взвешивания, содержащую 100 л трихлорозилана в дешикатор (только для силанизации) и нанесите вакуум (-85 кПа) на 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Silanize поверхности с трихлорозилан для создания гидрофобных свойств поверхности до PDMS литья, что он может легко быть очищены от формы пластины PDMS.
  2. Остановить вакуум, а затем силанизировать вафельную форму в ошикаторе (только для силанизации) при 37 градусах По Цельсию, по крайней мере 1 ч.
  3. Смешайте базу PDMS и лечебный агент PDMS в соотношении 10:1. Налейте в общей сложности 20 г смешанных PDMS на вафельную форму в 15 см блюдо.
  4. Поместите 15 см блюдо в обезвищной и нанесите вакуум (-85 кПа) в течение 1,5 мин. Затем снимите 15-сантиметровую тарелку с обезвоженого. Храните в течение 20 минут при комнатной температуре. Наконец, удалите остаточные пузырьки воздуха в PDMS с помощью азотного газа.
  5. Поместите 15 см блюдо в духовке при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2-4 ч для лечения PDMS.
  6. Удалите реплику PDMS из формы пластины, а затем пробить 1,5 мм входе и 0,5 мм розетки на PDMS с помощью 1,5 мм внутреннего диаметра и 0,5 мм внутреннего диаметра перфоратор(рисунок 1C).
  7. Очистите реплику PDMS и поверхность слайда съемной лентой, а затем обработать поверхность кислородной плазмой (100 Вт на 14 с).
  8. Вручную выровнять реплики PDMS со слайдом и привести их в контакт друг с другом.
  9. Поместите слайд PDMS в духовке 65 градусов по Цельсию в течение 1 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для формирования устройства достигается постоянная связь между слайдом и репликой PDMS.
  10. Погрузите устройство PDMS в контейнер, наполненный фосфатным буферным сольнием, и поместите его в обезвсом. Затем нанесите вакуум (-85 кПа) в течение 15 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  11. Поместите устройство PDMS в капот клеточной культуры и стерилизуем устройство с помощью УФ-излучения (длина волны света: 254 нм) в течение 30 мин.
  12. Замените буфер устройства PDMS на средний (базальная среда DMEM-F12, содержащая 1% антибиотиков и 10% сыворотки для крупного рогатого скота плода) и инкубация устройства PDMS при 4 градусах Цельсия в течение 1 дня. Это предотвращает примыкание клеток к поверхности PDMS.

3. Подготовка одноклеточной подвески

ПРИМЕЧАНИЕ: Типы клеток включают лимфатические эндотелиальные клетки человека (LECs), клетки OSCC TW2.6, выражающие WNT5B-специфическую шРНК (WNT5B sh4) и контроль переносчиков (pLKO-GFP), которые были получены из нашего предыдущего исследования15. Пожалуйста, обратитесь к нашей предыдущей публикации для детальных шагов по выращиванию.

  1. Удалите культурную среду, когда клетки достигают 70-80% слияния. Затем аккуратно промыть клетки с 5 мл стерильных PBS три раза.
  2. Добавьте 1 мл среды DMEM-F12, содержащей 1 флуоресцентный краситель, в клетки WNT5B sh4 и pLKO-GFP (используйте среду MV2 для ЛЭК), а затем инкубировать клетки в течение 30 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: LECs были окрашены зеленым chloromethylfluorescein диацетат (CMFDA) краситель, WNT5B sh4 клетки были окрашены синим 7-амино-4-хлорметилкумарин (CMAC) краситель и pLKO-GFP клетки были окрашены красным дил флуоресцентный краситель.
  3. Аккуратно промыть клетки с 5 мл стерильных PBS три раза.
  4. Удалить PBS и добавить 2 мл 0,25% Трипсин-EDTA (0,05% Трипсин-EDTA для ЛЭК).
  5. Инкубировать клетки в течение 4 минут при комнатной температуре, а затем осторожно нажмите на блюдо культуры ткани для содействия отслоение клеток.
  6. Добавьте 4 мл среднего значения DMEM-F12 для разгона клеток WNT5B sh4 и pLKO-GFP (для ЛЭК используется 3 мл среднего mV2 и 1 мл раствора трипсина нейтрализатора). Затем перенесите клетки в трубку 15 мл, и центрифугу при 300 х г в течение 3 мин.
  7. Удалите супернатант и аккуратно приостановите действие клеточной гранулы в 1 мл средней среды DMEM-F12. Подсчитайте количество живых клеток в гемоцитометре с помощью стандартного метода исключения Trypan Blue16. Приготовьте 1 мл клеточной суспензии при концентрации 3 х 105 клеток/мл в среде DMEM-F12, а затем держите клетки на льду, чтобы предотвратить агрегацию клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности одноклеточного захвата требуется тщательная подготовка одноклеточной подвески с хорошо разобщенной.

4. Несколько одноклеточных захвата и тройной одноклеточной культуры

  1. Соедините трубку поли-тетгриппуроэтина (PTFE) между розеткой устройства и шприц насосом. Удалите среду и добавьте 1 кл/л клеточной суспензии при концентрации 3 х 105 ячеек/мл в впускной части устройства PDMS.
  2. Загрузите подвеску ячейки в устройство шприц насосом со скоростью потока 0,3 л/мин(рисунок 2А). Направление потока от входе к розетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите сразу после добавления суспензии клетки в входе, чтобы предотвратить отложение клеток.
  3. Добавьте 1 qL среды DMEM-F12 в впускной аппарат устройства PDMS после шага 4.2.Load средний DMEM-F12 в устройство шприц насосом со скоростью потока 0,3 л/мин(Рисунок 2B). Направление потока текла от входе к розетке.
  4. Загрузите в устройство насосом для шприцев 0,3 л /м/(рисунок 2С). Направление потока текла от розетки к входе.
  5. Повторите шаги 4.1 до 4.4 для загрузки других типов клеток в устройство.
  6. После завершения захвата ячейки, используйте микроскоп с 4x объективом для изображения каждой камеры культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресценция выбросов клеток был использован для выявления и подсчета числа отдельных клеток в каждой камере культуры.
  7. Удалите трубку PTFE и запечатать входе и розетку с полиолефинлентной лентой для создания закрытой системы культуры.
  8. Переместите устройство PDMS в тарелку культуры 10 см и добавьте 10 мл стерильных PBS вокруг устройства PDMS, чтобы избежать испарения среды от устройства.
  9. Перенос блюда из культуры в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2 и 95% влажности) для тройной одноклеточной культуры.
  10. Микроскопически наблюдать и фотографировать рост клеток каждые 12 ч.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Устройство имеет трехслойную структуру, о чем свидетельствует поперечная фотография разреза устройства PDMS(рисунок 1A). Первый слой содержит узел захвата (6,0 мкм в ширину и 4,6 мкм в высоту), который соединяет культурную камеру и канал объезда. Раз...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Межклеточные взаимодействия различных клеток в микроокружении опухоли играют важную роль в прогрессировании опухоли17. Для того, чтобы понять механизм взаимодействия клеток, системы сокультуры используются в качестве общего аналитического метода. Однако несколько типов...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Министерства науки и техники (105-2628-E-400-001-MY2), а также докторской программой в области тканевой инженерии и регенеративной медицины, Национальным университетом Чунг-Синг и Национальными научно-исследовательскими институтами здравоохранения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape3M Company9795R
AntibioticsBiowestL0014-100Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD softwareAutodeskAutoCAD LT 2011Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC DyeInvitrogenC2110
CellTracker Green CMFDA DyeInvitrogenC7025
Conventional ovenYEONG-SHIN companyovp45
DesiccatorBel-Art ProductsF42020-0000Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dyeBD Biosciences354218Used as a cell tracker
DMEM-F12 mediumGibco11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2PromoCellC-22022
Fetal bovine serum HycloneThermoSH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )Hamilton80630100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncherTed Pella Inc.15075with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncherTed Pella Inc.15071with 0.5mm inner-diameter
HotplateYOTEC companyYS-300S
Msak alignerDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
Oxygen plasmaNORDSON MARCHAP-300
Plasma cleanerNordsonAP-300Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kitDow corningSylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE)Ever Sharp Technology, Inc.TFT-23Tinner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape3M CompanyScotch Removable Tape 811
Silicon waferEltech corperationSPE0039
Spin coaterSynrex Co., Ltd.SC-HMI 2" ~ 6"
StereomicroscopeLeica MicrosystemsLeica E24
SU-8 10 negative photoresistMicroChemY131259
SU-8 2 negative photoresistMicroChemY131240
SU-8 2050 negative photoresistMicroChemY111072
SU-8 developerGrand Chemical CompaniesGP5002-000000-72GCPropylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pumpHarvard Apparatus703007
TrichlorosilaneGelest, IncSIT8174.0Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer SolutionGibcoR-002-100

Ссылки

  1. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  2. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  3. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804(2008).
  4. Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
  5. Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
  6. Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
  7. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340(2015).
  8. Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
  9. Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  10. Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
  11. Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
  12. Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  13. Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
  14. He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
  15. Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503(2016).
  16. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  17. Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
  18. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  19. Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
  20. Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

151

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены