Свет пятно основе анализа для анализа Drosophila Larval Фототаксис

Резюме

Этот протокол вводит световое пятно анализа для расследования Drosophila личинки фототаксического поведения. В этом анализе, световое пятно генерируется как свет стимуляции, и процесс избегания личинок света регистрируется инфракрасной световой системы визуализации.

Аннотация

Личинки Drosophila melanogaster показывают очевидное светоизбегающее поведение во время стадии кормления. Дрозофилы личинки фототаксис может быть использован в качестве модели для изучения поведения животных избегания. Этот протокол вводит свет-пятно анализа для расследования личинки фототаксиповедения. Экспериментальная настройка включает в себя две основные части: систему визуальной стимуляции, которая генерирует световое пятно, и инфракрасную световую систему визуализации, которая фиксирует процесс избегания личинок света. Этот асссепозволяет отслеживать поведение личинок перед входом, во время встречи и после выхода из светлого пятна. Детали движения личинок, включая замедление, паузу, отливку головы и поворот, можно уфиксировать и проанализировать с помощью этого метода.

Введение

Личинки Drosophila melanogaster показывают очевидное светоизбегающее поведение во время стадии кормления. Drosophila личинки фототаксис был под следствием, особенно в последние 50 лет^{1,2,3,4,5,6,7 ,8}. В последние годы, несмотря на то, что 1) многие нейроны посредничества личинок света избегания были определены^{4,5,9,10,11,12} и 2) полный коннектом личиночной зрительной системы в разрешении синапсов был установлен¹³, нейронные механизмы, лежащие в основе личиночной фототаксиса остаются в значительной степени неясными.

Ряд поведенческих анализов были использованы в изучении личиночной фототаксиса. Они могут быть в значительной степени разделены на два класса: один с участием градиентов пространственного света, а другой с участием временных градиентов света. Для пространственных анализов градиента света арена делится на равное количество секций в светлом и темном. Арена может быть разделена на светлые и темные половинки^2,4 или светлые и темные квадранты^14,15,или даже могут быть разделены на альтернативные светлые и темные квадраты, как на шашной доске^7. Как правило, агар пластины используются для пространственного света градиента асссеев, но трубки, которые делятся на альтернативные светлые и темные разделы также могут быть использованы^10,14.

В более старой версии анализов, световое освещение обычно происходит из-под личинок. Однако, освещение в более новых версиях больш возникает от выше, в виду того что larval глаза (например, органы Bolwig которые чувствительны к низкой или средней интенсивности света¹⁶⁾содержатся в непрозрачном цефалофоренгеальном скелете с отверстиями к верхний фронт. Это делает личинки более чувствительными к свету с верхних передних направлений, чем снизу позади направлений^7. Для анализов временного градиента света интенсивность света на арене пространственно однородна, но интенсивность меняется с течением времени. В дополнение к височной квадратной волны света (т.е., мигает/выключается или сильный / слабый свет^3,7),временно меняющийся свет, который соответствует линейной рампы по интенсивности также используется^для измерения чувствительности личинок к временно едкая световая стимул.

Третий тип фототаксис асссы является направленный свет пейзаж навигации, которая включает в себя освещение сверху под углом 45^"7. До работы Kane et al.⁷, только грубые параметры, такие как количество личинок в светлых и темных областях, частота поворота, и длина тропы были рассчитаны в личинок фототакси анализов. Так как работа этой же группы, с анализом высокого временного разрешения видеозаписи для личиночных фототаксисов, детальной динамики движения личинок во время фототаксиса (т.е. мгновенные скорости различных частей личиночного тела, направление движения, угол поворота и соответствующая угловая скорость) были проанализированы⁷. Таким образом, более подробную информацию о поведении личинки фототаксиса удалось обнаружить. В этих анализах личинки тестируются в группах, так что групповые эффекты не исключаются.

Этот протокол вводит световое пятно анализа для исследования личинок поведенческих реакций на индивидуальную стимуляцию света. Основная экспериментальная установка состоит из системы визуальной стимуляции и инфракрасной световой системы визуализации. В системе визуальной стимуляции светодиодный источник света генерирует круглое световое пятно диаметром 2 см на агаровой пластине, где проверяется личинка. Интенсивность света может быть скорректирована с помощью светодиодного драйвера. Система визуализации включает в себя инфракрасную камеру, которая фиксирует поведение личинки в дополнение к трем 850 нм инфракрасные светодиоды, которые обеспечивают освещение для камеры. Объектив камеры покрыт фильтром диапазона 850 нм, чтобы блокировать свет от системы визуальной стимуляции от входа в камеру, в то время как инфракрасный свет может войти в камеру. Таким образом, предотвращается вмешательство зрительной стимуляции на визуализацию. В этом анализе, поведенческие детали быстрых реакций отдельных личинок в течение периода, включая до, во время и после входа света регистрируются и анализируются.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка личинок дрозофилы

1. Приготовить стандартную среду, состоящую из вареной кукурузной муки (73 г), агара (5,6 г), соевой муки (10 г), дрожжей (17,3 г), сиропа (76 мл) и воды (1000 мл).
2. Поднимите все мухи при 25 градусах По Цельсию на стандартной среде в комнате с 12 ч/12 ч свет/темный цикл.

2. Подготовка агарных тарелок

1. Приготовьте 1,0% агар-раствор. Взвесьте 3 г агара в стакане 500 мл с балансом, затем добавьте 300 мл дистиллированной воды. Поместите фольгированную бумагу на выключатель, чтобы предотвратить испарение воды. Нагрейте стакан в микроволновой печи до кипения.
2. Вынять стакан и хорошо перемешать со стеклянным стержнем, затем нагреть в микроволновой печи до кипения. Повторяйте до тех пор, пока жидкость не будет полностью прозрачной и жидкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательное горячее решение агара должно быть свободным от пузырьков воздуха; в противном случае, заливка агара в пластину приведет к неравномерной и помятой поверхности агар пластины, которая повлияет на последующее тестирование поведения личинок. Концентрация агар-раствора не должна быть слишком высокой или низкой. Если концентрация слишком высока, световое рассеянное отражение на агаровой пластине будет сильным и размазать свет/темную границу. Если концентрация слишком низкая, личинки оставят следы на пластине. Обе эти ошибки будут препятствовать обработке видео позже в протколе.
3. Медленно налейте горячий раствор агара в чашку Петри (диаметр 15 см) до тех пор, пока дно не будет равномерно покрыто слоем агара (толщина 4 мм) и охладите при комнатной температуре (RT) до тех пор, пока раствор агара не затвердеет.
4. Агар пластины следует использовать, когда он свежеприготовленный. Если это не так, налейте слой воды на поверхность и хранить его в холодильнике при 4 градусах ПоЦельси для последующего использования.

3. Настройка системы визуальной стимуляции

1. Выберите светодиодный источник света: коллимированный светодиодный синий свет на 470 нм или теплый белый свет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Источник света может быть заменен светодиодным светом любой другой длины волны. В этом эксперименте, синий свет светодиод используется в качестве примера.
2. Roll толстый кусок алюминиевой фольги или черного картона (обеспечить непрозрачность), чтобы сформировать открытый цилиндр 12 см в длину с диаметром, похожим на синий свет светодиод с диаметром 3 см. Пусть верхний конец цилиндра крышка переднего конца синего света светодиода. Обложка нижней части с черным картоном с небольшим круглым отверстием (0,5 см в диаметре) в центре. Это представляет собой настройку системы источников света.
3. Закрепите готовый источник света на железной раме с помощью клипа, убедившись, что светодиодный свет проецируется вниз к рабочему столу. Слегка наклоните цилиндр. Угол между плоскостью цилиндра и вертикальной плоскости составляет около 10 "(см. Рисунок 1). Подключите 470 нм синий светодиодный свет на "LED1" штепсельная вилка мощный светодиодный драйвер. Включите драйвер, поверните ручку в правом верхнем углу водителя, чтобы выбрать канал 470 нм,затем нажмите светодиод. Затем, когда на экране отображается "Я", на рабочем столе появится синее светлое пятно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если цилиндр протекает свет в дополнение к небольшому круглому отверстию, рекомендуется использовать черную ленту на протекающих частях, чтобы убедиться, что только отверстие может пропустить свет через.
4. Нажмите OK и поверните ручку, чтобы настроить интенсивность света. Поверните ручку на более высокую интенсивность света 50 мА. Измерьте и запишите спектр света с помощью спектрометра.
5. Переместите положение источника света вверх и вниз, чтобы отрегулировать диаметр светлого пятна до 2 см. Рабочий стол должен быть черным для лучшего контрастного эффекта.
6. Поверните ручку, чтобы выбрать интенсивность света в соответствии с экспериментальными потребностями. Используйте компактную консоль с датчиком энергии фотодиодов для измерения максимальной и минимальной мощности света на месте, записывайте ее, измеряйте три раза и возьмите среднее значение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать датчик энергии фотодиодов для измерения интенсивности света для освещения определенной длины волны и использовать датчик тепловой энергии для измерения интенсивности света для белого света.
7. Рассчитайте интенсивность света в светлом месте, разделив измеренную световую силу по области датчика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если измеренная световая мощность в шаге 2.6 составляет 20 pW и область датчика 0.81 мм², интенсивность света составляет 24.69 pW/mm² (разделяя 20 pW на 0.81 мм^2).

4. Настройка системы визуализации

1. Зажим веб-камеры высокого разрешения с железным клипом, примерно на 10 см над светлым пятном на рабочем столе(рисунок 1).
2. Отрегулируйте ориентацию объектива камеры к рабочему столу. Подключение камеры к компьютеру через интерфейс USB.
3. Поместите агар пластины на рабочем столе прямо под камерой.
4. Откройте программное обеспечение "Amcap9.22" на компьютере с Windows 7, и световое пятно будет автоматически отображаться в окне AMcap. Переместите камеру немного влево или вправо, чтобы убедиться, что световое пятно находится рядом с центром окна. Убедитесь, что камера не блокирует световой путь. Светлое пятно должно быть полным и круглым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение можно найти в http://amcap.en.softonic.com/.
5. Исправьте фильтр диапазона 850 нм и 3 нм с зажимом на 5-7 мм прямо под камерой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр фильтра составляет около 2,5 см, а объектив камеры менее 1 см в диаметре, поэтому фильтр может покрыть поле зрения камеры. С фильтром под камерой, световое пятно не должно быть видно в окне AMcap.
6. Поместите три инфракрасных света генерирующих светодиодов (центральная длина волны 850 нм) равномерно вокруг агар пластины. Каждый светодиод должен быть около 5 см от края агар пластины, и лицо объектива светодиод должен быть на 70 "вниз угол к агар пластины. Подключите светодиоды к электропитания через конвертер ПЕРЕМЕНН к DC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше зафиксировать положения и углы инфракрасного света светодиодов, чтобы обеспечить последовательность яркости поля в различных экспериментальных испытаниях и облегчить более позднюю обработку видео.
7. Поместите черную доску между компьютером и устройством. Установите яркость экрана компьютера, чтобы экран не повлиял на эксперимент.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите окружающую среду темной при измерении длины волны или интенсивности света.

5. Установка параметров визуализации

1. В меню программного обеспечения AMcap выберите Параметры Видеоустройство Захват формата, и установить размер пикселей захваченного видео 800 х 600 и частота кадров до 60 кадров.
2. Снимите фильтр из-под камеры, положите линейку под камеру и отрегулируйте фокус камеры, чтобы шкала была четкой и параллельной ширине видеополя зрения.
3. Нажмите Захват (ru) Настройка Захват видео для выбора пути сохранения, нажмите Запись Start,запишите фактическое расстояние, соответствующее 600 пикселям, и вычислите отношение каждого пикселя к фактическому расстоянию.

6. Видеозапись поведения избегания света

1. Поддерживайте температуру 25.5 градусов по Цельсию через все эксперименты. При необходимости контролируйте температуру в помещении с помощью кондиционера. Держите влажность постоянно на 60% с увлажнителем.
2. Возьмите короткое видео положения светового пятна под названием "lightarea1". Затем переместите фильтр 850 нм и 3 нм назад, чтобы покрыть объектив камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При записи личиночного поведения, объектив камеры покрывается фильтром 850 нм и 3 нм, чтобы световое пятно не было показано на видео. Световое пятно можно реконструировать в видео с личинками позже с Matlab. Не изменяйте положение камеры и избегайте изменения соотношения каждого пикселя к реальному расстоянию, измеренного в шаге 4.3.
3. Включите свет (т.е. комнатный свет) далеко от экспериментального устройства. Выключите свет как можно ниже, до тех пор, как личинки могут быть четко видны глазами. Возьмите личинки из культуры среды с ложкой, осторожно выбрать третью личинку, и мыть его чистой с дистиллированной водой. Будьте осторожны, чтобы мыть личинки по одному, чтобы избежать вмешательства от голода. Один эксперимент требует не менее 20 личинок.
4. Перенесите личинку в центр агаровой пластины, помещенной под камерой во время шага 3.3. Аккуратно удалите лишнюю воду из личинки с помощью кисти или используйте промотирующие бумагу, чтобы удалить воду из личинки, чтобы предотвратить отражение света под объективом. Выключите свет комнаты и дайте личинке акклиматизироваться в течение 2 минут в темной среде.
5. Включите светодиодный свет для генерации инфракрасного света и аккуратно почистите личинку к центру пластины. Когда личинка начинает ползать прямо, поверните пластину, чтобы личика голову к светлому пятне. Убедитесь, что он ползет прямо с самого начала, иначе он не может получить доступ к световому пятну.
6. Нажмите Захват (ru) Настройка Захват видео, чтобы выбрать путь сохранения, затем нажмите Кнопка Запись Start для записи. Разрешить личинки ползти к светлому пятне, войти в световое пятно, а затем оставить световое пятно, пока он почти из поля зрения. Нажмите Остановить запись. Если личинка отворачивается от светового пятна, прежде чем приблизиться, прямо нажмите Stop recording.
7. Отместите фильтр от камеры. Возьмите короткое видео положения светового пятна под названием "lightarea2" и сравните его с "lightarea1", чтобы убедиться, что положение светлого пятна не изменилось. При очевидном изменении позиции отбросьте данные.

7. Анализ данных

1. Используйте SOS¹⁷ для извлечения контура тела животных и параметров движения из видео с использованием методов обработки изображений, как описано ранее¹⁷.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, включая headSpeed (скорость личинки головы), tailSpeed (скорость личиночного хвоста), midSpeed (скорость личиночной середины линии скелета), и cmSpeed (скорость личиночного центроида) были использованы для измерения скорости движения личинок. Параметры, включая headTheta (угол между линиями головы и средней точки хвоста) и headOmega (изменение скорости headTheta) были использованы для измерения личиночного изгиба тела и угловой скорости изгиба.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Согласно протоколу, исследование светового пятна было использовано для исследования поведения избегания света третьей личинки instar, которые были подняты при 25 градусах По Цельсию на стандартной среде в комнате с 12 ч/12 ч свет/темный цикл. Одна личинка w¹¹¹⁸ была протестирована с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол представляет световое пятно анализа, чтобы проверить способность личинок Дрозофилы, чтобы вырваться из света. Этот асссепозволяет отслеживать поведение личинок перед входом, во время встречи и после выхода из светлого пятна. Детали движения личинок могут быть захва...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%