В Vivo оптические изображения кальция обучения индуцированной синаптической пластичности в Drosophila меланогастер

Резюме

Здесь мы представляем протокол, с которым до и / или postsynaptic кальция могут быть визуализированы в контексте drosophila обучения и памяти. In vivo изображения кальция с использованием синапитично локализованных датчиков кальция в сочетании с классической обонятельной парадигмы кондиционирования, таким образом, что синаптической пластичности, лежащей в основе этого типа ассоциативного обучения может быть определена.

Аннотация

Десятилетия исследований во многих модельных организмах привели к нынешней концепции синаптической пластичности, лежащей в основе обучения и формирования памяти. Обучение индуцированных изменений в синаптической передачи часто распространяются по многим нейронам и уровни обработки в головном мозге. Таким образом, методы визуализации обучения зависимых синаптической пластичности через нейроны необходимы. Плодовая муха Drosophila melanogaster представляет собой особенно благоприятный модельный организм для изучения нейрональных схем, лежащих в основе обучения. Представленный здесь протокол демонстрирует, каким образом процессы, лежащие в основе формирования ассоциативных обонятельных воспоминаний, т.е. синаптической активности и их изменений, могут контролироваться in vivo. Используя широкий спектр генетических инструментов, доступных в Drosophila, можно специально выразить генетически закодированные показатели кальция в определенных популяций клеток и даже одиночных клеток. Фиксируя муху на месте, и открытие капсулы головы, можно визуализировать динамику кальция в этих клетках, обеспечивая обонятельные стимулы. Кроме того, мы демонстрируем настройку, в которой муха может быть подвергнута, одновременно, электрическим током к телу. Это обеспечивает систему, в которой мухи могут пройти классический обонятельный кондиционирования - в котором ранее наивный запах научился быть связаны с электрическим током наказания - в то же время, как представление этого запаха (и другие неподготовленные запахи) является наблюдается в головном мозге с помощью двухфотонной микроскопии. Наша лаборатория ранее сообщала о генерации синаптически локализованных датчиков кальция, что позволяет ограничить флуоресцентные сигналы кальция до или постсинаптические отсеки. Двухфотонная микроскопия позволяет пространственно разрешать мелкие конструкции. Мы иллюстрируем это, сосредоточив внимание на нейронах, интегрирующих информацию из грибного тела, центра высшего порядка мозга насекомых. В целом, этот протокол предоставляет метод для изучения синапических связей между нейронами, активность которых модулируется в результате обонятельного обучения.

Введение

Расшифровка того, где и как информация приобретается в мозге путем обучения и впоследствии хранится в качестве памяти представляет собой одну из самых сложных задач в неврологии¹. Нейронаучные исследования привели к концепции изменения в синаптической передачи в качестве нейронального субстрата, который лежит в основе обучения и формирования памяти^2,3. Предполагается, что во время обучения синаптические связи между нейрональными ансамблями, которые активны во время восприятия стимула, становятся модифицированными такимобразом, что их комбинированная активность может быть извлечена во время отзыва памяти, тем самым инструктируя будущее поведенческое действие⁴. Эти "энграммные клетки" и их синапсы часто распределены по регионам мозга и уровням обработки, что затрудняет присвоение наблюдаемых изменений в синаптической передаче изучению задачи или стимула. Для локализации и визуализации тех синапических изменений, которые причинно связаны с конкретной задачей обучения, нужна соответствующая модельная система, позволяющая точно сограничировать эти синапсы.

Для такого начинания, Drosophila melanogaster особенно подходит, потому что он сочетает в себе относительную простоту мозга, поведенческое богатство, и экспериментальной доступности. Среди устоявшихся модельных организмов, Drosophila находится между нематод C. elegans и генетически tractable млекопитающих, как мыши с точки зрения нейронной сложности. Стереотипное количество нейронов (300 евро) и ограниченный поведенческий репертуар наблюдаются в C. elegans. Млекопитающие, с другой стороны, имеют миллионы нейронов и ошеломляющей поведенческой сложности. Мозг плодовой мухи, с его 100000 фунтов, нейроны значительно меньше, чем мозг большинства позвоночных, и многие из нейронов индивидуально идентифицируемых⁵. Тем не менее, Drosophila продемонстрировать широкий спектр сложных моделей поведения, в том числе способность проявлять надежное ассоциативное обонятельное обучение и формирование памяти, впервые описано более 40 лет назад⁶. В ходе этой классической процедуры кондиционирования, группы мух подвергаются запаху в качестве условного стимула (CS⁾в то время как они получают наказание электрическим током, как безусловный стимул (США). Второй запах (CS^{- )}затем представлен без какого-либо наказания. Таким образом, животные учатся избегать запаха, связанного с наказанием, которое может быть проверено в последующей ситуации выбора между двумя запахами, CS^и CS^-. Работа по вскрытию нейронального субстрата, лежащего в основе такого поведения в Дрософиле, выявила грибные тела (МБ) в качестве основного места "энграммы"^7,8,9,10 и, следовательно, схема этой области мозга была и является предметом интенсивных исследований, с тем чтобы раскрыть логику, с помощью которой энграмма памяти приобретается и хранится (недавно рассмотрены в^11,12).

Дрозофила МБ состоит из 2000 внутренних нейронов (клеток Кеньона) на полушарие, организованных в параллельных аксональных проекциях¹³. Аксоны обонятельных проекционных нейронов распространяются на боковые протоцеребры и мБ калеки, основной дендритный вхоломестоц МБ и получают обонятельный вход из антенных долей. Длинный параллельный аксоны пучок клеток Кеньон составляют peduncle и долей. Большинство клеток Кеньона раздвоените, образуя горизонтальные доли, расширяя одно обеспечение к средней линии мозга, и вертикальные доли, расширяя второе второе секондирование в направлении дорсал-переднего. Другая группа клеток Кеньона образует горизонтальные доли¹³ МБ, где процесс обучения и последующее кратковременное формирование памяти могут быть локализованы¹⁰. МБ доли получают afferent входив и обеспечивают efferent выход, оба из которых типично ограничены к отдельно расчастью sub-области вдоль аксонов клетки Kenyon^14,15,16. В частности, афферентные дофаминергические mb входные нейроны были показаны посредничать на основе стоимости, например, карательные, усиливающие эффекты в ассоциативном обонятельном обучении^15,17. Стереотипные и индивидуально идентифицируемые эфферентные нейроны выхода МБ из долей грибного тела интегрируют информацию в большом количестве клеток Кеньона, нацелены на различные области мозга и несут поведение-поучительную аппетитную или аверсивную информацию¹⁵ . Эта нейрональная архитектура привела к концепции организации ассоциативной энграммы. Одоры относительно точно кодируются редко активированными ансамблями клеток Кеньона. Совпадение деятельности этих кеньон клеточных ансамблей и выпуск допамина - вызванные наказанием стимулов - модулирует передачу из Кеньон клетки presynapses на выброс нейронов МБ таким образом, что животные будут впоследствии избежать этого конкретного^{запаха 10 ,12}. Мы используем эту довольно точно определенную и локализованную энграмму в качестве парадигматического случая, чтобы проиллюстрировать, как можно определить и контролировать эти обучающие изменения в синаптической активности.

Значение Drosophila как модельная система сильно опирается на непревзойденный генетический инструментарий, который позволяет выразить трансгенов для выявления, мониторинга и контроля отдельных нейронов в сложных схемах¹⁸. Появление методов мониторинга нейронной активности - таких, как изображения кальция, обсуждается здесь - позволили для определения нейронной активности моделей в ответ на конкретный стимул. Комбинируя специфические Gal4-управляемые выражения генетически закодированных индикаторов кальция (GECIs) с обонятельной стимуляцией, можно визуализировать вызванную запахом динамику кальция нейронов, представляющих интерес¹⁹. В этом протоколе показано, что путем дальнейшего соединения этой техники с классической парадигмой кондиционирования, можно изучить эти обонятельные ответы в контексте обучения. Обучение индуцированной пластичности может быть дополнительно вскрыты с помощью GECIs, которые не только локализованы для одного конкретного нейрона, но и для конкретных subcompartments нейрона. Pech et al.²⁰ создали подборку инструментов, которые позволяют именно это. Ориентируясь gCaMP3²¹ либо до или postsynapse - через связь с позвоночных Synaptophysin или dГомер, соответственно²⁰- дифференциальной модуляции этих сайтов можно отличить. Эта локализация предоставляет, в этом контексте, преимущество перед большинством GECIs, которые повсеместно присутствуют во всем цитозоле - например, GCaMP²², GCaMP3²¹, или GCaMP6²³ - потому что это означает, что до и постсинаптических переходных может быть отличается от общего интегрированного притока кальция, который происходит в результате активации нейронов. Это может дать подсказки о местоположении и типах пластичности, которые возникают в результате или которые вызывают обучение и формирование памяти. В качестве примера, протокол, представленный здесь показывает значение этого инструмента в расшифровке модуляции МБ выходных нейронов во время обонятельного ассоциативного обучения, ориентируясь на выражение датчика кальция только postsynapse. Путем контролировать, внутри индивидуальная муха, запах-вызванная деятельность перед и после обонятельного кондиционирования сразу сравнение можно нарисовать между наивным реакцией запаха и выученным реакцией запаха. В то время как фиксированные в той же камере изображения, мухи подвергаются выбор запахов. Затем они получают аверсивный ассоциативный протокол кондиционирования, в котором один из этих запахов в паре с электрическим током (становясь CS⁾и другой запах представлен без подкрепления (становится CS^-). Наконец, мухи снова подвергаются тем же запахам, что и на первом этапе. Динамика кальция наблюдается с помощью двухфотонной микроскопии.

протокол

1. Трансгенные плодовые мушки, Drosophila melanogaster

1. Крест женских девственниц и самцов мух (поднятые при 25 градусах Цельсия при 60% относительной влажности на 12 ч светло/темный цикл), несущих желаемый Gal4 и UAS строит²⁵, соответственно, для производства мух, в которых конкретные нейроны, представляющие интерес, выражают генетически закодированный индикатор кальция.
2. Возраст женского потомства выше креста, пока они находятся в диапазоне 3-6 дней после эклориии. Самки мух предпочтительнее из-за их немного большего размера.

2. Подготовка плодовой мухи для визуализации кальция in vivo

1. Выберите одну самку мухи и анестезируйте на льду не более 5 мин.
2. Используя тонкие щипц, поместите муху в камеру изображения (продемонстрировано на рисунке 1c). Убедитесь, что грудная клетка и ноги находятся в контакте с электрическими проводами в нижней части камеры и что голова лежит плашмя. Закрепите положение мухи прозрачной клейкой лентой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует специально построенной камеры, в которой мухи фиксируются, с головой капсулы доступны для открытия, и мухи в состоянии получить как запах стимуляции антенн и электрическим током для грудной клетки и ног (Рисунок 1).
3. Используя хирургическое лезвие скальпеля, закрепленное на скальпеле (см. Таблица Материалов),вырежьте окно в ленте вокруг головы мухи, оставляя антенны покрытыми и только переднюю большую часть грудной клетки подвергается.
4. Окружите бока и затылок сине-световым лечащий клей, тщательно манипулируют с помощью булавки с насекомыми, удерживаемыми вогнутыми выпуклой челюстями. Установите клей с помощью синей светоизлучающей светодиодной лампы.
5. Убедитесь, что клей полностью установлен и очистить любой остаточный незакаленный клей из торцевой поверхности мухи головы.
6. Нанесите каплю раствора Ringer²⁴ (см. таблицу материалов),чтобы покрыть открытые кутикулы головы.
7. Используя очень тонколопастный нож, прорежьте кутикулу. Для наиболее эффективного удаления кутикулы, сначала вырезать через заднюю часть головы с помощью ocelli в качестве отправной точки. Затем, разрезать каждую сторону, медианный к глазам, чтобы сформировать лоскут кутикулы, которые могут быть легко оторваны с помощью щипцы.
8. Удалите избыток кутикулы, которые могут блокировать область мозга интерес.
9. Тщательно очистить тонкую поверхность любой трахеи с помощью тонких щипцы, избегая нарушения ткани мозга себя. Удалите и освежите решение Ringer²⁴ (см. Таблица материалов),как это необходимо для очистки области тканевого мусора.
10. Поместите иглу доставки подкожного запаха в положении, примерно 1 см от головы мухи. Убедитесь, что нет ничего, что может помешать доставке запаха к антеннам.
11. На микроскоп, подключить камеру изображения к системе доставки запаха через подкожный запах доставки иглы.
12. Чтобы позволить мухе полностью восстановиться после анестезии и хирургического вмешательства, а также адаптироваться к воздушному потоку, на данном этапе внедрить 10-минутный период отдыха.

3. In vivo изображения кальция

1. Используйте мультифотонный микроскоп, оснащенный инфракрасным лазером и целью погружения воды (см. Таблица Материалов),установленный на вибрационно-изолированном столе. Для визуализации индикаторов кальция на основе GFP настройте лазер на длину волн 920 нм и установите фильтр диапазона GFP.
2. Используя грубую ручку регулировки, сканировать через ось мозга и найти область мозга, представляющих интерес. Используйте функцию урожая, чтобы сфокусировать сканирование только на этой области, чтобы свести к минимуму время сканирования, и повернуть вид сканирования таким образом, чтобы передняя часть головы обращена вниз.
3. Отрегулируйте размер кадра до 512 х 512 px, скорость сканирования до 4 Гц, и область сканирования (в измерении Y), так что нейроны, представляющие интерес покрыты.

4. Визуализация запаха вызванных кальция переходных через обонятельные кондиционирования

1. Используйте систему доставки запаха^19,26, которые могут доставить несколько стимулов запаха в временно точной манере.
   1. Используйте дополнительный компьютер для управления устройством, а также для связи с микроскопом изображений программного обеспечения для координации запаха стимуляции с захватом изображения во время экспериментов.
   2. Инициировать запрограммированный макропакет, способный увязывать программное обеспечение для приобретения изображений и программу доставки запаха (например, макропакет VBA, установленный в программном обеспечении для управления микроскопом, см. Таблица материалов),который реагирует на внешний входный триггер, предоставляемый инициационным протоколом доставки запаха в отдельной программе).
2. Начните измерение путем мониторинга "предварительной подготовки" / наивный запах-вызванных кальция переходных с разрешением 512 х 512 р-н и частота кадров 4 Гц. Доставьте 2,5 s запах стимулом в окружении дополнительного приобретения изображения для 6,25 с предшествующим запахом начала (для создания F ₀ базового значения) и 12,5 с после смещения запаха. Повторите это со вторым запахом, а затем с третьим запахом.
3. Продолжить 3 мин после этого измерения с классическим кондиционирования ("обучение") летать.
   1. Выберите один из запахов, представленных в "предварительной подготовки" фазы, чтобы стать CS^запах, а другой, чтобы стать CS^- запах. Представляем CS^и запах с помощью управляемой компьютером системы доставки запаха для 60 с наряду с двенадцатью 90 V электрическим током.
   2. После 60-х годов перерыва, представить CS^- запах только для 60 s. Использование в качестве одорантов 4-метилциклокексанол и 3-октанол. Не презентуйте третий одорант (например, 1-октен-3-ол) во время этого обучения, так как он используется в качестве контроля только до (шаг 4.2.) и после (шаг 4.4) фазы обучения.
4. Измерьте "пост-обучение" запах вызвал кальция переходных снова, повторяя "предварительной подготовки" протокол стимуляции запаха (шаг 4.2.) 3 мин после окончания этапа обучения (шаг 4.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки этого шага должны отражать время интереса после формирования памяти (например, выполнить этот шаг 3-4 мин после шага кондиционирования для исследования кратковременной памяти). Как правило, мухи могут выжить в течение нескольких часов в этом препарате.
5. Сохранение файлов изображений в соответствующем формате (например, Tiff) для последующего анализа изображений.

5. Анализ изображений

1. Для анализа изображений откройте Файлы Tiff (или аналогичные) в программном обеспечении для анализа изображений, таких как Fiji²⁷.
2. Выравнивать стеки с помощью алгоритма коррекции движения, чтобы обеспечить минимальное движение в направлениях X и Y. Откажитесь от любых записей, которые показывают сильное движение в оси.
3. Выберите инструмент программного обеспечения, используемого для обозначения региона, интересуемого (ROI) вокруг области, которая должна быть изучена. Это должно быть максимально точным, чтобы ограничить влияние фоновой флуоресценции.
4. Используйте соответствующий инструмент программного обеспечения для извлечения данных интенсивности височной флуоресценции в качестве файлов данных из выбранной рентабельности инвестиций, таким образом, что значение генерируется для каждого кадра записи.
5. Откройте данные с помощью программы анализа данных для расчета значений QF/F₀ для каждого следа запаха. F₀ - средняя флуоресценция в 2 с до начала запаха. Разница между сырой флуоресценцией в данной раме и F₀. Из этих значений вычислите значение F/F₀ для каждого кадра, которое может быть построено на основе времени, чтобы отразить относительную флуоресценцию на протяжении всего периода стимулирования запаха.

Результаты

Пример изображений, полученных с помощью вышеуказанного протокола, можно увидеть на рисунке 2. г Гомер-GCaMP3 выражается в МБ выход ногой нейрон, дендриты которого inendvate отсек 1 из MB-lobe (нейрон называется MVP2^28,29) и генетиче...

Обсуждение

Вскрытие нейронной схемы, лежащей в основе обучения и памяти, является важной целью в области неврологии. Генетическая доступность дрозофилы и широта и простота поведенческого тестирования делают это идеальным инструментом для исследования таких явлений. Здесь представлен мето?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape	Tesa SE, Norderstedt, Germany		Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany	4665120	1.20x40mm
Insect Minutien pins	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blue light-curing glue
Microscope slide	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	0656.1	Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution	n.a.	n.a.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Product No. 11
Surgical scalpel handle	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope.	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.