Method Article
В данной работе мы представляем гибридизационный анализ in situ нового поколения для идентификации специфических последовательностей вирусной РНК или ДНК в тканях, залитых формалином и залитым парафином (FFPE). Этот подход позволяет визуализировать низкие копии РНК и ДНК менее чем за 24 ч с очень высокой чувствительностью и специфичностью.
Гибридизация in situ является мощным методом идентификации специфических последовательностей РНК или ДНК в отдельных клетках в срезах тканей, обеспечивая важную информацию о физиологических процессах и патогенезе заболевания. Гибридизация in situ (ISH) использовалась в течение многих лет для оценки местоположения клеток, инфицированных вирусами, но недавно был разработан подход ISH нового поколения с уникальной стратегией проектирования зонда, которая позволяет одновременно усиливать сигнал и подавлять фон для достижения визуализации одной молекулы при сохранении морфологии ткани. Этот метод ISH нового поколения основан на подходе, подобном разветвленной ПЦР, но выполняется in situ и является более простым, чувствительным и воспроизводимым, чем классические методы ISH или подходы ПЦР in situ при рутинном обнаружении РНК или ДНК в тканях, залитых формалином и парафином (FFPE). В течение последних нескольких лет наша лаборатория применяет эту платформу ISH для обнаружения вирусной РНК (vRNA) иммунодефицита человека (ВИЧ) и иммунодефицита обезьян (SIV) и/или вирусной ДНК (vDNA) положительных клеток во множестве тканей FFPE. С помощью этой подробной технической рукописи мы хотели бы поделиться нашими знаниями и советами со всеми людьми, заинтересованными в использовании ISH нового поколения в своих исследованиях.
ISH — это экспериментальный подход, используемый для нацеливания и визуализации комплементарных нитей ДНК, РНК или модифицированных нитей нуклеиновых кислот (т.е. зондов) к конкретным последовательностям ДНК или РНК в клетке или участке ткани. ISH позволяет точно локализовать и визуализировать конкретные нуклеиновые последовательности в тканях, что важно для понимания уровня экспрессии, организации, распределения и взаимодействия между мишенью и ее клеточной средой, что является ценной информацией, которую невозможно получить с помощью других популярных методов, таких как количественная ПЦР. До недавнего времени ISH обычно выполняли либо с меченой комплементарной ДНК, либо с комплементарной РНК (рибозондом). Эти зонды либо непосредственно конъюгировали с радио-, флуоресцентными или антиген-мечеными основаниями (например, 35S, FITC и дигоксигенином), либо локализовали и количественно оценивали в ткани с помощью методов ауторадиографии, флуоресцентной микроскопии или иммуногистохимического детектирования, соответственно. Несмотря на то, что эти технологии in situ по-прежнему являются ценными подходами, существуют широкие возможности для совершенствования для разработки менее трудоемких, более простых, быстрых, чувствительных и специфичных подходов.
Альтернативный коммерческий подход к ISH нового поколения (например, анализ РНК), впервые описанный в 2012 году, для обнаружения матричной РНК хозяина (мРНК) основан на разветвленной ПЦР. Детектирование мРНК выполняется в клетках и тканях FFPE, при этом чувствительность приближается к визуализации одной молекулы РНК в отдельных клетках1. Специфичность этого подхода достигается при единственном условии, что два зонда-мишени с двойным Z связываются непрерывно со своими соответствующими комплементарными последовательностями РНК (или ДНК) для последовательногосвязывания сигнального предусилителя 1. Это позволяет инициировать каскад амплификации сигнала с помощью последующих этапов гибридизации, аналогичных разветвленной ДНК (бДНК)1,2. Кроме того, этот подход удивительно быстр и прост, с результатами, полученными всего за 1 день (<8 ч), что является значительным преимуществом по сравнению с 4 неделями при использовании альтернативных методов, включая Radio-ISH 1,2. Этот ISH нового поколения открыл новые перспективы и возможности для исследований ВИЧ/ВИО. Основными препятствиями на пути к излечению ВИЧ являются клеточные и тканевые резервуары, которые формируются на ранних стадиях заболевания 3,4. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы идентифицировать, локализовать и, в конечном итоге, понять основные тканевые компартменты, которые действуют как вирусный резервуар и являются стойкими внутри инфицированного хозяина. Это, в свою очередь, поможет в разработке эффективных стратегий лечения ВИЧ.
В этой рукописи мы подробно описываем наш дуплексный протокол ISH для мультиплексирования РНК/ДНК нового поколения (например, RNAscope/DNAscope) и объясняем, как мы модифицировали существующий протокол ISH РНК для оптимизации ISH следующего поколения для наших образцов и конкретных мишеней. Этот протокол позволяет визуализировать, локализовать и количественно оценить вирусную РНК и вирусную ДНК ВИЧ/ВИО в пределах срезов ткани размером 5 мкм. Одновременная визуализация как вРНК, так и вДНК осуществляется путем объединения двух пользовательских наборов зондов: одного, нацеленного на кодирующую цепь вДНК (C1 SIVmac239 Gag-Pol-Sense зонд [416141-C1]), и одного антисмыслового, нацеленного на транскрипты вРНК (C2 SIVmac239 Vif-Env-Nef-Tar-Anti-Sense зонд [416131-C2]), охватывающего различные области вирусного генома (Таблица 1), используя два разных канала визуализации, C1 и C2. В этом протоколе каналы C1 и C2 позволяют визуализировать сигналы разными цветами (т.е. AP красным цветом и HRP коричневым) и обнаруживать зонды с разными подходами. Без учета обработки фиксации тканей и разреза, этот анализ занимает 2 дня. Здесь представлен протокол гибридизации дуплексной вРНК и вДНК in situ, который может быть выполнен на клеточных гранулах или срезах тканей.
1. Подготовка секций и слайдов
2. Подготовка духовки
3. Извлечение эпитопов, вызванное теплом
4. Предварительная обработка протеазы
5. Гибридизация зондов и усиление сигнала
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить испарение, убедитесь, что лотки с контролируемой влажностью надежно закрыты, чтобы ткани не высыхали на этапах инкубации. Поместите камеру влажности обратно в духовку на этапе стирки, чтобы убедиться, что она остается на уровне 40 °C.
6. Обнаружение сигнала цели по каналу 1 (C1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это выполняется с использованием красной щелочной фосфатазы и быстрой амплификации красного хромогена 6 из наборов для 2-плексного детектирования (см. Таблицу материалов), содержащих метки щелочной фосфатазы, и хромогенного детектирования. Он использует быстрый красный цвет в качестве подложки для генерации красного сигнала.
7. Обнаружение сигнала цели по каналу 2 (C2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это выполняется с использованием коммерчески доступных наборов хромогенов Brown HRP и DAB (см. Таблицу материалов). Амплификация 10 от 2-плексного детектирования содержит метки пероксидазы хрена, а хромогенное детектирование выполняется с использованием DAB для генерации коричневого сигнала.
8. Противодействие и монтаж
9. Протокол количественного анализа изображений для РНК-скопа с использованием CellProfiler5
В предыдущей рукописи 2,6,7,8,9,10,11 мы сообщали, что платформы ISH следующего поколения, обнаруживающие либо вРНК, либо вДНК, могут быть объединены с использованием сенсорных зондов (vDNA), нацеленных на 5'-gag-pol часть генома SIV/HIV, и антисмысловых зондов (vRNA), нацеленных на гены в 3'-половине генома (vif, vpx, vpr, tat, env и nef), а также элемент TAR в 5'-геноме (табл. 1). Этот подход отличает транскрипционно активные клетки (vRNA+, vDNA+) от транскрипционно неактивных (предположительно латентно) инфицированных клеток или клеток, содержащих транскрипционно некомпетентные провирусы (vRNA-, vDNA+) в том же участке ткани2 (рис. 1).
Рисунок 1: Обнаружение вирусной РНК и vDNA в одном и том же срезе ткани. Комбинация анализа гибридизации РНК (красный) и гибридизации ДНК (коричневый) в остро инфицированном SIV лимфатическом узле RM, демонстрирующая способность обнаруживать вРНК и вДНК в одном и том же участке ткани и обеспечивающая эффективный подход к идентификации транскрипционно молчащих vDNA+ vRNA-клеток in situ. Этот рисунок был изменен по Deleage C. et al.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Наборы зондов для одиночной плексной РНК/ДНК | |||
Имя | Каталог ACD # | Количество ZZ | Описание |
SIVmac239 (Антисмысл) | 312811 | 83 | Нацеливание антисмыслового зонда в диапазоне 1251-9420bp от D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env и nef) |
SIVmac239 (Чувство) | 314071 | 83 | Сенсорный зонд, нацеленный на обратную цепь в пределах 1251-9420 bp от D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env и nef) |
V-HIV1-клада А (антисмысловая) | 416101 | 80 | Нацеливание антисмыслового зонда в пределах 879-7629bp HIV-1 Clade A Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, and nef) |
V-HIV1-клада А (смысл) | 426341 | 80 | Зонд Sense, нацеленный на обратную цепь в пределах 879-7629 bp от HIV-1 Clade A Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, and nef) |
V-HIV1-клада B (антисмысловая) | 416111 | 78 | Нацеливание антисмыслового зонда в пределах 854-8291bp от AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, and nef) |
V-HIV1-клада B (Sense) | 425531 | 78 | Зонд Sense, нацеленный на обратную цепь в пределах 854-8291.о. от AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, and nef) |
V-HIV1-клада D (антисмысловая) | 416121 | 76 | Нацеливание антисмыслового зонда в пределах 894-7697bp HIV-1 Clade D Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef) |
V-HIV1-клада D (смысл) | 426351 | 76 | Зонд Sense, нацеленный на обратную цепь в пределах 894-7697bp от HIV-1 Clade D Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef) |
Наборы мультиплексных зондов для РНК/ДНК | |||
Имя | Каталог ACD # | Количество ZZ | Описание |
V-SIVmac239-gag-pol-Sense-C1 | 416141-С1 | 40 | Сенсорный зонд, нацеленный на обратную цепь в пределах 1251-4093bp от D01065.1 (gag и pol) |
V-SIVmac239-vif-env-nef-tar-C2 (Антисмысл) | 416131-С2 | 47 | Нацеливание антисмыслового зонда в пределах 5381-10257bp от D01065.1 (vif, vpx, vpr, tat, env, nef и элемент TAR) |
V-HIV1-Clade_B-gag-pol-sense-C1 | 444051-С1 | 40 | Сенсорный зонд, нацеленный на обратную цепь в пределах 854-3940.о. от AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag и pol) |
V-HIV1-Clade_B-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Антисмысл) | 444061-С2 | 40 | Нацеливание антисмыслового зонда в пределах 5042-9673.о. от AF324493,2,, HIV-1 Clade B NL4-3 (vif, vpr, tat, env, nef и элемент TAR) |
V-HIV1-Clade_C-gag-pol-sense-C1 | 444021-С1 | 48 | Зонд, нацеленный на обратную цепь в пределах 888-5032.о. последовательности переписи HIV-1 Clade C (gag и pol) |
V-HIV1-Clade_C-vif-vpr- rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Антисмысл) | 444041-С2 | 49 | Нацеливание антисмыслового зонда в пределах 5078-9698.о. последовательности переписи HIV-1 Clad C (vif, vpr, tat, env, nef и элемент TAR) |
V-HIV1-Clade_AE-gag-pol-sense-C1 | 444011-С1 | 55 | Сенсорный зонд, нацеленный на обратную цепь в пределах 890-4812.о. от AF259954.1, клада ВИЧ-1 AE (кляп и пол) |
V-HIV1-Clade_AE-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Антисмысл) | 444031-С2 | 57 | Нацеливание антисмыслового зонда в пределах 5052-9694.о. от AF259954.1, HIV-1 Clade AE (vif, vpr, tat, env, nef и элемент TAR) |
Таблица 1: Список зондов, нацеленных на вРНК и вДНК ВИЧ-1 и ВИО.
Гибридизация in situ — это тщательный анализ, требующий строгости и базовых знаний химии нуклеиновых кислот, клеточной биологии и гистологии, чтобы иметь возможность адаптировать каждый критический шаг для локализации мишени в хорошо консервативной среде. В этом обсуждении мы хотели бы выделить важнейшие этапы, в которых устранение неполадок имеет решающее значение для получения точных и интерпретируемых результатов.
Фиксация и обработка тканей имеют решающее значение и должны быть рассмотрены заранее, чтобы убедиться, что анализ может дать наилучшие результаты. Нейтральный буферизованный фиксатор PFA (4% свежеприготовленного) является оптимальным для дуплексного анализа. Тем не менее, анализ также может быть выполнен на замороженных тканях (ОКТ) с соответствующими условиями фиксации после криосекции.
Предварительная обработка участков тканей является важным этапом. В этом анализе есть два этапа предварительной обработки: первый — это индуцированное тепловым извлечением эпитопов (HIER). Этот шаг важен для реверсирования поперечных связей метиленового моста и восстановления белковых структур, что необходимо в неподвижных тканях. Эффективность этой обработки зависит от времени, температуры, типа буфера для извлечения и pH. Вторая предварительная обработка представляет собой индуцированное протеазой извлечение эпитопов (PIER). На этом этапе расщепляются пептиды, обнажая антиген или нуклеотиды, и используются ферменты, включая протеиназу К, трипсин и пепсин. Это чрезвычайно чувствительный шаг, который потенциально может повредить как морфологию ткани, так и интересующую мишень. Концентрация фермента, а также время и температура инкубации имеют решающее значение в этом процессе. Переваривание приводит к плохой демаркации ядер и затруднению этапов количественной оценки. Крайне важно найти баланс между оптимальным доступом к мишени РНК/ДНК и условиями до лечения, которые не повреждают интересующую ткань или мишень. Каждый тип тканей имеет разный уровень чувствительности к каждой из этих предварительных обработок, и каждый параметр (концентрация фермента, время, температура) должен быть эмпирически проверен.
Строгость буфера для стирки основана на трех основных параметрах: температуре, концентрации солей и моющих средств, а также времени. Буфер для промывки представляет собой буфер цитрата натрия с солевым раствором (SSC), а концентрация соли в буфере контролирует жесткость на этапах промывки. В своем протоколе ACD советует использовать буфер для промывки при конечной концентрации 0,1x SSC, 0,03% додецилсульфата лития. Работая над оптимизацией ДНК и мультиплексирования, мы определили, что использование промывочного буфера в конечной концентрации 0,05x SSC дало нам лучшие результаты для визуализации сигнала ДНК и значительно помогло снизить неспецифическую нецелевую гибридизацию в результате ночной инкубации сенсорного зонда.
Перед началом анализа необходимо обдумать выбор метода обнаружения, хромогена (красного или коричневого) или флуоресценции, исходя из типа ткани и цели. Хромогенный подход к красному цвету даст хороший контраст, потому что красный цвет в природе не содержится в тканях. Коричневый хромоген даст результаты, аналогичные красному хромогену. Тем не менее, важно иметь в виду, что некоторые продукты деградации крови, присутствующие в ткани, имеют схожий цвет, и чернила для татуировки будет трудно отделить от коричневого сигнала при количественном определении. Подход к обнаружению флуоресценции позволит четко различать различные клеточные маркеры, а мультиплексирование обеспечит идеальный анализ для фенотипирования клеток, несущих вРНК и/или вДНК.
Для обеспечения специфичности зондов и качества анализа необходим многократный контроль. Каждый вновь разработанный зонд должен быть протестирован на известных положительных и отрицательных контрольных тканях или клеточных гранулах. Мы часто генерируем плазмиды, содержащие нашу целевую последовательность, и выполняем трансфекцию в клеточные линии для получения положительного контроля. Для каждого прогона мы добавляем заведомо отрицательную ткань (ВИЧ или SIV отрицательную), контроль без зонда, содержащий только разбавитель зонда, и контроль, обработанный РНКазой, чтобы обеспечить качество и специфичность анализа.
Количественная оценка является чрезвычайно важным этапом и должна быть выполнена с использованием соответствующих инструментов и алгоритмов в зависимости от заданного вопроса. В этой рукописи мы представили программное обеспечение для анализа изображений (например, Cellprofiler), которое мы выбрали после оценки нескольких вариантов. Мы подсчитали, что это программное обеспечение было лучшим для наших нужд, но существует множество программ для анализа изображений, которые можно было бы использовать.
Авторам нечего раскрывать.
Этот проект был полностью профинансирован за счет федеральных средств от Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, по контракту No. HHSN261200800001E и грантом Орегонского национального исследовательского центра приматов NIH P51OD011092 (J.D.E). Содержание данной публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, а упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США. Дуплекс был разработан с помощью Advanced Cell Diagnostics.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ACD HybEZII Hybridization system (110V) with ACD EZ-Batch Slides system | ACD | 321710 | Hybridization oven |
CAT Hematoxylin | Biocare medical | CATHE-GAL | colorstain |
Clear-Mount | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 17985-15 | mounting reagent for red chromogen |
Immpact DAB Peroxidase Kit | Vector | SK-4105 | Used to reveal HRP - DAB (Brown) to replace the DAB coming in the ACD kit |
lithium carbonate | Fisher chemical | L119-500 | bluing solution |
paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15714-S | for tissue fixation (4%) |
PBS | life technology | 14190-136 | |
Permount Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | SP15-100 | mounting regaent for brown chromogen |
Prolong Gold | ThermoFisher Scientific | P36930 | mounting regaent for fluorescence |
ribonucleases A | ThermoFisher Scientific | 12091039 | for RNAse treatment in DNAscope protocol |
ribonucleases T1 | Roche | R1003 | for RNAse treatment in DNAscope protocol |
RNAscope 2.5, 2-plex detection reagent | ACD | 322430 | Brown and red kit chromogen detection |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD | 322000 | retrieval buffer |
SuperFrost Plus Glass Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-17 | |
TBS | BOSTON BIOPRODUCTS | BM-301-4L | for washes |
TSA Plus Fluorescence palette kit (Cy3, Cy5, TMR, Fluorescein) | Perkin elmer | NEL760001KT | HRP Fluorescence detection |
Tween 20 | SIGMA | P1379-1L | for washes |
XYLENE 20LT | ThermoFisher Scientific | AC422680200 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены