JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью данного протокола является формирование ансамблей молекулярных двигателей на наноструктурах ДНК оригами и наблюдение за подвижностью ансамбля с использованием общей внутренней флюоресценцийной микроскопии.

Аннотация

Цитоскелетные двигатели отвечают за широкий спектр функций в эукариотических клетках, включая митоз, грузовой транспорт, подвижность клеток и другие. Многие из этих функций требуют, чтобы двигатели работали в ансамблях. Несмотря на богатые знания о механизмах отдельных цитоскелетных двигателей, сравнительно меньше известно о механизмах и возникающих поведениямоторных ансамблей, примеры которых включают изменения в процессиальности ансамбля и скорости с изменение номера двигателя, местоположения и конфигурации. Структурная нанотехнология ДНК и специфическая техника ДНК оригами позволяют молекулярно строить четко определенные архитектуры моторных ансамблей. Под контролем можно управлять формой грузовых конструкций, а также типом, количеством и размещением двигателей на конструкции. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для производства этих ансамблей и наблюдения за ними с помощью общей внутренней флуоресценции флуоресценции микроскопии. Хотя эти методы были специально применены для цитоскелетных двигателей, методы обобщаются для других белков, которые собираются в комплексах для выполнения своих задач. В целом, метод ДНК оригами для создания четко определенных ансамблей моторных белков является мощным инструментом для вскрытия механизмов, которые приводят к возникающим мотилированного поведения.

Введение

Динейн и кинезин являются цитоскелетные моторные белки, ответственные за множество функций в эукариотических клетках1. Преобразовывая химическую энергию гидролизов АТФ в производительную работу, эти двигатели перемещают на микротрубах для перевозки и распределения различных внутриклеточных грузов. Они также координируют свои действия в массовых внутриклеточных перестановках, связанных с митозом, где они проявляют организованные силы, способствующие распозиции и разделению хромосом. Структурные, биохимические и биофизические анализы, включая наблюдения за одной молекулой, выявили механизмы этих двигателей на индивидуальном уровне (хорошо рассмотрены в предыдущих работах2,3,4). Тем не менее, многие из задач двигателей требуют, чтобы они работали в небольших ансамблях как аналогичных, так и смешанных типов двигателей. Сравнительно меньше понимается о механизмах, которые координируют деятельность и конечную возникающие подвижность этих ансамблей5,6. Этот разрыв в знаниях отчасти объясняется трудностями в создании ансамблей с управляемыми функциями, такими как тип двигателя и номер копии. За последнее десятилетие для решения этой проблемы использовались методы молекулярной конструкции ДНК-оригами. Для микротрубочек на основе двигателей, некоторые примеры этих исследований включают в себя одной молекулы наблюдений ансамблей цитоплазматического динейна-17,8,9, интрафлагеллар dynein11, различные кинезинные двигатели12,13,и смеси как диньинов, так и кинезинов7,14,15. Здесь мы предоставляем подробную информацию об очистке и олигонуклеотидной маркировке двигателей из дрожжей7,16,17,18,19,20, складывание и очистка сегментированных ДНК оригами с tunable соответствия8, и изображения дрожжевых двигателей, движущих конструкций шасси7,18.

Построение моторных ансамблей для наблюдения одной молекулы in vitro требует трех основных усилий. Во-первых, это экспрессия, очистка и маркировка конструкций двигателя, пригодных для присоединения к ДНК оригами. Во-вторых, производство и очистка определенных структур ДНК оригами (часто называют "шасси"). И третье - спряжение двигателей к конструкции шасси с последующей наблюдением с использованием общей внутренней отражения флуоресценции (TIRF) микроскопии. Здесь мы предоставляем установленные протоколы для этого процесса для рекомбинантных микротрубоукладных двигателей, очищенных от дрожжей Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. ДНК оригами основе моторных ансамблей были исследованы с использованием рекомбинантных кинезин15 и dynein7,8,18 конструкций, произведенных в этой системе выражения дрожжей16 ,17,18,19. Этот протокол действителен для этих конструкций, учитывая, что они контролируются галактозой индуцированного промоутера, и сливается с теми же теги белка для очистки (я и TEV протеазы связующее) и для спряжения олиго ДНК (SNAPtag).

Специфические штаммы дрожжей производят специфические конструкции двигателя. Например, динейн, используемый для изучения роли соответствия груза, очищался от штамма RPY10847,8. В целом, штаммы, содержащие моторные конструкции с соответствующими генетическими модификациями для выражения и очистки, могут быть запрошены у лабораторий, опубликовав использование этих двигателей. Конструкции с новыми атрибутами, такими как мутации или теги, могут быть сделаны с использованием рекомбинантных генетических методов, таких как преобразование литий-ацетата21 и коммерческие наборы. Подробные протоколы для создания модифицированных моторных белков в дрожжах для одного исследования молекулы были опубликованы19. В дополнение к двигателям, слитым в СНАПтаг, олиго, используемые для маркировки двигателей, должны быть спряжены с субстратом SNAP, бензилгуанином (БГ); ранее опубликованные протоколы описывают формирование и очищение BG-oligo конъюгирует18. Общая стратегия, описанная здесь, также используется для двигателей на основе actin (см. предыдущие работы для примеров22,23,24),и двигателей, очищенных от других организмов и систем выражения (см. предыдущий работает для примеров7,9,10,11,12,13,14).

Полимеризованные микротрубочки (МТ) используются в этих экспериментах в двух различных процедурах. MT сродство очистки функциональных двигателей требует MTs, которые не помечены с другими функциональными группами, в то время как двигательно-ансамбльподвижность TIRF ассс требует MTs помечены биотин и фторофоры. Во всех случаях, MTs стабилизируются с таксолом для предотвращения денатурации. Шаг очистки сродства MT используется для удаления любых не-мотиловых двигателей с высоким сродством МТ, так как эти двигатели могут изменить подвижность ансамбля, если они спрягиваются к шасси. Во время этого процесса активные двигатели отвязывают МТ и остаются в растворе, в то время как плотные связывающие двигатели вращаются в гранулах Mt. Это помогает гарантировать, что все двигатели на шасси от активной популяции.

Разнообразие структур ДНК оригами были использованы для изучения цитоскелетных двигательных ансамблей. По мере того как механистическое понимание ансамблевого транспорта росло, структуры ДНК оригами, используемые в экспериментах, росли в сложности. В принципе, любая структура может быть адаптирована для этой цели при условии, что она будет изменена, чтобы включить одноцепочечные участки вложения ДНК для двигателей и фторфоров. Конкретные конструкции шасси и атрибуты могут быть полезны для зондирования конкретных вопросов о возникающих поведение двигателей ансамблей. Например, жесткие стержни были использованы для разработки основополагающих знаний о том, как номер копий влияет на транспортировку командами динейнов и кинезинов7,15,18,и 2D платформы были использованы для изучения миозина ансамбля навигация актинских сетей22. Структуры с переменной или настраиваемой гибкостью были использованы для понимания роли эластичного соединения между двигателями и для зондирования того, как синхронизация шага влияет на подвижность8,24. В последнее время сферические структуры используются для получения информации о том, как геометрические ограничения на привязку двигателя влияют на динамику подвижности25.

В этом протоколе мы предлагаем конкретные шаги для ансамблевых экспериментов на сегментированном шасси с переменной жесткостью. Связывание сайтов на шасси иногда называют "ручками", в то время как дополнительные последовательности ДНК, которые связывают эти ручки, называются "антиручками". Количество двигателей на этих шасси определяется тем, какие сегменты содержат расширенные скобы рукоятки с дополнением к антихендному олиго на олиго-маркированных двигателях. Использование различных последовательностей рукояток на разных сегментах позволяет привязывать различные типы двигателей к определенным местам на шасси. Подробное здесь шасси состоит из 7 последовательных жестких сегментов, каждый из которых состоит из 12 двухцепочечных сипов ДНК, расположенных в 2 концентрическихкольцах 8. Строгие сегменты содержат моторные ручки и соединены через области, которые могут быть либо гибкой одноцепочечной ДНК или жесткой двухцепочечной ДНК, в зависимости от отсутствия или присутствия, соответственно, "связующих" скобы. Соответствие конструкции шасси, таким образом, определяется наличием или отсутствием этих "связных" скобок. Смотрите предыдущие отчеты для получения более подробной информации и конкретных последовательностей ДНК8. Кроме того, несколько методов могут быть использованы для очистки шасси26. Здесь описан метод центрифугации градиции тарифного зонального глицерола27.

протокол

1. Рост, экспрессия и сбор моторных белков, контролируемых галактозой индуцированного промоутера

  1. Используя пластину культуры дрожжево-пептон-деэкстроза (YPD) и стерильную инокуляционную палочку, полоса желаемого замороженного штамма дрожжей и инкубирует сяврж в течение 3-4 дней при 30 градусах Цельсия.
  2. День 1 роста культуры: Во второй половине дня, добавить 10 мл YP культуры средств массовой информации с 2% декстроза в 1 " диаметр стеклянной культуры трубки и прививать его с одной колонии из пластины. Расти в быстро вращающейся роликовой бочке при 30 градусах Цельсия в одночасье.
  3. День 2: Во второй половине дня, передача 10 мл культуры 250 мл колбу, содержащую 50 мл YP культуры средств массовой информации с 2% рафинозы. Инкубировать ночь при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 250 об/мин на орбитальном шейкере.
  4. День 3: Во второй половине дня, передача 60 мл культуры 3 L колбу, содержащей 1 L из YP культуры средств массовой информации с 2% galactose. Инкубировать ночь при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 250 об/мин на орбитальном шейкере.
  5. День 4: Начиная с середины утра, контролировать оптическую плотность (OD) культуры на 600 нм каждые 2 ч. Когда культура находится между OD 1.5 и 2, продолжайте следующие шаги по сбору клеток. Сбор за пределами этого диапазона OD может снизить урожайность из-за низкого количества клеток до OD 1.5, или клеточной quiescence и деградации белка выше OD 2.
  6. Декантная клеточная культура в центрифуги бутылки и спина на 6200 х г при 4 кв кв в течение 8 мин. Налейте супернатант и отбросить.
  7. Приостановите действие клеточной гранулы в бутылке с двойной дистиллированной H2O (ddH2O).
  8. Спин клетки на 6200 х г при 4 кв КС в течение 8 мин. Налейте супернатант и отбросить.
  9. В зависимости от вязкости клеточных гранул, добавить до 2 мл ddH2O, чтобы создать раствор жидкости достаточно для трубачства.
  10. Используя моторизованный контроллер пипетки, оснащенный пипеткой 10 мл, медленно распределяйте суспензию клетки в жидкий азот по одной капле за раз. Это будет производить замороженные гранулы дрожжевых клеток.
  11. Храните замороженные ячейки при -80 градусов по Цельсию до готовности к очистке.

2. Очищение моторных белков от дрожжевых клеток

  1. Лиза клеточного и растворимого белка
    1. Приготовьте 1 мл свежего раствора 0,1 М PMSF в чистый этанол. Подождите, чтобы добавить PMSF в водные буферы, поскольку он нестабилен в воде; кроме того, избегайте воздействия воды до 20 мин (приблизительное период полураспада ПМСФ в воде) использования.
    2. Подготовка 50 мл 4x лисис буфера на льду с добавками из 5x запас омиса буфера, но не добавляйте PMSF до тех пор, пока буфер применяется к дрожжевой гранулы.
    3. Измельчите жидкие азотно-замороженные дрожжевые гранулы в мелкий порошок с помощью кофемолки типа лезвия, которая была предварительно охлаждена жидким азотом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта экстракция белка обычно начинается с клеточных гранул, собранных из 2 L дрожжевой культуры. Начальное количество дрожжевой культуры может быть скорректировано вверх или вниз с соизмеримыми корректировками объемов бисера IgG и олигов ДНК в шагах 2.2.2 и 2.3.1 ниже.
    4. Aliquot 15 мл 4x лисис буфера с DTT и Mg-ATP на льду и добавить PMSF в буфер для достижения конечной концентрации 2 мМ, завершив подготовку 4x лисис буфера с добавками.
    5. Соберите дрожжевой порошок в предварительно охлажденный стеклянный стакан на льду. Добавьте небольшой объем 4x лисис буфера с добавками в порошок, так что окончательная концентрация буфера не превышает 1x. Как правило, добавляйте 1,5 мл буфера на каждые 10 мл дрожжевого порошка.
    6. Быстро разморозить порошок до жидкой фазы, поместив стакан в водяную ванну 37 градусов с постоянным перемешиванием с помощью шпателя.
    7. Поместите стакан лизата обратно на лед сразу после оттаивания, оценить объем лизата с помощью 50 мл конической трубки, и добавить больше 4x лисис буфера с добавками, так что окончательная концентрация буфера составляет 1x. Как правило, 2 л дрожжевой культуры дает в общей сложности 25-35 мл лизата, содержащего 1x буфер айзиса.
    8. Равномерно распределите лисат на центрифуги бутылки на льду. Тщательно сбалансировать бутылки с массовой разницей не более 0,01 г между каждой парой, гарантируя, что каждая бутылка выше минимального объема, необходимого для предотвращения коллапса бутылки. Центрифуга при 290 000 х г в течение 25 мин при 4 градусах Цельсия.
    9. Соберите супернатант, содержащий растворимые белки в конической трубке 50 мл на льду, и отбросьте гранулы, содержащие клеточный мусор и большие органеллы. Избегайте сбора каких-либо облачных частей супернатанта, так как они могут засорить столбец гравитационного потока, используемый в последующих шагах. Сохранить 10 зл супернатанта для анализа SDS-PAGE.
  2. Очищение сродства IgG
    1. Во время вращения выше, установить гравитационно-поток хроматографии колонки на льду или в холодной комнате.
    2. Передача 200 л 50% IgG сродство суспензии суспензии суспензии суспензии в колонку с помощью P-1000 пипетка наконечник вырезать с лезвием бритвы, чтобы увеличить диаметр своего порта входа. При очистке более или менее 2 л пеллетной культуры клеток, отрегулируйте объем бусиной шламов пропорционально, с минимальным объемом 100 л.
    3. Aliquot еще 15 мл 4x лисис буфера с DTT и Mg-ATP и добавить PMSF в буфер для достижения окончательной концентрации 2mM. Разбавить 4x буфер на льду до 1x, добавив ddH2O.
    4. Вымойте бисер 2x с 5 мл 1x лисис буферс с добавками.
    5. Приготовьте бисер в 200 л 1x лисис буфера с добавками.
    6. Добавьте суспензию из бисера в белковый экстракт, полученный из центрифугирования, и инкубацию смеси при 4 градусах по Цельсию в течение 1 ч с мягким вращением.
    7. Во время инкубации, подготовить 25 мл буфера для мытья (рецепт подробно в таблице 1) на льду и 50 мл 1x TEV буфера (рецепт подробно в таблице 1) на льду.
    8. После инкубации 1 ч процедите смесь лисата на льду или в холодной комнате через ту же хроматографию, используемую в шаге 2.2.2 выше. Сэкономьте 10 зл и пропускной процесс для анализа SDS-PAGE.
    9. Вымойте оставшиеся моторные бусины на льду 2x с 5 мл буфера для мытья. Сохраните 10 зл и первую стирку для анализа SDS-PAGE.
    10. Вымойте бисер на льду один раз с 5 мл 1x TEV буфера. Разрешить буферу полностью слить из столбца.
  3. Маркировка с помощью днк-олигонуклеотидов и расщепления TEV
    1. Удалите столбец хроматографии из установки и заколки нижней части столбца. В той же колонке инкубировать моторные бусы с 100 йл 1x TEV буфер, содержащий 10-20 мкм очищенного BG-oligo при комнатной температуре (RT) в течение 10-15 мин. При очистке более или менее 2 л пеллетной культуры клеток, отрегулируйте объем буфера 1x TEV и очищенных BG-олигос пропорционально. Увеличьте время инкубации в соответствии с инструкциями производителя, если это необходимо для увеличения урожайности и скорости маркировки двигателя, но имейте в виду, что более длительное время инкубации может также увеличить долю дисфункциональных двигателей из-за денатурации белка на RT.
    2. Аккуратно притяните бусы каждую минуту инкубации.
    3. Вымойте помеченные моторные бусы 4x с 4 мл 1x TEV буфера с помощью той же колонки хроматографии и установки, как и раньше. Разрешить окончательной стирки полностью слить из колонки.
    4. Cap нижней части колонны, resuspend моторных бусин в не более чем 200 злитро1x TEV buffer, и передать 2 мл круглого дна микроцентрифуг трубки.
    5. Инкубировать подвеску с 0,3 единицы протеаза TEV на qL смеси мотор-бисера при 16 градусах по Цельсию на 1 ч с мягкими вращениями. Трубка должна быть установлена таким образом, чтобы свести к минимуму общую площадь поверхности трубки, с которой бусы вступают в контакт.
    6. Центрифуга трубки в микроцентрифуге на 21130 х г на 30 с в холодной комнате, чтобы сконцентрировать смесь в нижней части трубки.
    7. Тем не менее в холодной комнате, использовать разрез P-1000 пипетка отзыв для передачи смеси спина колонки и центрифуги на 21130 х г на 30 с. Соберите фильтрата, содержащего TEV-расщепления, очищенные двигатели. Протеазы TEV будут в фильтре, а также двигатели.
    8. Сохранить 10 зл фильтрата для анализа SDS-PAGE. Aliquot оставшийся фильтррат в объемах 2 ЗЛ для экспериментов TIRF или 50 Зл для очистки микротрубообразуев. Вспышка заморозить аликвоты в жидком азоте и хранить при -80 градусах Цельсия.
    9. Отрежь шарики, оставшиеся в фильтре, в буфере 1x TEV для анализа SDS-PAGE. Используйте тот же объем буфера 1x TEV, что и в шаге 2.3.4 выше.

3. Полимеризация микротрубок (МТ)

  1. Приготовление трубулиновых смесей для анализов TIRF
    1. В холодной комнате, отдельно растворить лиофилизированный тубулин каждого типа (немаркированный бычий тубулин, биотинилатный тубулин, и флуоресцентный тубулин) в реконституционном буфере (рецепт подробно описан в таблице 2), чтобы сделать окончательную концентрацию 10 мг/мл. Пусть сидите на льду в течение 10 минут.
      1. Смешайте следующие компоненты и дайте сесть на лед в течение 10 минут в холодной комнате (окончательные концентрации указаны скобки): 18 л булина крупного рогатого скота (8,2 мг/мл), 2 л биотинилатного тубулина (0,9 мг/мл) и 2 л флуоресцентного тубулина (0,9 мг/мл).
    2. Приготовьте 3 аликоты из смеси тубулина и заморозьте вспышку в жидком азоте. Храните смеси при -80 градусах По Цельсию.
  2. Приготовление тубулина для очистки сродства МТ
    1. В холодной комнате растворить лиофилизированный бычий тубулин в реконституционном буфере, чтобы сделать окончательную концентрацию 10 мг/мл. Пусть сидите на льду в течение 10 минут.
    2. Приготовьте 3 аликоты из смеси тубулина и заморозьте вспышку в жидком азоте. Храните смеси при -80 градусах По Цельсию.
  3. Полимеризация тубулина в МТ
    1. Удалите 3 qL аликот тубулина из морозильной камеры -80 градусов и очень быстро и кратко оттаивать до жидкой фазы, удерживая дно трубки. Немедленно поставить на лед и инкубировать не менее 3 мин.
    2. Аккуратно слой 3 Зл 2x полимеризации смеси (рецепт подробно в таблице 2) поверх тубулина раствора. Смешайте, нежно щелкая трубку, но не смешивайте путем пипетки, так как силы сдвига могут нарушить нуклеацию МТ и удлинение.
    3. Инкубировать смесь на водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    4. Аккуратно слой 6 Л RT 1x BRB80 с добавками (рецепт подробно в таблице 2) на вершине и перемешать, щелкнув. Не смешивайте путем пипетки.
    5. Инкубировать смесь при 37 градусах По Цельсию в течение не менее 10 мин.
    6. Приступить к MT сродство очистки, или если делать TIRF анализы, инкубировать MTs в темноте на RT ночь, чтобы сформировать больше MTs.
    7. Храните полимеризированные МТ в течение нескольких недель в темноте на RT.

4. Очистка микротрубока (Mt) сродства

  1. Удаление неполимеризованных тубулинов путем центрифугирования
    1. Смешайте следующие компоненты, чтобы сделать 60% глицерола подушку: 1x BRB80 (без добавок; рецепт подробно в таблице 2), 20 ММ Таксол (растворенный в DMSO), 1 мМ DTT, и 60% глицерола.
    2. Передача 60 зл и глот из подушки глицерола в ультрацентрифугую трубку. Аккуратно слой 12 зл немаркированных MTs полимеризированных ранее на верхней части подушки. Для предотвращения стрижки MTs, передать их с помощью разреза pipette отзыв.
    3. Centrifuge смесь на 97300 х г при 22 градусах по Цельсию в течение 15 мин. После вращения избыток тубулинов остается в верхнем жидком слое, в то время как МТ образуют гранулы внизу. Отметьте внешний край трубки перед спином, чтобы помочь найти гранулы, так как гранулы не могут быть видны невооруженным глазом.
    4. Тщательно удалите жидкий слой (12 л) над подушкой глицерола и сэкономьте 10 зл для анализа SDS-PAGE.
    5. Аккуратно промыть интерфейс между жидким слоем и подушкой с 20 зл 1x BRB80 с добавками. Удалите и сбросьте 20 л промыть.
    6. Тщательно удалите подушку глицерола (60 евро) и сэкономьте 10 л для анализа SDS-PAGE. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить мт гранулы.
    7. Аккуратно промыть гранулы с 60 Зл 1x BRB80 с добавками (рецепт подробно в таблице 2). Будьте осторожны, чтобы не беспокоить мт гранулы. Откажитесь от раствора для промывки.
    8. Resuspend МТ гранулы в 24 зл и ногой, дополненной лизой (рецепт, подробно описанный в таблице 3)с помощью наконечника срезанных пипеток.
  2. Очистка функциональных двигателей с помощью хроматографии сродства на основе МТ
    1. Удалите два 50 аликотов двигателей, очищенных от дрожжей, из морозильной камеры -80C и быстро оттаивните до жидкой фазы. Немедленно поставить на лед.
    2. Добавьте следующие компоненты в новую ультрацентрифугу трубку в указанном порядке и инкубировать смесь на RT в течение 10 мин: (1) 100 л двигателей, очищенных от дрожжей, (2) 29 л 5x ATP/Taxol смеси (рецепт подробно описанов таблице 3 ), то (3) 12 л очищенных TTs tran sferred с разрезом пипетка отзыв.
    3. Центрифуга смесь на 97300 х г и 22 кв. м в течение 15 мин. После вращения функциональные двигатели остаются в супернатанте, а МТ образуют гранулы вместе с нефункциональными двигателями, связанными с ними.
    4. Соберите супернатант, флэш заморозить в 2 qL aliquots, и хранить при -80 градусов по Цельсию.
    5. Сохранить 10 зл супернатанта для анализа SDS-PAGE. Приостановите действие гранул в 141 зликат 1x BRB80 для анализа SDS-PAGE, тоже. Используйте белковые стандарты, такие как актин, чтобы создать стандартную кривую для количественной оценки концентрации очищенных двигателей, как ранее подробно17.
    6. Используйте эту информацию о концентрации при стыковке двигателей к шасси в шаге 6.1.3.

5. Производство сегментированного шасси ДНК оригами

  1. Формирование шасси
    1. Закажите основные олигонуклеотиды, перечисленные в ранее опубликованных таблицах8 в 96 хорошо пластин ы мокрой на 250 мкм в буфере Tris, или сухой, а затем повторно их до 250 мкм с Tris буфера.
    2. Создайте пул основных скобы, смешивая 5 зл и десяток каждого основного продукта (см. таблицу S1 в Driller-Colangelo 20168).
    3. Создайте пул скобы связующего, смешивая 5 злиц каждого скобы связующего (см. основной стол для связывания в Driller-Colangelo 20168).
    4. Создайте пул скобы связывания флюорофора путем смешивания 5 зЛ каждого фторофора ручка штапель (см. флюорофор ручку таблице в Driller-Colangelo 20168).
    5. Смешайте 50 реакций на складывание с четыельством с следующими компонентами: 1x складной буфер; 100 nM 8064 эшафот; 600 нм основной бассейн; 600 нм фторора основной бассейн; 9 мкм флюорофорной нити (см. таблицу противооблеченного фторофора в Driller-Colangelo 20168); для каждого участка крепления двигателя, либо 4,2 мКм расширенные нити ручки или 600 нм нитей без ручки по желанию (см. мотор ручку / антиручки скобы стол в Driller-Colangelo 20168); 600 нМ связующее по желанию8; дополнительные 6 мМ MgCl2; и воды.
    6. Сложите в термальный цикл, используя следующую программу: быстрое нагревание до 80 градусов, охлаждение с шагом в один градус до 65 градусов свыше 75 мин, затем дополнительное охлаждение с шагом в один градус до 30 градусов по Цельсию свыше 17,5 ч.
    7. Качество анализа складывания на 2% агарозный гель в 0,5x TBE буфера (см. Таблица 4 для рецепта) дополнен 11 мМ MgCl2 и ДНК гель пятно (см. Таблица материалов). Запуск геля в 0,5x TBE буфер амплуа дополнен 11 мМ MgCl2 при 70 V в течение 60-90 мин. Запуск гелей в ледяной водяной бане или в холодной комнате, чтобы предотвратить чрезмерное нагреваии и последующего денатурации конструкций шасси.
    8. Изображение гель с использованием условий, пригодных для пятна геля ДНК используется в шаге 5.1.7.
  2. Очистка шасси
    1. Во второй половине дня за день до очистки, создать глицерол градиенты, мягко наслоения 80 злител каждый из 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, и 15% глицерола в 1x оригами складной буфер в центрифуге трубки (см. Таблица 4 для рецепта). Границы между слоями должны быть слегка видимыми.
    2. Инкубировать градиенты при 4 градусах Цельсия в течение ночи.
    3. На следующее утро, добавить 45% глицерола в 1x оригами складной буфер для сложенного раствора шасси к окончательной концентрации 10% глицерола. Смешайте осторожно и слой на верхней части градиента в центрифуге трубки.
    4. Спин градиент с шасси на 243000 х г в течение 130 минут при 4 c.
    5. Соберите 50 фракций л из трубки в направлении сверху и снизу.
    6. Отбросьте 2% геля агарозы в буфере TBE 0.5x дополненный с 11 mM MgCl2 и пятном геля дна.
    7. Нагрузка 5 л каждой фракции на гель и запустить гель в 0,5x TBE буфера дополнены 11 мМ MgCl2 для 90-120 мин на 70 V. Выполнить гели в ледяной водяной бане или в холодной комнате, чтобы предотвратить чрезмерное нагрева и последующего денатурации конструкций шасси.
    8. Изображение гель с использованием условий, пригодных для пятна геля ДНК используется в шаге 5.2.6.
    9. Выберите фракции для будущих экспериментов, которые демонстрируют хорошо сложенные мономерные структуры, свободные от неинкорпорированных скобок.
    10. Количественные концентрации отдельных фракций с использованием соответствующих спектроскопических методов, таких как поглощение УФ-излучения на уровне 260 нм. Используйте эту информацию о концентрации при стыковке двигателей к шасси в шаге 6.1.3.

6. Создание слайд-ассе-ассе-камер

  1. Сделайте слайд-ассе-камеру, приклеив две полосы двусторонней ленты к стеклянной горке и поместив на верхнюю часть крышку. Камера представляет собой узкое пространство, зажатое между крышкой и стеклянной горкой, в окружении двух полос ленты. Рисунок 1 иллюстрирует камеру ассеи.
  2. При подготовке слайда с решениями, использовать пипетку для потока любой жидкости в камеру с одной стороны, и использовать полосу фильтровальной бумаги для сбора потока жидкости на другой стороне.

7. Мотор-ансамбль подвижности TIRF ассси

  1. Спряжение двигателей к шасси ДНК
    1. На льду, подготовить свежие 1 мл каждый из DTT-дополненный BRB80, Таксол-дополненный лисис буфер, и casein-Taxol-дополненный лисис буфер (рецепты подробно в таблице 5). Передача 200 л каждого буфера на трубку RT.
    2. Тем не менее на льду, используйте холодный казеин-Таксол-дополненный буфер лисиса для подготовки 4x энергии и 4x мусорщик смеси (рецепты подробно в таблице 5).
    3. Инкубировать 10 л очищенных моторов с 5 л днк-шасси на льду в течение 15-30 мин. Эти концентрации двигателей, как было показано, насыщали места крепления двигателя шасси для этого инкубационного времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: заполняемость двигателя не 100%, вероятно, из-за stochastically отсутствует ручка скобы в отдельных конструкций шасси8,28.
    4. Во время инкубации, разбавить биотин- и фторофора помечены MTs 100x с RT Taxol-дополненный лисис буфер, и подготовить гель фильтрации моли, подходящих для размера исключения колонки хроматографии, следуя процедуре, изложенной ниже.
  2. Удаление излишних двигателей из мотор-шасси совмещено по размеру исключения колонки хроматографии
    1. В конической трубке 50 мл промойте 5 мл сетчатки фильтровальной части геля 2x с 45 мл ddH2O. Для каждой стирки смешайте с водой в конической трубке и закрутите смесь при 460 х г в течение 1 мин. Отбросьте супернатант и сохраните сечение.
    2. Вымойте сена на 2x 45 мл буфера 1x lysis (рецепт, подробно описанный в таблице 5)с помощью того же метода, описанного выше.
    3. Отреприжите промытую сиську в буфере 1x lysis в соотношении 1:1, так что мизанка станет навозом в буфере на 50%. Промытая мизаня может храниться при 4 градусах Цельсия не менее 1 месяца.
    4. Перенесите 800 л суспензии из мисинки в спин-колонку. Слейте избыточный буфер гравитационным потоком в течение 5 мин. Удалите оставшийся буфер с 2 с спином на 1000 х г. Окончательный объем ресины должен быть около 350-400 л.
    5. Разбавить мотор-шасси смесь с казеин-Таксол-дополненный лисис буфера до окончательного объема 50 Л. Передача разбавленной смеси спина колонки упакованы с помощью мисы.
    6. Центрифуга вращательной колонки на 1000 х г для 6 s (на этот раз включает в себя время ускорения и замедления). Соберите чистое моторное шасси, спряжено, сохранив фильтруи, и отбросьте колонку, которая сохраняет избыток двигателей.
  3. Подготовка слайдов для визуализации
    1. Поток 13 л 1 мг/мл биоинтинилатированный бычий сывороточный альбумин (биотин-BSA) в камеру слайд-ассе. Инкубировать в течение 2 мин, чтобы привязка BSA к стеклу.
    2. Вымойте камеру 2x с 20 зл и RT DTT-дополненный BRB80, протекающий в буфере на одной стороне камеры и wicking избыток жидкости от другой стороны с помощью полоски фильтровальной бумаги.
    3. Поток в 20 л 0,5 мг/мл стрептавидин. Инкубировать в течение 2 мин, чтобы скрепить стрептавидин с биотином на BSA.
    4. Вымойте камеру 2x с 20 ЗЛ из RT Таксол-дополненный буфер лиза.
    5. Аккуратно протекайте в 20 л разбавленных МТ с разрезаемым наконечником пипетки. Инкубировать в течение 2 мин, чтобы связывание между биотином на МТ и стрептавидином.
    6. Вымойте 2x с 20 зл и номиналом буфера лиза RT casein-Taxol. Инкубировать в течение 2 мин, чтобы казеин пронизывать всю камеру.
    7. Разбавить очищенное моторное шасси, спрятав 5x до 10x к одномолекулярным условиям (10-100 pM) с холодным буфером лиза, дополненным казеином-таксолом. Смешайте следующие компоненты для получения конечной смеси мотор-шасси: 10 л разбавления мотор-шасси, 5 л 4x энергетической смеси, и 5 зл 4x смеси мусорщика.
    8. Поток в 20 зл окончательного мотор-шасси смеси для ассеа слайд-камеры и перейти к TIRF микроскопии.
  4. Визуализация и получение данных
    1. Изображение слайда сразу с помощью микроскопа TIRF. Как правило, каждый слайд остается пригодным для использования в течение 30-60 мин.
    2. Приобретите неподвижное изображение в канале MT и фильм в канале шасси. Для двигателей в этом протоколе, 10 минут фильмы с частотой кадров 0,5 кадров и время экспозиции 200 мс являются подходящими.
    3. Из фильма шасси, генерировать один kymograph для каждого MT в ImageJ или аналогичные программного обеспечения обработки изображений29. Проанализируйте скорости и длину пробега ансамблей мотор-шасси, измерив склоны и горизонтальные расстояния трасс на kymograph30.

Результаты

Успешная очистка двигателей и конструкций шасси была проведена с помощью гелевого электрофорасиса. Анализ SDS-PAGE подтвердил успешную добычу динейна из дрожжей(рисунок 2),так как окончательный фильтрат, собранный в шаге 2.3.7, показал четкую, острую полосу ...

Обсуждение

Молекулярные методы строительства ДНК оригами обеспечивают уникальный способ построения моторных ансамблей с определенными архитектурами, моторными номерами и типами, что позволяет проводить исследования того, как возникающие поведение возникает из конкретных конфигураций двигат?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим К. Чау, Дж.Моргана и А. Бурлера-Коланджело за вклад в технологии сегментированного шасси ДНК оригами. Мы также благодарим бывших сотрудников лабораторий Рек-Петерсона и Ши за полезные обсуждения и вклад в первоначальное развитие этих методов. Мы благодарим J. Wopereis и Смит колледж Центр микроскопии и визуализации и Л. Bierwert и Смит колледж Центр молекулярной биологии. Мы с благодарностью отмечаем программу NSF MRI для приобретения микроскопа TIRF.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL Round Bottom TubeUSA Scientific1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pureCytoskeleton.comT333P-A
Biotin-BSASigmaA8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mmBeckman Coulter356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mmBeckman Coulter355603
Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mLGE Healthcare17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, emptyBio-Rad7326204EDU
P8064 ScaffoldTilibit2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography ColumnsBio-Rad731-1550
ProTev ProteasePromegaV6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenseramazon.comN/A
Sephacryl S-500 HRGE Healthcare17061310
StreptavidinThermo Fisher434302
SYBR Safe DNA stainInvitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brainCytoskeleton.comT240-B
Tubulin, HiLyte 647Cytoskeleton.comTL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge TubesBeckman Coulter344090

Ссылки

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
  2. Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
  3. Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
  4. Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
  5. McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
  6. Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
  7. Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
  8. Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
  9. Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
  10. Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
  11. Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
  12. Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
  13. Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
  14. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  15. Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
  16. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  17. Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
  18. Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
  19. Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).
  20. Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
  21. Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).
  22. Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
  23. Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
  24. Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
  25. Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
  26. Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
  27. Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
  28. Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
  29. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  30. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  31. Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , (2019).
  32. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

152

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены