Профилирование убиквитин и убиквитин-подобных зависимых посттрансляционных модификаций и выявление значительных изменений

Резюме

Этот протокол направлен на создание убиквитин (Ub) и убиквитин-лайков (Ubls) конкретных протеомов для выявления изменений такого рода посттрансляционных изменений (ПТМ), связанных с конкретным условием, таким как лечение или фенотип.

Аннотация

Убиквитин (уб) и убиквитин-подобные (убл) зависимые посттрансляционные изменения белков играют фундаментальную биологическую регулятивную роль в клетке, контролируя стабильность белка, активность, взаимодействия и внутриклеточную локализацию. Они позволяют клетке реагировать на сигналы и адаптироваться к изменениям в ее среде. Изменения в этих механизмах могут привести к тяжелым патологическим ситуациям, таким как нейродегенеративные заболевания и раковые заболевания. Цель описанного здесь метода состоит в том, чтобы установить ub/ubls зависимые профили ПТМ, быстро и точно, от культивированных клеточных линий. Сравнение различных профилей, полученных из различных условий, позволяет выявить конкретные изменения, такие, как, например, те, которые были вызваны лечением. Лентивирная опосредованного клеточной трансдукции выполняется для создания стабильных клеточных линий, выражающих двухметки (6His и Флаг) версия модификатора (убиквитин или ubl, таких как SUMO1 или Nedd8). Эти метки позволяют очищать убиквитин и, следовательно, убиквитина белков из клеток. Это делается через двухэтапный процесс очистки: первый выполняется в условиях денатурации с использованием тега 6His, а второй в родных условиях с помощью тега Флага. Это приводит к высокоспецифической и чистой изоляции модифицированных белков, которые впоследствии идентифицируются и полуколичественно определяются жидкой хроматографией с последующей тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) технологии. Легкий анализ информатики данных MS с использованием программного обеспечения Excel позволяет создавать профили PTM, устраняя фоновые сигналы. Эти профили сравниваются между каждым условием для того, чтобы определить конкретные изменения, которые затем будут изучены более конкретно, начиная с их проверки стандартными методами биохимии.

Введение

Предложенный здесь метод предназначен для изучения ПТМ при посредничестве членов семьи убиквитин из культивированных клеток млекопитающих, с тем чтобы определить потенциальные изменения, связанные с конкретным условием (лечение, дифференциация и т.д.). ПТМ представляют собой последний этап регуляции функций белков^1. Действительно, когда-то производится переводного механизма, большинство, если не все белки проходят различные виды ПТМ, которые модулируют их активность, молекулярные взаимодействия, и внутриклеточного расположения¹. Среди множества ПТМ являются те, опосредовано семьи убиквитин белков, убиквитин себя и все убиквитин-любит, имеют потенциал для регулирования всех внутриклеточных или частично цитоплазматических белков². Потому что они сами белки, они могут быть сопряжены друг с другом, образуя однородные и неоднородные цепи различных топологий, каждый из которых связан с конкретными регулятивными функциями². Инструменты необходимы, чтобы попытаться расшифровать и понять этот сложный механизм. Многие подходы были разработаны во всем мире, имея свои преимущества и недостатки, и здесь мы предлагаем один с высокой производительностью подходит для культивированных клеток.

Основным преимуществом этого метода является его точность. Действительно, чистота изолированных модифицированных белков значительно улучшилась за счет комбинаторного использования двух тегов (6His и Flag) и двух шагов-процедур, и поэтому он гораздо более избирательным, чем один тег слияния Ub/Ubl^3,4. Наличие тега 6His позволяет первый шаг очистки в полностью денатурации состоянии тем самым избегая каких-либо совместной очистки белков, содержащих убиквитин связывания доменов или других белков, связывающихся с вездесущими. Это техническая проблема, с которой сталкиваются несколько других подходов, основанных на сродстве очистки убиквитинаированных протеомсов с использованием либо конкретных антител⁵ или тандема убиквитин связывающих элементов (TUBEs)⁶. Важно отметить, что этот метод не является предвзятым в пользу очищения определенного типа вездесущности, как это может быть в случае некоторых других подходов, так как как моно и различные виды полиубичинаций были определены⁷. Следовательно, как только будет установлено, что изменение убиквитинации должно быть изучено более подробно с помощью стандартных биохимических подходов, с тем чтобы определить точный вид убиквитина.

Наконец, еще одним техническим преимуществом этого протокола является использование лентивирусов, которые легко и быстро создают стабильные экспрессионные клеточные линии с разумным уровнем выражений помеченного модификатора, не мешая нормальному клеточному поведению.

В то время как одна важная роль повсеместновиления заключается в целевой белков для протеасомальной деградации, в настоящее время известно, что он имеет много других регуляторных свойств для потенциально наиболее внутриклеточных или частично внутриклеточных белков¹. Количество этих функций еще больше усиливается существованием многих убиквитин, как белки, образуя семейство белков, регулирующих почти каждый клеточный механизм¹. Их изменения могут иметь резкое влияние на биологию клеток и может привести или участвовать в патологических ситуациях⁸, таких как рак⁹. Таким образом, инструменты необходимы для изучения этого обширного ландшафта и определить изменения, связанные с патологическим состоянием, которое может служить в качестве новых терапевтических целей.

Этот протокол предназначен для клеток в культуре, так как они должны быть трансуктором, чтобы выразить экзогенные помечены Ub / Ubl. После создания эти стабильные клеточные линии могут быть использованы для генерации профилей Ubl из культуры в 2D или 3D или xenografts, тем самым расширяя горизонт различных экспериментальных моделей, которые могут быть применены для изучения профилей PTMs.

протокол

1. Поколение стабильных клеточных линий, выражающих 6His-Flag-Ubl

ПРИМЕЧАНИЕ: Со-трансфекция HEK-293T клеток с pCCL-6HF-Ubl, pVSVG и дельта-Хелпер.

1. День 0: Семена 293T клетки в 6-хорошо пластины для получения 50-70% слияния на следующий день после.
2. День 1: Со-трансфект 50-70% сопливых клеток с сочетанием 1 мкг pCCL-6HF-Ubl или pCCL-GFP, 1 мкг pVSVG и 1 мкг дельта-Хелпер векторов, используя трансфекционный реагент и протокол для производства лентивируса. После 6 ч трансфекции, изменить среду на свежий, соответствующий клетки, которые будут транс-индуцирования. Семена клетки должны быть трансумции в 6 хорошо пластины для того, чтобы получить 10-20% слияния на следующий день после (день начала трансдукции).
3. День 2: 24 ч после трансфекции, восстановить среду, содержащую лецивирные частицы и фильтр с помощью 0,45 мкм фильтров. При необходимости добавьте свежую среду в этот момент, чтобы произвести вторую партию лентивирусов. Замените среду клеток, которые должны быть транс-индуцированы (10-20% слияния) на один, содержащий лентивирусы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лентивирная среда может храниться при 4 градусах Цельсия в течение нескольких дней до трансдукции или храниться при -80 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
4. Инкубировать клетки с лентивирусами от 24 ч до 72 ч в стандартном инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO_2),а затем изменить среду для свежего стандартного. Если возможно, проверьте экспрессию GFP с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа для оценки эффективности трансдукции: процент выражающих сярют клеток и относительного уровня экспрессии на одну клетку. Если флуоресценция не обнаружена, подождите еще 2-3 дня, так как экспрессия может занять больше времени в зависимости от типа клеток, которые будут трансдимированы.
5. Если контроль GFP является положительным, расти все клетки до тех пор, пока достаточно для выполнения контроля экспрессии 6HF-Ubl иммунофлуоресценции и западной подись с использованием анти-флаг антитела.

2. Двойная очистка модифицированных белков

ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, рН 8.0, 0.5% Тритон X-100.
Буфер 2: 50 мМ₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Глицерол, рН 8.0.
Буфер 3: 100 мМ NH₄HCO₃, рН 8.0.

1. Лиза клетки: После того, как готовы, мыть культуры блюда по крайней мере один раз с фосфат-буфером сольника (PBS) при комнатной температуре (RT) и приступить к лизис клеток или, в качестве альтернативы, флэш заморозить в жидкости N₂ и хранить при -80 градусов по Цельсию. Для lysis, добавить 2 мл буфера 1 на 15 см блюдо на RT. Используйте клеточный скребок для восстановления всех лисатов в 50 мл конических центрифуговых труб (окончательный объем около 20 мл).
2. Снотировать lysates три раза в течение 30 с разделены 1 минуту паузы.
3. Центрифуга sonicated lysates на 15000 х г в течение 15 минут.
4. Перенесите супернатант в новую трубку с помощью клеточного ситечко (40 мкм).
5. Определите концентрацию образцов и при необходимости регулируйте их для получения одинакового количества белков и того же объема. Используйте общее количество белка от 50 до 100 мг (10 блюд диаметром 15 см для клеток MiaPaCa-2).
6. Добавьтебисер Ni 2'-NTA, используя 2 л бусины на 1 мг белка.
7. Поверните при 30 об/мин при 2,5 л на RT.
8. Пеллет и бусы при 500 х г в течение 5 мин.
9. Вымойте бусины с 1 мл буфера 1, передавая образцы в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки, а затем передать трубки на льду. Выполните все следующие шаги на льду или при 4 градусах Цельсия.
10. Вымойте два раза с 1 мл ледяного буфера 2, содержащего 10 мМ имидазола.
11. Чтобы выяснить связанные белки, добавьте 600 qL буфера 2, содержащий 250 мМ имидазола и поверните на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
12. Пеллети бусины центрифугированием при 500 х г в течение 1 мин. Перенесите супернацианты в новые, предварительно охлажденные, 1,5 мл трубок и добавьте 50 л антител против флага M2.
13. Поверните при 30 об/мин в течение 2,5 ч при 4 градусах Цельсия, затем промойте 2 раза с 500 qL буфера 2, затем 2 раза с 500 qL буфера 3.
14. Для окончательного elution добавьте 100 qL буфера 3, содержащий пептид Флага на уровне 0,1 мкг/Л и поверните при 4 градусах по Цельсию на 1,5 ч.
15. Центрифуга при 500 х г в течение 1 мин и перенесите супернацианты на новые предварительно охлажденные трубки.
16. Возьмите 10% (10 л), чтобы загрузить на SDS-PAGE и выполнить серебряное окрашивание геля для контроля качества очистки. Если очистка выглядит хорошо, проанализируйте 90%, оставленные LC-MS/MS.

3. Обработка данных масс-спектрометрии для генерации профилей ПТМ Ub/Ubls и выявления существенных различий между ними

ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты анализа MS содержат много информации, включая общее количество пептидов, а также значения пиковой зоны (среднее ТОП 3 пептидной области¹⁰⁾для каждого белка, идентифицированного в каждом образце. Эти данные могут быть обработаны либо с использованием пептидных чисел кол или пиковых значений области, или и то, и другое. Для расчета с пиковыми областями, так как эти значения обычно находятся в диапазоне 10^6,необходимо разделить их на этот порядок, прежде чем применять те же формулы, что и ниже. Результаты, полученные с помощью обеих методологий подсчета, должны показать сильную корреляцию, как это обычно бывает. Для каждого идентифицированного белка используйте следующие формулы, где:
v1 значения пептидов в необработанном образце убиквитин (например, Ub - препарат)
v2 значения пептидов в гемцитабине, обработанном убиквитином (например, препарат Ub)
значения пептидов k1 в необработанной контрольной пробе GFP (например, GFP - препарат)
значения пептидов к2 в Гемцитабине, обработанных контрольной пробы GFP (например, GFP и препарат).

1. Нормализация: Нормализация значения между лекарственными обработанными клетками и необработанными клетками для убиквитин и GFP с использованием следующих формул. Нормализованная v q V и нормализованная к. К.
   V1'v1. (Зв1) / (2. V2'v2. (Зв1) / (2.
   К1зк1. (к. к. 2) / (2. q1) ; К2-к2. (Кк1) / (2.
2. Удаление фона: Используя следующие формулы, вычесть значения в контрольной выборке (GFP) из значений в образце убиквитин для получения конкретных значений (V'1 и V'2) для каждого идентифицированного белка в обоих условиях.
   V'1'V1-K1, если V1-K1-0 ; V'1'0, если V1-K1'lt;0
   V'2'V2-K2, если V2-K2-0 ; V'2 No0, если V2-K2'lt;0
3. Вариация (Вар) вездесущности. Чтобы получить балл (от -100 до 100 евро) за положительные и отрицательные вариации ПТМ, индуцированных препаратом, используйте следующую формулу, в которой разница между конкретными значениями обработанных и необработанных образцов делится на сумму всех значений, включая контроль (для наказания белков также определены в контроле GFP), и умножить на 100.
   Вар -" (V'2-V'1)/(V1-K1-V2-K2); -100-lt;Варо;100 ;
   Вариации ниже -50 (репрессии PTM) или выше 50 (индукция ПТМ), как правило, считаются значительными.
4. Доверие (Конф). Используйте следующую формулу для получения значения доверия от 0 до 100%,::
   Конф ((V1'V2)²/(1'V1 'V2'K1'K2)²) - 100 - 100/(1'V'V'2) ; No 0, если Злт;0
   Значения выше 50, как правило, считаются уверенными.
5. Чтобы получить более хорошее распределение индукционных/репрессионных значений и рассмотреть как параметры вариации, так и параметры доверия, умножьте значения Var и Conf, используя следующую формулу, где V Var и C Conf
   «SI(V2'gt;0;0;((V2'C2))/2)/(10'6);-((V2'C2))/2)/(10'6))
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку значения пиковой зоны, как правило, более точны, чем подсчет пептида, можно использовать специальное программное обеспечение, которое посвящено интерпретации такого рода данных, таких как Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), после рекомендации по использованию.

Результаты

Трансдукция культурных клеток млекопитающих для создания GFP и 6HF-Ub экспрессирующих клеток
Для производства лентивирусов, которые будут использоваться позже для преобразить клетки MiaPaCa-2, 70% конфлирующих клеток HEK-293T совместно трансфицируются с равным количе...

Обсуждение

Мы разработали надежную и надежную методологию для генерации профилей белков, модифицированных основными членами семьи убиквитин. Действительно, мы успешно применили этот протокол для генерации профилей ПТМ по убиквитину, а также SUMO и Nedd8, а также для обнаружения изменений, связанных ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag