Обнаружение создания общего кровоснабжения у парабиотических мышей путем инъекции глюкозы Caudal Vein

Резюме

Здесь мы описываем новый метод выявления успешного установления общего кровообращения двух парабионтов через инъекцию caudal вен глюкозы, которая вызывает минимальный ущерб и не является фатальной для парабионтов.

Аннотация

Парабиоз является экспериментальным методом хирургического объединения двух параллельных животных вдоль продольной оси тела. Мы представляем протокол для обнаружения успешного установления химеризма крови в парабионтах путем инъекции caudal вен глюкозы. Были построены парабиотические мыши. Глюкоза вводилась в донорскую мышь через хвостовую вену, и колебания уровня глюкозы в крови измерялись у обеих мышей с помощью глюкометра крови в разное время. Наши результаты показали, что после инъекции глюкозы уровень глюкозы в крови у мышей-доноров резко повысился после 1 мин и медленно снизился после этого. Между тем, уровень глюкозы в крови мышей-реципиентов достиг 15 мин после инъекции. Аналогичные результаты были получены с Эванс синий, используется в качестве положительного контроля для глюкозы. Синхронные колебания уровня глюкозы в крови свидетельствуют о том, что кровоток между двумя мышами был успешно установлен.

Введение

Парабиоз является методом моделирования, в котором два живых организма соединяются хирургическим путем и развиваются как единая физиологическая система с общей системой кровообращения^1. Такие модели широко используются для изучения физиологии, что объясняется тем преимуществом, что вещества, производимые одним человеком, могут действовать на обоих животных одновременно через общую систему кровообращения. С середины 1800-х годов, когда парабиотические эксперименты были впервые Пол Берт², методы для построения парабиотических моделей стали стандартизированы. Однако простого и удобного метода проверки успешного создания кровного химеризма не хватает. Было сообщено, что перекрестный оборот может быть успешно оцененин интраперитонеально инъекционных 0,5% Эванс синий краситель в одном из парабионтов следуют измерения абсорбции Эванс синий в крови обоих парабионтов с микроплитой читателя³. Другой метод требует определенной породы мышей, которая содержит CD45.1^-и CD45.2^-помеченные моноциты в каждом парабионте. Клеточная цитометрия затем используется для определения химеризма крови путем измерения частоты двух маркеров в моноцитах из селезенки или крови^4. Тем не менее, эти методы часто являются смертельными или громоздкими для животных, и безопасный и простой метод для быстрой и надежной проверки парабиотических моделей является весьма желательным. В этом исследовании мы создали новый метод для этой цели, который был проверен в мышиной модели парабиоза. Концентрация глюкозы в образцах крови, взятых из хвостовой вены, измеряется с помощью глюкометра, а модель изменений уровня глюкозы у мышей-доноров и реципиентов считается признаком циркуляции химеризма. Мы назвали этот метод «методом колебаний глюкозы». Применение этого метода проверки не ограничивается мышами, но может быть распространено на различные патологические модели, за исключением тех, с серьезнымдисрегрецией метаболизма глюкозы. Процедура проста, экономия времени и безопасна.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры, связанные с животными и их уходом, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Харбинского медицинского университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты и оборудование, необходимые для метода,перечислены в таблице материалов.

1. Подготовка материалов и животных

1. Закажите C57BL/6 мышей мужского пола весом от 20 г-25 г у стандартного поставщика лабораторных животных.
2. Дом мышей в цикле 12 ч света: 12 ч темноты при 24'26 C с ad libitum доступ к воде и пище.

2. Парабиоз

1. Анестезия мышей путем интраперитонеальной инъекции 20 г/л 2,2,2-трибромоэтанола в концентрации 0,1 мл/10 г. Подтвердите правильное обезболивание, о чем свидетельствует расслабление мышц, медленное и устойчивое дыхание, потеря рефлектора стимуляции кожи и исчезновение рефлектора роговицы.
2. Нанесите офтальмологическую мазь с помощью наконечника, чтобы предотвратить сухость глаз.
3. Выполните процедуру парабиоза, как ранее описано⁵.
   1. Поместите мышей в положение лежа. Тщательно побрить левую сторону одной мыши и правую сторону другой мыши, начиная примерно на 1 см выше локтя до 1 см ниже колена с электрической бритвой. Используйте крем для депилатория, чтобы полностью очистить мех на бритой коже.
   2. Протрите бритые участки с йодофоном. Поместите мышей на подогрев омытой подушечки, покрытую стерильной подушечкой.
   3. Создавайте продольные разрезы кожи, начиная с 0,5 см выше локтя до 0,5 см ниже коленного сустава, используя с помощью острых ножниц на бритой стороне каждого животного.
   4. Отсоедините кожу от подкожной фасции осторожно после разреза.
   5. Соедините олекранон и колено парабионта с 3-0 шов.
   6. Шов побрился на коже с непрерывным 5-0 швом.
4. Вводят 0,5 мл 0,9% NaCl подкожно каждой мыши для предотвращения обезвоживания.
5. Вводят трамадол (10 мг/25 г/день) к каждой мыши, чтобы облегчить боль.

3. Проверка циркуляции химеризма

1. Метод колебаний глюкозы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте успешное построение циркуляции химеризма между парабионтами с помощью метода колебаний глюкозы (без голодания) на 10-й день после операции на парабиозе.
   1. Анестезия парабионтов путем интраперитонеальной инъекции 20 г/л 2,2,2-трибромоэтанола для каждой мыши в концентрации 0,1 мл/10 г.
   2. Исправить донора мышей в венозной визуально-мыши хвост фиксатор.
   3. Натрите хвостовые вены на фланге хвоста одного из парабионтов ватным тампоном, пропитанным 70–75% алкоголя, чтобы очистить хвост и раскидывать кровеносные сосуды.
   4. Держите 1,0 мл шприца, содержащего глюкозу в правой руке и держать иглу параллельно вены (менее 15 " ).
   5. Вставьте иглу в положении примерно 2'4 см от кончика хвоста.
   6. Впрыските донору 100 кл. глюкозы (1,2 г/кг) в течение 10 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Термин донор относится к парабионт, который получает инъекцию глюкозы через хвост вены. Получателем является другой парабионт, который не получает глюкозу напрямую.
   7. Очистите носы с помощью йодофора. Отрежьте ножницами носовые части ног донора и реципиента и соберите каплю крови в разное время после инъекции глюкозы (1 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 30 мин, 40 мин, 50 мин и 60 мин). Удалите сгусток крови в каждом моменте сбора времени, чтобы избежать большего ущерба.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем собранной крови составил 10-25 ул для одного теста, и 90-225 ул в общей сложности.
   8. Капать кровь в центр глюкометра тест-полоски для обнаружения уровня глюкозы.
2. Используйте синий counterstain Эвана в качестве положительного контроля³.
   1. Впрыските 200 л синего противозатоста Эвана в донорскую мышь.
   2. 2 ч спустя, эвтаназии парабионтов путем интраперитонеальной инъекции 20 г / l 2,2,2-трибромотанола для каждой мыши в концентрации 0,2 мл/10 г, и собирать кровь из обоих парабионтов путем пробива.
   3. Центрифуг и образцы крови на 916 х г в течение 15 мин.
   4. Соберите сыворотку от супернатанта.
   5. Разбавить сыворотку с 0,9% NaCl в 1:50.
   6. Измерьте абсорбцию разбавленных образцов сыворотки на уровне 620 нм с помощью спектрофотометра.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

У шести мышей-доноров уровень глюкозы в крови резко повысился до 26,5 мкм/л (173% при увеличении) в среднем на 1 мин после инъекции 100 кЛ глюкозы (1,2 г/кг) через хвостовую вену, а затем постепенно снижался до 13,3 мкм/л при 60 мин. У мышей-реципиентов уровень глюкозы в крови медленн?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Парабиоз относится к хирургической технике соединения двух живых животных для создания общей сосудистой системы экспериментальными средствами^6,7,8. Преимущество этой модели заключается в том, что вещества, производимые одним человеко...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
curved forceps	JZ surgical Instruments, China	J31340
fine scissors	JZ surgical Instruments, China	WA1030
needle forcep	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL syringes	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicillin	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
depilatory cream	Nair, USA	LL9161
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Electrical shaver	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 surgical suture	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#