JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол, описывающий, как i) собрать самовоспроизводящий вектор с помощью модульного инструментария клонирования CyanoGate, ii) ввести вектор в цианобактериальный хост путем спряжения, и iii) характеризуют трансгенные штаммы цианобактерий с помощью плита читателя или потока цитометрии.

Аннотация

Цианобактерии представляют собой разнообразную группу прокариотических фотосинтетических организмов, которые могут быть генетически модифицированы для возобновляемого производства полезных промышленных товаров. Последние достижения в области синтетической биологии привели к разработке нескольких наборов инструментов клонирования, таких как CyanoGate, стандартизированная модульная система клонирования для построения векторов плазмида для последующей трансформации или супружеской передачи в цианобактерии. Здесь мы намечаем детальный метод для сборки самовоспроизводящегося вектора (например, проведение флуоресцентной маркерной экспрессии) и супружеской передачи вектора в цианобактериальные штаммы Synechocystis sp. PCC 6803 или Synechococcus эллонгат UTEX 2973. Кроме того, мы описываем, как охарактеризовать производительность генетической части (например, промоутер) с помощью считывателя пластин или цитометрии потока.

Введение

Цианобактерии являются аутотрофными бактериями, которые могут быть использованы для биосинтеза широкого спектра природных и гетерологических продуктов высокой стоимости метаболических1,2,3,4,5 6. Несколько препятствий еще предстоит преодолеть, чтобы расширить свою коммерческую жизнеспособность, прежде всего, относительно низкие урожаи по сравнению с гетеротрофной био-платформ (например, Escherichia coli и дрожжей)7. Недавнее расширение доступных инструментов генной инженерии и поглощение парадигмы синтетической биологии в цианобактериальных исследованиях помогает преодолеть такие проблемы и дальнейшее развитие цианобактерий как эффективных биофабрик8, 9,10.

Основными подходами к внедрению ДНК в цианобактерии являются трансформация, спряжение и электропорация. Переносчики, передаваемые к цианобактериям путем трансформации или электропорации, являются «самоубийственные» векторами (т.е. интегративными векторами, способствующих гомологичной рекомбинации), в то время как самовоспроизводящиеся векторы могут быть перенесены на цианобактерии трансформация, спряжение или электропорация. Для первого, протокол доступен для инженерных видов модели поддаются естественной трансформации11. Совсем недавно был разработан модульный набор инструментов для клонирования (MoClo) для цианобактерий под названием CyanoGate, который использует стандартизированный метод векторной сборки Золотых ворот для проектирования с использованием естественной трансформации, электропорации или спряжения12.

Технологии сборки типа «Золотые ворота» становятся все более популярными в последние годы, а стандарты сборки и библиотеки частей теперь доступны для различных организмов13,14,15,16 ,17. Золотые ворота использует ферменты ограничения IIS типа (например, BsaI, BpiI, BsmBI, Btg'i и AarI) и костюм приемников и уникальные свесы для облегчения направленной иерархической сборки нескольких последовательностей в реакции сборки «одного горшка». Ферменты ограничения типа IIS распознают уникальную асимметричную последовательность и вырезают определенное расстояние от их сайтов распознавания, чтобы создать пошатнувшееся, «липкий конец» разреза (обычно 4 нуклеотида (nt) свеса), которые могут быть впоследствии использованы для привода упорядоченной ДНК сборки реакции15,18. Это способствовало развитию больших библиотек модульных частей уровня 0 (например, промоутеров, открытых кадров для чтения и терминаторов), определяемых общим синтаксисом, таким как стандарт PhytoBricks19. Части уровня 0 могут быть легко собраны в кассеты выражения уровня 1, после чего более сложные сборки более высокого порядка (например, многогенные конструкции выражения) могут быть построены в векторе принятия выбора12,15. Ключевым преимуществом методов сборки типа Golden Gate является их удобство автоматизации на высокопроизводительных объектах, таких как ДНК-литейные заводы20,21, которые могут позволить для тестирования сложных экспериментальных конструкций, которые не может быть легко достигнуто с помощью ручного труда.

CyanoGate строится на установленной системе Завода MoClo12,15. Для включения новой части в CyanoGate, часть последовательности должны быть сначала одомашнены, т.е. "незаконные" признания сайтов для BsaI и BpiI должны быть удалены. В случае кодирования детали для открытого кадра чтения (т.е. последовательности кодирования, CDS) сайты распознавания могут быть нарушены путем генерации синонимных мутаций в последовательности (т.е. изменение кодона на альтернативу, которая кодирует тот же остатками аминокислоты). Это может быть достигнуто с помощью различных подходов, начиная от синтеза ДНК полимеразы цепной реакции (PCR) усиления на основе стратегий, таких как Гибсон сборки22. В зависимости от используемого принимающего выражения следует позаботиться о том, чтобы избежать введения редких кодонов, которые могут препятствовать эффективности перевода23. Удаление сайтов распознавания в последовательности промоутера и терминатора, как правило, более рискованное усилие, так как изменения могут повлиять на функцию и часть может не выполнять, как ожидалось. Например, изменения в местах связывания фактора транскрипции или ribosome связывающий сайт внутри промоутера могут изменить силу и отзывчивость к индукции/репрессии. Аналогичным образом, изменения в ключевых структурных характеристиках терминатора (например, богатый стебель GC, петля и поли-U хвост) могут изменить эффективность прекращения и эффект экспрессии гена24,25. Хотя несколько интернет-ресурсов доступны для прогнозирования активности промотора и последовательности терминаторов, и сообщить, повлияет ли предлагаемая мутация на производительность26,27, эти инструменты часто являются плохими предикторами производительность у цианобактерий28,29,30.. Таким образом, in vivo характеристика модифицированных частей по-прежнему рекомендуется для подтверждения активности. Для оказания помощи в клонировании непокорных последовательностей, CyanoGate включает в себя низкий вектор клонирования копий на основе векторного bioBrick pSB4K512,16,31. Кроме того, портал "Дизайн и сборка" доступен через Эдинбургский геном литейный завод, чтобы помочь с векторным дизайном (dab.genomefoundry.org). Наконец, и самое главное, CyanoGate включает в себя два векторных конструкций приемного уровня T (эквивалент вектору приемного уровня 2)15 для введения ДНК в цианобактерии с использованием векторов самоубийств, или широких векторов диапазона, способных к самовоспроизводствам в нескольких видов цианобактерий32,33,34.

Здесь мы сосредоточимся на описании протокола для генерации самовоспроизводящих векторов уровня T и генетической модификации Synechocystis PCC 6803 и Synechococcus elongatus UTEX 2973(Synechocystis PCC 6803 и S. elongatus UTEX 2973 в дальнейшем) путем спряжения (также известный как три-родительских спаривания). Супружеская передача ДНК между бактериальными клетками является хорошо описанным процессом и ранее использовалась для инженерных цианобактериальных видов, в частности тех, которые не являются естественными компетентными, такими как S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. Короче говоря, цианобактериальные культуры инкубируются штаммом кишечной палочки, несущим переносчик ("грузовой" вектор) и векторами (либо в том же штамме кишечной палочки, либо в дополнительных штаммах), чтобы обеспечить спряжение ("мобилизатор" и векторы «помощника»). Для супружеской передачи требуется четыре ключевых условия: 1) прямой контакт между клетками, участвующими в передаче ДНК, 2) вектор груза должен быть совместим с системой спряжения (т.е. он должен содержать подходящее происхождение передачи(oriT), также известный как бом (основа мобильности) сайт), 3) ДНК nicking белка (например, кодируется моб гена), что ники ДНК на oriT инициировать одноцепочечную передачу ДНК в цианобактерий должны присутствовать и выражается от грузового или помощника векторов, и 4) переданная ДНК не должна быть уничтожена в цианобактериях цианобактерия (т.е. должна быть устойчива к деградации, например, ограничивая эндонуклеазией деятельности)35,42. Для того чтобы грузовой вектор сохранялся, происхождение репликации должно быть совместимо с цианобактерией получателя, чтобы обеспечить самовоспроизводство и распространение в дочерних ячеек после деления. Для помощи с условиями 3 и 4, несколько векторов помощника доступны через Addgene и другие коммерческие источники, которые кодируют для толпы, а также несколько метилаз, чтобы защитить от родной эндонуклизии в принимающей цианобактерий43. В этом протоколе спряжению способствовали штамм MC1061 E. coli, несущий мобилизатор и помощник векторов pRK24 (www.addgeneorg/51950) и pRL528 (www.addgene.org/58495), соответственно. Необходимо проявлять осторожность при выборе векторов, которые будут использоваться для супружеской передачи. Например, в комплекте CyanoGate самовоспроизводящий грузовой вектор pPM-AK1-T кодирует белок Mob12. Тем не менее, pSEVA421-T не44, и как таковой, толпа должна быть выражена из подходящего вектора помощника. Используемые векторы также должны соответствовать организму-мишеням. Например, эффективный супружеский перевод в Anabaena sp. PCC 7120 требует вектора помощника, который защищает вектор мобилизации от пищеварения (например, pRL623, который кодирует для трех метилазов AvaiM, Eco47iiM и Ecot22iM)45, 46.

В этом протоколе мы далее наметить, как охарактеризовать производительность частей (т.е. промоутеров) с флуоресцентным маркером с помощью считывателя пластин или цитометра потока. Цитометры потока способны измерять флуоресценцию на основе одной клетки для большой популяции. Кроме того, цитометры потока позволяют пользователям "загонять" полученные данные и удалять фоновый шум (например, от твердых частиц в культуре или загрязнении). В отличие от этого, считывательы пластин приобретают совокупное измерение флуоресценции данного объема культуры, как правило, в нескольких репликационных скважинах. Основные преимущества считывателей пластин над цитометрами включают более низкую стоимость, более высокую доступность и, как правило, отсутствие требований к специализированного программного обеспечения для анализа данных ниже по течению. Основными недостатками считывателей пластин являются относительно более низкая чувствительность по сравнению с цитометрами и потенциальные проблемы с оптической плотностью измеренных культур. Для сравнительного анализа образцы считывания пластин должны быть нормализированы для каждой скважины (например, для измерения плотности культуры, обычно в качестве абсорбции при оптической плотности в 750 нм, что может привести к неточностям для образцов, которые являются слишком плотной и/или не очень смешанной (например, при подверженности агрегации или флоккуляции).

В качестве обзора, здесь мы демонстрируем в деталях принципы генерации частей уровня 0, а затем иерархической сборки с использованием комплекта CyanoGate и клонирования в вектор, пригодный для супружеской передачи. Затем мы демонстрируем процесс конъюгальной передачи, выбор топорных трансконъюгантных штаммов, выражающих флуоресцентный маркер, и последующее получение данных флуоресценции с помощью цитометра потока или считывателя пластин.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Векторная сборка с использованием инструментариев Plant MoClo и CyanoGate

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к векторной сборке, настоятельно рекомендуется, чтобы пользователи ознакомились с структурами уровня переносчиков систем завода и CyanoGate MoCloсистем 12,15.

  1. Строительство частей уровня 0
    ПРИМЕЧАНИЕ: Части уровня 0 могут быть синтезированы в виде полных векторов или в виде линейных последовательностей для сборки с приемщиками уровня 0 (например, gBlocks, IDT). Кроме того, последовательности могут быть усилены из исходного шаблона (например, вектор или очищенная геномная ДНК). Здесь описано, как создать новую часть уровня 0 из усиленного продукта. Обзор процесса сборки Золотых Ворот от уровня 0 до уровня T отображается вРисунок 1.
    1. Дизайн грунтовки.
      1. Решите, какой модуль уровня 0 для сборки и определения соответствующих 5 "и 3" свесы (Таблица 1)12,15. Проверьте последовательность ДНК, чтобы клонировать на наличие biI или BsaI места ограничения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность, содержащая один из этих сайтов, должна быть одомашнена путем изменения одного или нескольких НТ в последовательности сайта ограничения. Стратегия для этого с помощью сборки Золотые ворота изложена на рисунке 2.
      2. Чтобы усилить последовательность ДНК, разработай соответствующую передовую и обратную грунтовую пару. Для переднего грунта выберите 18-30 bp, дополняющих 5-й конец последовательности шаблонов ДНК. Для обратной грунтовки выберите обратный 18–30 bp, дополняющие 3-й конец последовательности шаблонов ДНК.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры с температурой плавления (Tм) от 58-62 градусов по Цельсию, как правило, дают наиболее последовательные результаты усиления(рисунок 1A).
      3. Добавьте следующее к концу 5 "форварда: 1) случайная строка из 4'6 НТ в конце 5 "в конце сайта BpiI, 2) biI ограничение сайта (GAAGAC), 3) два случайных NTs, и 4) 5 "свес выбран в шаге 1.1.1.1. Добавьте следующее к концу 5 "обратной грунтовки: 1) случайная строка 4'6 NTs в 5 "конец сайта BpiI, 2) bpiI ограничение сайта (GAAGAC), 3) два случайных NTs, и 4) 3 "свес выбран в шаге 1.1.1.1. При завершении работы закажите пары грунтовки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: См Рисунок 1А на примере вперед и обратной пары грунтовки.
    2. Усиль последовательность ДНК из геномной ДНК.
      1. Извлекайте геномную ДНК, описанную в разделе 5. Усиливать продукты ПЦР с помощью полимеразы высокой точности ДНК(Таблица материалов).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера, настроить ПЦР реакции (20-50 л) в соответствии с инструкциями производителя. Используйте 100 нг геномной ДНК на одну реакцию. Используйте термическую программу велоспорта, состоящую из первоначального шага денатурации 98 градусов по Цельсию на 30 с, а затем не более 25 циклов денатурации при 98 градусах по Цельсию на 10 с, грунтовка при 58 градусах По кв. м и расширение продукта при 72 градусах по Цельсию на 30 с (изменение последнего в зависимости от размер продукта/типа используемой ДНК-полимераза), а затем заключительный этап расширения 72 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
      2. Если продукт ПЦР должен быть очищен гелем, запустите всю реакцию ПЦР на гель агарозы, как описано в разделе 6. Вырежьте полосу интереса из геля агарозы и очистить его с помощью комплекта извлечения геля(Таблица материалов).
      3. Альтернатива шагу 1.1.2.2, если продукт ПЦР должен использоваться без очистки геля, проверьте размер полосы, запустив аликот образца реакции ПЦР (5 кЛ) на геле агарозы. Если гель показывает только соответствующую полосу и никаких доказательств грунтовки димеры, очистить продукт ПЦР с помощью комплекта очистки ДНК (Таблица материалов).
      4. Elute очищенной ДНК в небольшом объеме деионизированной воды (например, 10 л), чтобы получить высокую концентрацию ДНК (Зgt;20 нг / Л, как правило, достаточно).
    3. Соберите усиленный продукт ДНК (или продукты, см. Рисунок 2)на уровне 0. Подготовьте смесь реакции на 20 л с bpiI(рисунок 1B) и назначьте программу теплового циклизатора, как описано в таблице 2. Приступить к преобразованию кишечной палочки с использованием 5 ЗЛ собранной смеси реакции уровня 0 (как описано в разделе 2).
  2. Строительство сборок уровня 1
    1. Решите, какие части уровня 0 собрать(Рисунок 1C и таблица 1). Выберите подходящий вектор приемного уровня1 15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе важно знать, что окончательный вектор дизайн будет в уровне T, так как это повлияет на выбор уровня 1 вектора приемного. Вектора приемного приема уровня 1 (Forward) (pICH47732) может быть использована по умолчанию, если цель состоит в том, чтобы иметь одну сборку уровня 1 (например, кассету экспрессии гена) в уровне T. Однако, если две или более сборки уровня 1 должны быть собраны в уровне T, необходимо учитывать положение и направление каждой сборки уровня 1. До семи сборок уровня 1 можно собрать в векторе приемного уровня T, используя вектор приемов уровня 1 с соответствующими позициями12.
    2. Соберите части уровня 0 на уровне 1. Подготовьте смесь реакции на 20 л с BsaI и навядийте программу теплового циклизатора, как описано в таблице 2. Приступить к преобразованию кишечной палочки с использованием 5 ЗЛ собранной смеси реакции уровня 1 (как описано в разделе 2).
  3. Строительство сборок уровня T
    1. Решите, какие сборки уровня 1 собрать(Рисунок 1D). Выберите подходящий вектор приема уровня T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: pUC19A-T (устойчивость ампициллин) и pUC19S-T (устойчивость спектромицицина) являются высококопированными числом интегративных векторов, которые не способны размножаться в цианобактериях и в первую очередь используются для геномной интеграции (т.е. стук-ин или выбивания генов) через гомологичная рекомбинация12. Доставка интегративных векторов может осуществляться путем естественной трансформации в поддающихся цианобактериальных видах11. pPM-AK1-T - это широкий диапазон хоста, репликационный вектор, который доставляется путем супружеской передачи (раздел 3).
    2. Выберите подходящий End-Link, чтобы связать 3 "конец окончательного уровня 1 сборки на уровне Tпозвоночника 15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется end-Link, это то же самое число, что и позиция финальной части. Например, вектор уровня Т, в основе чего входит только одна позиция 1 уровня 1 (передняя или обратная) часть, потребует end-Link 1 (pICH50872) для перевязки в магистраль уровня T.
    3. Соберите одну или несколько сборок уровня 1 в уровне T. Подготовьте смесь реакции с BpiI и требуемым вектором End-Link и навязайте программу теплового циклизатора, описанную в таблице 2. Приступить к преобразованию кишечной палочки с использованием 5 зЛ собранной смеси реакции уровня T (как описано в разделе 2).

2. Преобразование кишечной палочки и очистка вектора

  1. Преобразование кишечной палочки (день 1)
    1. Разморозить аликвот (25 л) химически компетентных клеток кишечной палочки (Таблица материалов)и аккуратно пипетку в трубку 1,5 мл на льду. Добавьте 5 qL сборочной смеси (уровень 0, 1 или T) и инкубировать трубку на льду еще 30–60 минут.
    2. Тепло-шоковые клетки путем инкубации трубки в водяной бане при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 30 с, затем поместите трубку обратно на лед в течение 2 мин. Добавить комнатной температуры (RT) супер оптимальный бульон с катаболитом репрессии (S.O.C.) среднего (250 qL) в трубку. Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию на 1 ч при 225 об/мин в трясущемся инкубаторе.
    3. Плита 40 зЛ культуры на агарную пластину LB, содержащую соответствующую окончательную концентрацию антибиотиков (100 мкг/мл для спектромицицина дигидрохлорида пентагидрата «Уровень 0», 100 мкг/мл карбенициллина динатрия «Уровень 1», или 50 мкг/мл канамицина сульфата Уровень ТЗ), 1 мМ изопропил-бета-D-thiogalactopyranoside (IPTG) и 40 мкг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-З-Д-галактопиранозид (X-Gal) для сине-белого скрининга. Инкубировать тарелку на ночь при 37 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество культуры покрытием может быть разнообразным в зависимости от эффективности E. coli компетентных клеток и перевязочных реакций. Плита большего объема, если злт;10 колоний наблюдается после ночной инкубации.
  2. Выбор белых колоний и подготовка жидких культур (день 2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от эффективности реакции сборки и последующей трансформации, LB агар пластины могут содержать никаких колоний, синих колоний или белых колоний(рисунок 3). Синие колонии свидетельствуют о векторе-приемном, которые не подверглись ограничению (т.е. функциональная копия лака все еще присутствует). Белые колонии указывают на то, что кассета с выражением лака была утеряна и заменена частью/сборкой.
    1. Дополнительно, проверить, что белые колонии содержат ожидаемый вектор, выполняя ПЦР, как описано в разделе 7.
    2. Выберите одиночные белые колонии (или пЦР проверенные колонии) с наконечником 10 Лл и перенесите в центрифугу 15 мл, содержащую среднюю среднюю LB (5 мл) и соответствующие концентрации антибиотиков (шаг 2.1.3). Инкубировать трубки при 37 градусов По Цельсию ночь при 225 об/мин в трясущихся инкубаторе.
  3. Плазмерная очистка вектор (день 3)
    1. Дополнительно, подготовить глицерол запас ночь E. coli культуры для долгосрочного криохранения переносчиков. Добавьте 500 кЛ бактериальной культуры до 500 л 50% (v/v) глицерола в соответствующей трубке 1,5-2,0 мл для криохранения при -80 градусах По цельсии. Смешайте осторожно, инвертируя 5'10x. Флэш-заморозки образцов в жидком азоте и хранить в морозильной камере -80 градусов.
    2. Спин вниз культур в 15 мл центрифуговых труб на 3000 х г в течение 5-10 мин. Отбросьте супернатант, не нарушая клеточных гранул. Очистите вектор с помощью плазмидного комплектаочистки (Таблица материалов). Очищенный вектор в 35 л деионизированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте более низкие объемы elution для дальнейшего увеличения концентрации переносчика. Один и тот же eluent можно положить через колонку очистки дважды для увеличения урожайности.
    3. Измерьте концентрацию переносчика в элевательном с помощью спектрофотометра(Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие векторы числа копий в E. coli,такие как pUC19, обычно дают урожайность 50-300 нг/Л. Низкий векторы копирования, такие как pPM-AK1-T, обычно дают урожайность 15-60 нг/Зл.
  4. Векторная проверка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Векторы могут быть проверены путем ограничения пищеварения (шаг 2.4.1) и/или секвенирования (шаг 2.4.2).
    1. Ограничьте 0,5-1 мкг вектора соответствующим ферментом ограничения (ы) и проверьте ожидаемые размеры полосы, как описано в разделе 6(рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильные размеры полосы обычно указывают на ошибочную сборку, и в этом случае можно просеивать больше белых колоний или повторять сборку. BsaI и BpiI могут быть использованы для проверки правильного размера вставки для сборок уровня 0 и уровня 1, соответственно. BsaI или BpiI можно использовать в сочетании с дополнительным, совместимым ферментом ограничения, который режет в вставке и/или векторный позвоночник для получения отдельного набора хорошо разделенных полос после пищеварения.
    2. Последовательность вектор секвенирования Сэнгер с помощью соответствующего грунтовки вверх по течению собранного региона с использованием коммерческого секвенирования объекта (Таблица 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все новые части уровня 0 должны быть секвенированы, чтобы подтвердить ожидаемую идентификацию последовательности. Последовательность проверки векторов уровня 1 и Т обычно не требуется, если они собраны из ранее секвенированных частей 0 уровня.

3. Поколение мутантов путем спряжения

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описан протокол для супружеской передачи самовоспроизводящемся грузового вектора в Synechocystis PCC 6803 или S. elongatus UTEX 297311,47. Этот протокол применим к другим типовидам (например, S. elongatus PCC 7942 и Synechococcus sp. PCC 7002). Вся работа с цианобактериями (и связанными с ними буферными препаратами) должна осуществляться в стерильных условиях в ламинарном капоте потока.

  1. Рост цианобактериальной культуры (день 1)
    1. Подготовка BG11 среды в соответствии с Lea-Smith и др.11, и агар пластины с LB-BG11 и BG11-Kan50 (раздел 8).
    2. Настройка свежей культуры Synechocystis PCC 6803 или S. elongatus UTEX 2973 путем прививки 100 мл конической колбы свежей среды BG11 (50 мл) с клетками, полученными из топорной агаровой пластины BG11. Выращивайте Synechocystis PCC 6803 культур при 30 градусах По Цельсия, 100 фотонов м-2с-1 при 100 об/мин и выращивайте S. elongatus UTEX 2973 при 40 градусах Цельсия, 300 фотонов м-2s-1 при 100 об/мин. Выращивайте культуры до OD750 и 0,5-1,5 (обычно 1–2 дня).
      ПРИМЕЧАНИЕ: S. elongatus UTEX 2973 культур ы можно вырастить при 40 градусах Цельсия при высокой интенсивности света (например, 2000 фотонов м-2с-1)48.
  2. Рост штаммов помощи и груза E. coli (день 2)
    1. Прививать среднюю среду LB, содержащую ампициллин (окончательная концентрация 100 мкг/мл) и хлорамфеникол (окончательная концентрация 25 мкг/мл) с штаммом MC1061 E. coli, содержащим переносчики pRK24 и pRL528 (т.е. штамм помощника) и вырастают при 37 градусах по Цельсию при 225 об/мин в дрожащего инкубатора. Вырастите вверх достаточный объем культуры напряжения helper, предполагая 1 mL культуры необходимо per conjugation.
    2. Прививать среднюю lb (5 мл), содержащую соответствующие антибиотики с культурой кишечной палочки, перевозящих вектор груза (т.е. вектор уровня Т). Выращивайте культуру при 37 градусах Цельсия на ночь при 225 об/мин в тряся инкубаторе.
  3. Супружеская передача (три-родительский спаривание) (день 3)
    1. Подготовьте e. coli помощника и грузовых штаммов. Centrifuge помощник и груз E. coli ночных культур на 3000 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта, не нарушая клеточные гранулы.
    2. Вымойте гранулы, добавив свежий средний LB без антибиотиков. Используйте тот же объем, что и начальная культура. Resuspend гранулы, мягко pipetting вверх и вниз. Не вихрь культуры. Повторите этот шаг 3x, чтобы удалить остаточные антибиотики из ночной культуры.
    3. Центрифуге переподвески культуры (как в шаге 3.3.1), отбросить супернатант и resuspend в два раза объем LB среды первоначального объема культуры (например, 2,5 мл, если ночная культура была 5 мл). Смешайте 450 л сосевого штамма с 450 л грузо-нагрузки в трубке 2 мл и отложите (оставьте на РТ) до 3,3,6 шага.
    4. Подготовьте цианобактериальную культуру. Для каждой реакции спряжения используйте 1 мл цианобактериальной культуры (OD750 и 0,5-1,5).
    5. Centrifuge необходимый общий объем цианобактериальной культуры на 1500 х г в течение 10 минут на RT, а затем отбросить супернатант тщательно, не нарушая клеточной гранулы. Вымойте гранулы, добавив свежий BG11 среды того же первоначального объема. Resuspend гранулы, мягко pipetting вверх и вниз, не вихрь культуры. Повторите этот шаг 3x и установить мыть культуры в сторону.
    6. Добавьте аликот промытой цианобактериальной культуры (900 л) к комбинированным штаммам кишечной палочки (помощник и груз) (900 л) в трубке объемом 2 мл. Смешайте культуры, мягко пипетки вверх и вниз. Не вихрь. Инкубировать смесь на RT в течение 30 мин для Synechocystis PCC 6803 или 2 ч для S. elongatus UTEX 2973.
    7. Центрифуга смесь на 1500 х г в течение 10 мин на RT. Удалить 1,6 мл супернатанта. Отрежь гранулу в оставшихся 200 евро супернатанта. Поместите один мембранный фильтр 0,45 мкм на агарную пластину LB-BG11, в ней нет антибиотиков (раздел 8). Тщательно распределите 200 л e. coli/cyanobacterialсмесь культуры на мембране с стерильным распределителей или стерильным согнутым кончиком и загерметизируйте пластину парафинаю пленкой.
    8. Инкубировать пластину LB-BG11 с мембраной на 24 ч. Поддерживать мембраны с Synechocystis PCC 6803 культур при 30 градусах Цельсия, 100 фотонов м-2s-1. Поддержание мембран с S. elongatus UTEX 2973 культур при 40 градусах По Цельсия в 150 фотонов м-2s -1.
  4. Передача мембраны
    1. После 24 ч тщательно перенесите мембрану с помощью стерилизованных щипцы BG11 на свежую агарную пластину BG11, содержащую соответствующие антибиотики (раздел 8), чтобы выбрать для грузового вектора. Запечатать тарелку парафиновой пленкой.
    2. Инкубировать пластину BG11 агара при соответствующих условиях роста, как описано выше для Synechocystis PCC 6803 или S. elongatus UTEX 2973, пока не появятся колонии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии обычно появляются после 7-14 дней для Synechocystis PCC 6803 и 3-7 дней для S. elongatus UTEX 2973.
  5. Выбор конъюгантов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только цианобактериальные колонии, несущие грузовой вектор, смогут расти на мембране(рисунок 5).
    1. Используя тепловую стерильную петлю, выберите по крайней мере две отдельные колонии из мембраны и полосой на новую агарную пластину BG11, содержащую соответствующие антибиотики(рисунок 5C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеполосые колонии все еще могут быть загрязнены кишечной палочкой, перенесенной из спряжения (т.е. если маленькие белые колонии видны на тарелке), так что два или три дополнительных раунда повторного полосирования на свежие пластины агара BG11, как правило, необходимо получить топоровую цианобактериальную культуру.
    2. Подтвердите отсутствие загрязнения кишечной палочкой, прививая полосу цианобактериальной культуры в центрифугу 15 мл, содержащую 5 мл среды LB и инкубируя при 37 градусах Цельсия на ночь при 225 об/мин в дрожащий инкубатор. После достаточного периода роста (7 дней) выберите отдельные опорные колонии для создания жидких культур для длительного криохранилища или последующего экспериментирования.
  6. Криохранилище цианобактериальных штаммов
    1. Выращивайте цианобактериальную жидкую культуру в BG11 (как описано в разделе 3.1) до OD750 и 1,5-3,0. Центрифуга 10 мл культуры в течение 10 минут при 1500 х г,удалить супернатант и resuspend клеток в 5 мл свежей среде BG11.
    2. Добавьте 3,5 мл автоклава стерилизованного 50% (v/v) глицерола для окончательной концентрации глицерола в размере 20% (v/v)49. Этот подход хорошо работает для Synechocystis PCC 6803. Кроме того, добавьте 5 мл фильтра стерилизованного BG11, содержащего 16% (v/v) диметилсульфид (DMSO) для окончательной концентрации DMSO в размере 8% (v/v)50. Этот подход рекомендуется для большинства штаммов, в том числе S. elongatus UTEX 2973.
      ВНИМАНИЕ: DMSO является токсичным и должны быть обработаны с соответствующей защитой.
    3. Смешайте осторожно, инвертируя 5'10x. Subaliquot 1 мл культуры в отдельные криохранилище совместимы 1,5 мл винт-крышка труб (Таблица материалов). Поместите трубки в морозильную камеру -80 градусов для криохранилища. Не мигает замораживанием в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется по крайней мере три запаса на штамм.
    4. Для восстановления, удалить трубку из морозильной камеры -80 градусов и разморозить культуру в 35 градусов по Цельсию водяной бане во время мягкосмешивания. Добавьте оттаять культуру до 50 мл свежей среды BG11 и вырастикакзайте как жидкая культура (как описано в разделе 3.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, культура может быть полосатый и выращенный на свежем BG11 агар пластины. Трансгенные культуры, несущие маркеры отбора, должны быть возрождены сначала на агарных пластинах BG11 без антибиотиков, а затем перебрасываются на агарные пластины BG11 с соответствующими антибиотиками.

4. Характеристика промоутера

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь стандартный подход описан для анализа силы промоутер части путем измерения уровня экспрессии флуоресцентного маркера (eYFP) после 72 ч период роста с использованием либо пластины читателя или потока цитометра12.

  1. Рост культуры
    1. Настройка семенных культур путем прививки 10 мл BG11 среды, содержащей соответствующие антибиотики с одной колонией трансгенного цианобактериального штамма, несущего флуоресцентный маркер экспресс-кассеты. Также подготовьте культуры семян для соответствующих отрицательных штаммов контроля (например, штамм дикого типа и/или трансгенный штамм, несущий тот же векторный костяк, но не обладающий флуоресцентным маркером экспресс-кассеты).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется по крайней мере четыре биологических репликации.
    2. Выращивайте семенные культуры в течение 48 ч или до OD750 и 1,5 в условиях роста, подходящих для штамма видов.
    3. Чтобы отслеживать выражение промоутера с течением времени, сначала измерьте OD750 каждой культуры семян. Рассчитайте требования к разбавлению, чтобы довести каждую культуру до стартового OD750 и 0,2. Настройка разбавленных образцов экспериментальной культуры (2 мл общего объема) в плоской нижней 24-колодскойпластине (Таблица материалов).
    4. Инкубировать тарелку в трясущегося инкубатора белыми светодиодными фонарями(Таблица Материалов)при соответствующих условиях роста. Измерьте плотность роста культуры (OD750) и усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP) флуоресценция с помощью либо считывателя пластин (раздел 4.2) или цитометра потока (раздел 4.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Synechocystis PCC 6803 и S. elongatus UTEX 2973 культур могут быть выращены как в шаге 3.1.2. Настоятельно рекомендуется поддерживать пластину при высокой влажности (95%) во избежание испарения образцов культуры.
  2. Читатель плиты
    1. Кратко смешайте культуры в 24-хорошей пластине (шаг 4.1.4) с нежным пипеттингом. Передача подобразца каждой культуры в черную плоскую 96-колодную пластину(Таблица материалов). При необходимости разбавить (100 л конечного объема). Избегайте образования пузырьков, так как это может помешать точности измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы все измерения проводились на образцах в диапазоне OD750 от 0,2 до 1,0. Поскольку плотность культур в 24 скважине будет увеличиваться с течением времени, рекомендуется следующее разбавление на основе ожидаемого увеличения стандартных условий роста: не разбавлять на 0 ч, 1:4 при 24 ч, 1:10 при 48 ч и 1:10 при 72 ч. Так, например, при 24 ч урожая 25 л культуры и смешать с 75 л bg11 среды.
    2. Включите две пустые скважины в 96-ну хорошую пластину (т.е. 100 л среды BG11). Положите 96-ну колодец в тарелку читателя(Таблица материалов). Встряхните пластину на 60 с при 500 об/мин с помощью орбитального шейкера в считывателе пластины, чтобы смешать колодцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цианобактериальные культуры могут агрегировать и / или flocculate, так что хорошее смешивание имеет решающее значение до чтения для точных измерений.
    3. Измерьте OD750 и флуоресценцию eYFP с волной возбуждения/выбросов на уровне 485 нм/520 нм.
    4. Вычесть среднее OD750 измерений двух пустых скважин из OD750 измерения каждого образца хорошо содержащие цианобактерии культуры.
    5. Нормализовать значения флуоресценции каждого образца культуры путем деления измерения флуоресценции eYFP (шаг 4.2.3) на скорректированный OD750 культуры (шаг 4.2.4). Затем вычесть среднее нормализованное значение флуоресценции eYFP (eYFP флуоресценция/OD750) биологических репликаций соответствующего отрицательного контрольного штамма трансгенных штаммов, несущих кассету выражения eYFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цианобактерии естественно флуоресцирует из-за присутствия пигментов, таких как хлорофилл и фикобилипротеины.
    6. Рост культуры участка с течением времени(рисунок 6A)и средние нормализованные значения флуоресценции eYFP каждой экспериментальной культуры в желаемые временные точки (например, 72 ч; Рисунок 6B).
  3. Цитометр потока
    1. Выберите совместимую пластину для системы обработки цитометра потока жидкости. Например, используйте кругло-нижнюю пластину 96-ну колодец(Таблица материалов)с цитометром потока(Таблица материалов),используемой в этом протоколе.
    2. Кратко смешайте культуры в 24-хорошей пластине (шаг 4.1.4) с нежным пипеттингом. Разбавлять культуры до OD750 и 0,1-0,2, чтобы избежать завалов сопла в системе обработки жидкости. Добавьте соответствующий объем образца культуры в 96-ну хорошую пластину и доведите до конечного объема 250 зл с фильтром стерилизованного 1x фосфат-буферизированного солей (PBS). Включите пустой колодец для среднего раствора на пластине, содержащей 60 зл BG11 и 190 Л 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот том рекомендуется в случае необходимости повторного запуска образцов. Объемы, превышают 250 л, не рекомендуются, так как максимальный объем каждой скважины составляет 300 л.
    3. Как только цитометр потока будет готов к использованию, поместите 96-ну колодец с образцами культуры в станцию обработки жидкости. Настройка программного протокола для цитометра потока для сбора измерений 10 000 отдельных событий (например, ячеек). Измерьте флуоресценцию eYFP с волной возбуждения/выбросов 488 нм/515-545 нм. Сначала измерьте и проверьте показания из пустого колодца(рисунок 7А),затем запустите образцы.
    4. Ворота населения клеток цианобактерий в вперед и боковой рассеяния наборов данных, за исключением регионов, общих с пустым чтением (Рисунок 7B). Вычесть средние значения флуоресценции eYFP биологических репликации соответствующего отрицательного штамма контроля от трансгенных штаммов, несущих кассету выражения eYFP (Рисунок 7C,D). Участок среднего значения медианной флуоресценции на ячейку для каждой экспериментальной культуры в желаемые временные точки (например, 72 ч; Рисунок 7E).

5. Геномная экстракция ДНК из цианобактерий

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол ниже использует коммерческий комплект извлечения ДНК (Таблица материалов).

  1. Выращивайте цианобактериальную жидкую культуру в BG11 (как описано в разделе 3.1) до OD750 и 1,5-3,0. Спин вниз 10 мл культуры на 3000 х г в течение 10 минут и отбросить супернатант. Заморозить гранулы, инкубируя трубки при -20 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  2. Добавьте 400 кЛ буфера лизиса (буфер AP1) и 400 л раствора рибонуклеазы (RNase A) и 50% (w/v) стеклянных бусин (диаметр омичей 0,5 мм). Нарушить образцы с помощью бисомного завода(Таблица материалов) на 30 Гц (т.е., что эквивалентно 1800 колебаний / мин) в течение 6 мин.
  3. Спин образца на 17000 х г в течение 5 минут и тщательно передать супернатант в новую трубку и отказаться от гранул. Продолжить в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).

6. Электрофораз геля Агарозе

  1. Броймид этия 1% (w/v), содержащий 0,02% (v/v) бромистого этидия. Образцы нагрузки и соответствующая справка по лестнице ДНК.
  2. Выполнить образцы в течение 50 минут на 125 V. Проверьте для разделения полосы на ультрафиолетовый (УФ) трансиллюминор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время работы и процент агарозного геля могут быть изменены в соответствии с ожидаемым размером полосы. Например, более высокий процент агарозного геля и более длительное время работы могут улучшить разрешение полосы и разделение продуктов ДНК.

7. Колония ПЦР

  1. Настройка смеси реакции ПЦР с использованием стандартного комплекта(Таблица материалов)и соответствующей комбинации грунтовок (например, грунтовки, которые обрамляют область сборки или специфичны для последовательностей в области сборки (таблица 3). Пипетка 10 л в трубку ПЦР.
  2. Аккуратно коснитесь верхней части одной белой колонии стерильной зубочисткой или наконечником пипетки в 10 л и привить трубку ПЦР, содержащую смесь реакции ПЦР. Позаботьтесь, чтобы отметить колонию и матч с конкретной трубки ПЦР. Аккуратно перемешать реакцию смесь для обеспечения E. coli клетки пролить в раствор.
  3. Усиливаем продукты с помощью ПЦР. Используйте программу, состоящую из первоначального шага денатурации 95 градусов по Цельсию для 60 с, 30 раундов 95 градусов по Цельсию для 15 с, 58 градусов для 15 с (несколько градусов ниже значения Тм грунтовки) , 72 КК для 30 с (30 с/кб вставки) , а затем заключительный шаг расширения 72 кК в течение 5 мин.

8. Подготовка средней и тарелки BG11

  1. Подготовка фондовых решений 100x BG11 среднего, железа (аммоний феррик цитрат), микроэлементы, фосфат (K2HPO4), Na2CO3 и TES буфера в соответствии с Lea-Smith и др.11. Автоклав фосфат и Na2CO3 запасов. Используйте 0,2 мкм фильтры для фильтрации стерилизации буфера TES (pH 8.2) и наскладовых решений NaHCO3.
  2. Подготовьте 1 L среды BG11. Смешайте 10 мл 100x BG11, 1 мл микроэлементов и 1 мл железного бульона и автоматически йодля раствор с 976 мл воды. После того, как раствор охладился до RT, добавьте 1 мл фосфатного запаса, 1 мл запасов Na2CO3 и 10 мл NaHCO3,и приспособите к рН 7,6-7,8 с 1 М Л.К.
  3. Агарные тарелки LB-BG11 (1,5% (w/v)
    1. Смешайте 700 мл деионизированной воды и 15 г агара в стеклянной колбе. Во вторую колбу добавьте 186 мл воды, 10 мл 100x BG11, 1 мл микроэлементов и 1 мл железного бульона. Autoclave обоих решений.
    2. После того, как растворы охладились примерно до 60 градусов по Цельсию, объединить их и добавить 1 мл фосфатного бульона, 1 мл Na2CO3 шт., 10 мл запасов NaHCO3 и 50 мл lb стерильной среды, которая должна дать окончательный объем 1 L. Cast Петри блюда с 25 mL агар-среды LB-BG11.
  4. Агарные тарелки BG11-Kan50 (1,5% (w/v)
    1. Смешайте 700 мл деионизированной воды и 15 г агара в стеклянной колбе. Во вторую колбу добавьте 3 г тиосульфата натрия (Na2S2O3),226 мл воды, 10 мл 100x запаса BG11, 1 мл микроэлементов и 1 мл железного бульона. Autoclave обоих решений.
    2. После того, как растворы охладились примерно до 60 градусов по Цельсию, объединить их и добавить 1 мл фосфатного бульона, 1 мл Na2CO3 запасов, 10 мл буферного запаса TES, и 10 мл запасов NaHCO3, который должен дать окончательный объем 1 Л. Добавить канамицин сульфат до конечной концентрации 50 мкг/мл и отливаем блюда Петри с 35 мл средней.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для демонстрации рабочего процесса сборки Золотых Ворот в векторе приемки 1-го уровня (Forward) (pICH47732) была собрана экспресс-кассета, содержащая следующие части уровня 0: промоутер C-фикоцианина оперона Pcpc560 (pC0.005), последовательность кодирования для eYFP (pC0.008) и дво...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Сборка Золотых ворот имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами векторной сборки, особенно с точки зрения масштабируемости20,21. Тем не менее, настройка системы «Золотые ворота» в лаборатории требует времени для того, чтобы ознакомиться с разли...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы признательны Сети БИОтехнологии и биологических наук PHYCONET (BBSRC) в области промышленной биотехнологии и биоэнергетики (NIBB) и Центру инноваций в области промышленной биотехнологии (IBioIC) за финансовую поддержку. GARG, AASO и AP признают финансовую поддержку программы BBSRC EASTBIO CASE PhD (грант bb/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) PhD программы, а также программы совместного обучения IBioIC-BBSRC (CTP) Соответственно. Мы благодарим Конрада Маллино (Лондонский университет Королевы Марии) и Поула Эрика Дженсена и Джули Аннемари Зита Зедлер (Копенгагенский университет) за плазмидный вектор и протокольные вклады и советы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Thermo Fisher ScientificR0404Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium saltSigma-AldrichA2383Used in Table 2.
Agar (microbiology tested)Sigma-AldrichA1296-500gUsed in 8.3.
AgaroseBiolineBIO-41026Used in 6.
Attune NxT Flow CytometerThermo Fisher Scientific-Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153Used in Table 2.
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011Used in Table 2.
BsaI (Eco31I)Thermo Fisher ScientificER0291Used in Table 2.
Carbenicillin disodiumVWR InternationalA1491.0005Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well platesSigma-AldrichCLS3527Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Thermo Fisher ScientificBP231-100Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate readerBMG Labtech-Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK0503Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter)BioSpec Products11079105Used in 5.2.
GlycerolThermo Fisher Scientific10021083Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Thermo Fisher Scientific10356553Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco)Thermo Fisher Scientific11815-024Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm)MF-MilliporeHAWP02500Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEARGreiner Bio-One655096Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction KitNew England BiolabsT1020SUsed in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1030DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDsInfors HT-Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21108Used in 7.1.
NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WUsed in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coliThermo Fisher ScientificC404010Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)VWR InternationalK813Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0491SUsed in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA LadderNew England BiolabsN0468SUsed in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml)Starstedt72.692.210Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrateVWR InternationalJ61820.06Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well platesThermo Fisher Scientific612U96Used in 4.3.1.
T4 DNA ligaseThermo Fisher ScientificEL0011Used in Table 2.
TissueLyser IIQiagen85300Bead mill. Used in 5.2.

Ссылки

  1. Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
  2. Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
  3. Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
  4. Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
  5. Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140(2017).
  6. Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
  7. Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
  8. Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
  9. Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
  10. Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
  11. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001(2016).
  12. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  13. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
  14. Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
  15. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  16. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  17. Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
  18. Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
  19. Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
  20. Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
  21. Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
  22. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  23. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
  24. Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
  25. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  26. Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
  27. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
  28. Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640(2016).
  29. Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
  30. Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34(2018).
  31. Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
  32. Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
  33. Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
  34. Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136(2014).
  35. Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
  36. Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
  37. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
  38. Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10(2013).
  39. Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
  40. Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
  41. Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
  42. Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
  43. Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
  44. Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
  45. Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
  46. Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
  47. Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132(2015).
  48. Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
  49. Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
  50. Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , Wiley Blackwell. New York. 319-327 (2014).
  51. Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500(2014).
  52. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  53. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
  54. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828(2016).
  55. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

152Synechocystis sp PCC 6803Synechococcus elongatus UTEX 2973

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены