Количественная оценка пролиферативной и мертвой клетки в Enteroids

Резюме

Представленный протокол использует цитометрию потока для количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных вратах мыши. Этот метод полезен для оценки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию и выживание органов.

Аннотация

Кишечный эпителий действует как барьер, который предотвращает проникновение в остальную часть тела содержимого светила, например патогенной микробиоты и токсинов. Функция эпителиального барьера требует целостности кишечных эпителиальных клеток. В то время как эпителиальная пролиферация клеток поддерживает непрерывный слой клеток, который образует барьер, эпителиальный ущерб приводит к барьерной дисфункции. В результате содержимое светильника может пересекать кишечный барьер неограниченным путем. Дисфункция кишечного барьера была связана со многими кишечными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника. Изолированные мыши кишечные склепы могут быть культивированы и поддерживается как склеповидные структуры, которые называются кишечными органоидами или "энтероидами". Энтероиды идеально подходят для изучения пролиферации и клеточной смерти кишечных эпителиальных клеток in vitro. В этом протоколе мы описываем простой метод количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных энтероидах. 5-этинил-2'-deoxyuridine (EdU) и пропидий йодид используются для обозначения размножающихся и мертвых клеток в энтероидах, а доля размножающихся и мертвых клеток затем анализируется цитометрией потока. Это полезный инструмент для проверки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию эпителиальных клеток кишечника и выживание клеток.

Введение

Фундаментальная функция кишечных эпителиальных клеток заключается в защите попадания содержимого светила, таких как патогенные бактерии и токсины^1,2. Для выполнения такой функции, кишечные стволовые клетки непрерывно размножаться и дифференцироваться в различные эпителиальные клетки, в том числе энтероцитов и секреторных клеток, которые образуют барьер, образуя тесные соединения³. Быстрое обновление кишечных эпителиальных клеток требует строгой координации пролиферации клеток, дифференциации клеток и гибели клеток^4,5. Снижение пролиферации клеток или чрезмерная гибель клеток приводит к эпителиальному повреждению и скомпрометированной функции^{барьера1,6}. Дисфункция кишечного барьера была связана с воспалительными заболеваниями кишечника^7,8.

Ранее был разработан метод культуры кишечных склепов. Используя этот метод, изолированные мыши ные склепы растут в кишечные органоиды (enteroids), которые имеют crypt-villus как структуры и содержат все кишечной эпителиальной линии клеток^9,10. 5-этинил-2'-deoxyuridine (EdU) является аналогом тимидина, который способен заменить тимин (T) в ДНК, которая проходит репликацию во время пролиферации клеток. Пролиферативные клетки могут быть быстро и точно помечены EdU окрашивания. Propidium iodide (PI) является аналогом бромида этидия, который высвобождает красную флуоресценцию при вставке в двухцепочечную ДНК. PI специально обнаруживает мертвые клетки, так как он проходит только через поврежденную мембрану клетки.

В этом протоколе мы сначала описываем, как изолировать склепы из тонкой кишки, а затем культивировать их как ветероиды in vitro. Затем мы описываем, как анализировать пролиферативные и мертвые клетки в enteroids EdU и PI включения и потока цитометрии.

протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Кембриджского-Судаского геномного ресурсного центра (CAM-SU) при Университете Соохова.

1. Кишечная органоидная изоляция и культура

1. Изоляция кишечных склепов и энтероидной культуры
   1. Эвтаназия 8-недельная мышь дикого типа с ингаляцией CO_2. Используйте щипцы ткани и тонкие ножницы радужной оболочки, чтобы вскрыть примерно 8 см илеума.
   2. Промыть с помощью шприца с gavage кормления иглы около 40 мл ледяной Dulbecco в фосфат-буферный солей (DPBS), а затем вырезать вдоль с ножницами и открыть ileum.
   3. Разрежьте илеум на мелкие (0,5–1,0 см) кусочки. Поместите кусочки в 5 мл стерильных ледяных DPBS в 15 мл конической трубки, затем рок в течение 5 минут на льду.
   4. Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать DPBS и заменить его 10 мл холодного буфера 1 (2 мМ EDTA в DPBS). Рок в течение 30 минут на льду.
   5. Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать буфер 1 и заменить 10 мл холодного буфера 2 (54,9 мМ D-сорбитол, 43,4 мм сахарозы в DPBS). Встряхните вручную (80 коктейлей/мин).
   6. Возьмите 20 капель ногой буфера 2 содержимого после встряхивания и проинспектировать под микроскопом.
   7. Фильтр буфера 2 содержимое с 70 мкм стерильной ячейки ситечко, а затем собрать фильтрованный буфер с 50 мл конической трубки.
   8. Пипетка 20 л фильтрана на слайде, чтобы подсчитать склепы. Перенесите достаточный объем буфера 2 со шага 1.1.7, чтобы обеспечить наличие склепов/скважин ы 500 евро.
   9. Спин вниз на 150 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. После того, как спиннинг закончен, тщательно аспирируйте супернатант.
   10. Приостановить склепы в 50 qL подвала мембранной матрицы (например, Matrigel) на 500 склепов, пипетка вверх и вниз (будьте осторожны, чтобы избежать пузырьков), а затем поместить 50 л капли подвала мембраны матрицы / крипто смеси в центре одного колодца в 24 хорошо пластины. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию для полимеризации мембранной матрицы подвала.
   11. После 30 минут полимеризации, тщательно добавьте 600 л минигут-носителей (продвинутый dulbecco в модифицированных Eagle среды "DMEM"/F12, 2 мМ L-аланин-L-глутамамин, перо / стрептококк 100 единиц / мл, 10 мМ hepes, N2 дополнение «1:100», Дополнение B27 (1:50) с эпидермальным фактором роста (EGF; 50 нг/мл), Noggin «100 нг/мл», R-спондин (500 нг/мл) и Y27632 »10 м/м) в каждом колодце, затем верните пластину к каждому. Наблюдайте под микроскопом каждый день и меняйте носители каждые 2–3 дня.
2. Энтероид проходив
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для длинных культур, enteroids должны быть разделены примерно каждую неделю.
   1. Для прохождения входоидов поместите пластину культуры тканей на лед. Аспирировать средства массовой информации и добавить 1 мл холодного DPBS к каждой скважине. Используйте p1000 наконечник пипетка вверх и вниз, пока не твердых подвале мембраны матрицы куски остаются.
   2. Проходите вверх и вниз один раз через 1 мл инсулина шприц (27 G) и в 15 мл конической трубки. Спин вниз в течение 5 мин при 150 х г при 4 градусах По Цельсию.
   3. Используйте пипетку для удаления DPBS. Повторное в 50 зл ес подвальной мембранной матрицы/ хорошо.
   4. Поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы позволить мембранной матрице подвала полимеризоваться. Наложить каждую скважину с 600 мл носителей ENR (минигут-медиа, 50 нг/мЛ EGF, 100 нг/мл Ноггин, 500 нг/мл R-спондин), затем верните пластину в инкубатор.

2. Анализ цитометрии потока EdU-положительных клеток в Enteroids

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан рабочий процесс для анализа цитометрии потока в энтероидах.

1. Инкубация энтероидов с EdU
   1. Расти введите от шага 1.2.4 в течение 5-7 дней. Проход введите в новую 24 скважину пластины в разделении соотношение 1:2. Добавьте 600 л среды ENR к каждой скважине. Инкубировать ветроииды в течение 4-5 дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
   2. Установите контрольную группу (необработанные ветероиды) и экспериментальную группу (энтероиды, обработанные 5 нг/мл интерлейкина 22 «IL-22»). Подготовьте по крайней мере три реплики для каждой группы.
   3. Добавьте EdU к среде ENR, чтобы подготовить среду EdU с концентрацией 50 мкм. Добавьте 600 кL среды EdU к каждой скважине и инкубировать в течение 2 ч в инкубаторе 37 градусов по Цельсию. Установите один колодец enteroids без лечения EdU в качестве отрицательного контроля для фонового вычитания.
2. Сбор энтероидов из мембранной матрицы подвала
   1. Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать среду EdU и мыть 1x с DPBS. Добавьте 1 мл DPBS.
   2. Используйте P1000 пипетка отзыв и пипетка вверх и вниз, пока не твердых подвале мембраны матрицы куски остаются. Перенесите на трубку 15 мл и вращайтесь при 300 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
   3. Добавьте 500 qL клеточных диссоциационных ферментов(Таблица Материалов)и инкубировать в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия. Используйте P200 пипетка отзыв и пипетка вверх и вниз, чтобы сломать enteroids в одиночные клетки.
   4. Добавьте 3 мл среды DMEM, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и неоднократно пипетку с наконечником пипетки P1000.
   5. Спин вниз на 300 х г в течение 5 минут и аспирации супернатант среды. Приостанавливайте клетки с 1 мл DPBS.
3. Фиксация и пермяки клеток
   1. Перенесите суспензию клетки в трубку 1,5 мл, снесите 300 х г в течение 5 минут и отбросьте супернатант.
   2. Resuspend клетки с 1 мл 4% параформальдегида (PFA), исправить в течение 15 минут при комнатной температуре (RT), и спина вниз на 300 х г в течение 5 минут.
   3. Resuspend клетки с 1 мл 0,5% неионический сурфактант. Инкубировать в течение 10 минут на RT.
   4. Спин вниз на 300 х г в течение 5 минут и аспирации супернатанта. Вымойте 1x с DPBS и спина вниз, чтобы удалить супернатант.
4. Обнаружение EdU
   1. Подготовьте фондовые решения для каждого компонента заранее: 1) рабочее решение Alexa Fluor azide, 2) рабочее решение 1x EdU буферреакции, и 3) 10x стоковое решение буферной добавки EdU.
   2. Приготовьте буферную добавку 1x EdU, разбавив 10-x раствор 1:10 в деионизированной воде. Приготовьте это решение свежим.
   3. Подготовка реакции коктейль в соответствии с таблицей 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте ингредиенты в порядок, указанный в таблице. Используйте реакционный коктейль в течение 15 минут после приготовления.
   4. Добавьте 100 юаней реакционных коктейлей к каждой трубке 1,5 мл. Приготовите клетки, защитите от света, инкубируют в течение 30 мин на РТ.
   5. Центрифуга при 300 х г в течение 5 минут и аспирируй раствор реакции с помощью наконечника пипетки мягко.
   6. Добавьте 0,5% неионического сурфактанта пенантанта к каждой трубке, чтобы вымыть 1x на RT. Центрифуга при 300 х г в течение 5 минут, аспирировать супернатант с кончиком пипетки мягко, и resuspend клетки в 1 мл DPBS.
5. Анализ клеток по цитометрии потока
   1. Фильтр resuspended клетки с 40 мкм ситечко, а затем собирать фильтрованные клетки с 15 мл конической трубки. Выполните FACS на машине обнаружения как можно скорее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если условия ограничены, образцы окрашенных клеток должны храниться в темноте при 4 градусах Цельсия и проверять поток в течение 3 дней.
   2. Выберите подходящий канал (в зависимости от типа азида Alexa Fluor в комплекте EdU; здесь, красный канал) и напряжение (здесь, 150-350 В) для анализа цитометрии потока.
   3. Стратегия Гатинга
      1. Нарисуйте fSC-A (x-оси) против псевдоцветного участка SSC-A (y-axis) и распределите большую часть ячеек в видимый диапазон точечной карты, регулируя напряжение. Выберите популяцию клеток (R1) и исключите мусор в левом нижнем углу.
      2. Из r1 ячейки населения, установить FSC-A (x-оси) против. FSC-H (y-axis) псевдоцвет участок, и установить ворота, чтобы выбрать одиночные ячейки (R2), чтобы исключить ячейки сгустки.
      3. Из R2 ячейки населения, установить интенсивность флуоресценции (x-оси) против. номер ячейки (y-оси) участок, и использовать отрицательный элемент управления, чтобы установить ворота. Область флуоресцентного сигнала является положительной клеточной областью (R3). Сравните соотношение EdU-положительных ячеек (R3) между экспериментальными и контрольными группами.

3. Анализ цитометрии потока PI-положительных клеток в Enteroids

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показан рабочий процесс для анализа цитометрии потока PI-положительных клеток в ветроидах.

1. Инкубация энтероидных клеток с Pi
   1. Расти введите от шага 1.2.4 в течение 5-7 дней. Проход введите в новую 24 скважину пластины в разделении соотношение 1:2. Добавьте 600 л среды ENR к каждой скважине. Инкубировать ветроииды в течение 4-5 дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
   2. Установите контрольную группу (необработанную) и экспериментальную группу (IL-22 обработанный), используя по крайней мере три реплики для каждой группы.
   3. Добавьте PI в среду ENR для подготовки PI-среды с концентрацией 3 мкм.
   4. Добавьте 600 qL среднего PI к каждой скважине и инкубировать в течение 30 минут в инкубаторе 37 градусов по Цельсию. Установите один колодец enteroids без лечения Pi в качестве отрицательного контроля для фонового вычитания.
2. Урожайные ветоиды из мембранной матрицы подвала следующие шаги 2.2.1-2.2.5.
3. Анализ клеток по цитометрии потока
   1. Фильтр resuspended клетки с 40 мкм ситечко и собирать фильтрованные клетки с 15 мл конической трубки.
   2. Выполните FACS на машине обнаружения как можно скорее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если условия ограничены, образцы окрашенных клеток должны храниться в темноте при 4 градусах Цельсия и проверять поток в течение 3 дней.
   3. Выберите подходящий канал (здесь, красный канал) и напряжение (здесь, 150-350 В) для анализа цитометрии потока.
   4. Используйте ту же стратегию gating, описанную в разделе 2.5.3.

Результаты

Небольшие кишечные склепы были изолированы и культивированы как enteroids в подвальной мембранной матрице. Энтероиды начали образовывать бутоны через 2 дня после изоляции. На 6-й день, enteroids было много почек с большим количеством мусора (мертвые клетки) в просвете. Enteroids были готовы к прохожд?...

Обсуждение

Этот протокол детализирует шаги, необходимые для культуры enteroids in vitro и количественной оценки EdU- и PI-положительных клеток в enteroids цитометрией потока. Есть несколько преимуществ этой стратегии. Во-первых, маркировка EdU используется для обнаружения размножающихся клеток в ветроидающих. П?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Corning	430791
22 G gavage needle	VWR	20068-608
24-well plate	Nunc	142475
40 mm sterile cell strainer	BD	352340
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
70 mm sterile cell strainer	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Supplement	GIBCO	17504044
Buffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2			54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life technologies	C10639
CO2 incubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO	14190144
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR media			Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
Fine Iris Scissors	Tansoole	2037454
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement	R&D	AR009
Nonionic surfactant (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehyde (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phase contrast microscope	Nikon	TS1000
Propidium iodide	Sigma	P4170-25MG
Recombinant EGF	PeproTech	315-09
Recombinant Mouse Noggin	PeproTech	250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1	R&D	3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sucrose	BBI	SB0498
Tissue Forceps	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049