Клетки коронарного прародителя и растворимые биомаркеры в сердечно-сосудистом прогнозе после коронарной ангиопластики

Резюме

Развитие основных неблагоприятных сердечно-сосудистых событий, которые влияют на прогноз сердечно-сосудистой системы после коронарной ангиопластики, зависит от степени повреждения коронарной короны и сосудоску. Использование новых коронарных клеточных и растворимых биомаркеров, реактивных к повреждениям сосудов и ремонту, полезно для прогнозирования развития MACEs и прогноза.

Аннотация

Основные неблагоприятные сердечно-сосудистые события (MACEs) негативно влияют на сердечно-сосудистый прогноз пациентов, перенесших коронарную ангиопластику из-за коронарной ишемической травмы. Степень коронарного повреждения и механизмы восстановления сосудов являются факторами, влияющими на дальнейшее развитие MACEs. Внутренние сосудистые особенности, такие как характеристики бляшки и сложность коронарных артерий, продемонстрировали прогностические данные для MACEs. Однако использование внутрикоронарных циркулирующих биомаркеров было постулировано как удобный метод ранней идентификации и прогноза MacEs, поскольку они более точно отражают динамические механизмы, связанные с повреждением коронарного состояния и ремонтом. Определение коронарных циркулирующих биомаркеров во время ангиопластики, таких как количество субпопуляций моноядерных клеток-прародителей (MpCs), а также концентрация растворимых молекул, отражающих воспаление, клеточную сцепку и ремонт, позволяет оценка будущих событий и прогноз MACEs 6 месяцев после коронарной ангиопластики. Этот метод подчеркивается его трансляционным характером и лучшей производительностью, чем периферическая кровь, циркулирующая биомаркерами относительно прогнозирования MACEs и его влияния на прогноз сердечно-сосудистой системы, который может быть применен для расслоения риска пациентов при ишемической болезни сердца, проводящей ангиопластику.

Введение

Коронарная ангиопластика и стентирование представляют собой процедуру спасения пациентов с ишемической болезнью сердца (CAD). Однако основные неблагоприятные сердечно-сосудистые события (MACEs), включая сердечно-сосудистую смерть, инфаркт миокарда, коронарный рестеноз, а также эпизоды стенокардии или декомпенсации сердечной недостаточности, могут произойти через несколько месяцев после коронарного вмешательства, что вызвало незапланированные визиты в больницу. MACEs являются общими во всем мире и их morbi-смертность высока¹.

Коронарная ишемическая травма вызывает раннюю сосудистую реакцию и репаративные механизмы, включающие мобилизацию ПДК из-за их дифференциации и/или ангио-репаративного потенциала, а также выработку растворимых молекул, таких как межклеточные молекулы адгезии (ИКАМ), матричные металлопротеины (ММЗ) и реактивные виды кислорода, отражающие клеточную аднезию, рефреймирование тканей, рефреймирование тканей. Хотя внутренние сосудистые особенности, такие как характеристики бляшки и сложность коронарной артерии были использованы для прогнозирования MACEs, некоторые исследования показали, что биомаркеры, связанные с механизмами травмы и ремонта, происходящих в коронарном эндотелии может быть очень полезным для ранней идентификации и прогноза сердечно-сосудистых событий у пациентов с CAD представлены коронарной ангиопластики^2,3,5.

Непрерывный интерес к пониманию механизмов, лежащих в основе травмы САПР и ремонта побудило исследователей изучить внутрикоронарные циркулирующие биомаркеры, потому что коронарная выборка более тесно отражает повреждения сосудов и ремонт⁶. Однако характеристики коронарных биомаркеров в исследованиях человека были скудными^7,8,9. Таким образом, цель настоящего исследования состояла в том, чтобы описать метод определения количества коронарных циркулирующих ПДК и растворимых молекул, отражающих как сосудистые травмы, так и ремонт, и показать, связаны ли эти биомаркеры с MACEs и клиническим прогнозом пациентов САПР, которые прошли коронарную ангиопластику. Этот метод основан на использовании связанных с сосудистой, циркулирующих ПЧК и растворимых молекул, полученных путем отбора проб, наиболее близких к повреждению сосуда. Он также может быть полезен для клинических исследований для ишемии нижних конечностей, инсульт, васкулит, венозный тромбоз, и другие травмы, связанные с сосудистой травмы и ремонта.

протокол

Этот протокол отвечает институциональным руководящим принципам Комитета по этике исследований человека.

1. Коронарная ангиография, УЗИ и анализ крови

1. Запросить базовую клиническую и демографическую информацию до коронарного вмешательства. Сбор данных человека: возраст, пол, текущее состояние курения, индекс массы тела (ИМТ), высокое кровяное давление, дислипидемия, сахарный диабет, лекарства, и указание на текущую коронарную ангиографию.
2. Выполняйте коронарную ангиографию с помощью катетеризации сердца с использованием радиального подхода. Эта процедура должна проводиться в рамках флюороскопии руководства в гемодинамике комнате экспертами-кардиологами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определите бесценные сосуды. Для настоящего исследования, evaluable сосуды были определены как артерии с секциями больше, чем 1,5 мм и стеноз промена более 50%.
3. Продвигай внутрисосудистый ультразвуковой катетер в интересуемый регион и записывай изображения. Используйте соответствующее программное обеспечение для определения местонахождения и измерения наименьшей области светящегося.
4. Используйте коронарный катетер для сбора 10 мл крови из ближайшего к налету.
5. После выписки пациента, график периодических медицинских оценок для последующей исследования конечных точек. Если телефонный контакт невозможен или визит врача задерживается более чем на 2 месяца, попросите уполномоченное лицо (ранее разработанное) проверить конечные точки исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим любой из следующих MACE: 1) сердечно-сосудистой смерти, 2) новый инфаркт миокарда, 3) нестабильный стенокардия, побуждающие незапланированный медицинский визит в течение 24 ч, 4) стентреста, как показано на коронарной ангиографии, 5) эпизоды декомпенсированной сердечная недостаточность, требующая клинического внимания.

2. Определение циркулирующих ПДК(рисунок 2)

1. Обработка крови в течение 1 ч из коллекции. Передача 6 мл собранной крови в коническую трубку 15 мл и разбавить 1:1 (v/v) с 1x фосфатбуферным сольником (PBS), рН 7,4.
2. Добавьте 2 мл градиента плотности среднего до трех пробирков. Тщательно перенесите три аликота разбавленной крови в каждую пробирку, содержащую среду градиента плотности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем градиентной плотности средней и разбавленной крови не должен превышать трех четвертей максимальной емкости пробирки.
3. Центрифуга на 1800 х г,4 кв кв 30 мин. Перенесите полосу на интерфейсе между слоями в новую трубку. Добавьте 2 мл PBS и центрифугу при 1800 х г,4 кв. м в течение 6 мин. Гранулы будут содержать MPCs.
4. Вымойте гранулы несколько раз. Присвоить предыдущее решение и аккуратно resuspend клеточной гранулы в свежем PBS. Для последующих смылок, центрифуга на 1800 х г, 4 кв кв 2 мин. Повторите процесс 6x.
5. Приостановите действие клеточной гранулы в 1 мл PBS. Смешайте 20 qL клеточной подвески с 0,4% трипан синий, разбавленный 1:1 (v/v). Нанесите каплю на гемоцитометр и посчитайте неокрашенные клетки под легким микроскопом.
6. Приступить к определению ПДК. Этикетка 5 мл потока цитометрии труб и aliquot из 1 х 10⁶ ячеек на трубку. Подготовьте соответствующие изотипные контрольные антитела. Центрифуга при 1800 х г,4 кв кв 6 мин и отбросить супернатант.
7. Добавьте первичные антитела, разбавленные в 100 л инкубационного раствора антител, состоящего из 1x PBS (pH 7.4), 2 ММ этиленденадиаминететраацетической кислоты (ЭДТА), и 0,05% альбумина сыворотки крупного рогатого скота (BSA). Отдохните на 10 с и инкубировать в течение 20 минут при 4 градусах По Цельсию, с защитой от света. Протокол может быть приостановлен на этом этапе путем фиксации лимфоцитов в 4% параформальдегида в PBS и хранения образцов до 24 ч при 4 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации первичных антител, используемых в настоящем протоколе, были CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
8. Центрифуга при 1800 х г,4 кв кв 2 мин и отбросить супернатант. Повторное в 500 л 1x PBS (pH 7.4), 2 mM EDTA.
9. Выполните анализ цитометрии потока. Используйте изотипные контрольные антитела для настройки фонового окрашивания. Затем выберите лимфоциты, распространяющиеся на участке FSC/SSC, пытаясь исключить остаточные гранулоциты, клеточный мусор и другие частицы, которые обычно расположены в нижней, левой распределенной на участке. Такое распределение считается 100%.
10. Используйте ворота, содержащие большое количество клеток с общим иммунофенотипом CD45 и CD34. Для двойных положительных иммунофенотипов, используйтеворота, ранее идентифицирующие CD45 , CD34, с добавлением либо KDR (VEGFR-2), CD133 , или CD184. Определите субпопуляции MPC по их конкретным маркерам поверхности клеток. Отчет как процент закрытых событий.
11. Определить основные субпопуляции ПДК. В настоящем исследовании основными иммунофенотипами были CD45^cd34cd34, CD45^-CD34^-CD184^,CD45^-CD34 , CD134 , CD134
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые маркеры поверхности клеток были CD45 (лимфоциты), CD34 (эндотелиальные и/или сосудистые клетки), KDR (VEGFR-2, мембранный маркер эндотелиальных клеток), CD133 (эндотелиальные клетки-протеиторы) и CD184 (гематопоитические стволовые клетки и эндотелиальные клетки).

3. Определение плазменных растворимых биомаркеров

1. Используйте фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) для определения концентрации SICAM-1 и MMP-9(рисунок 3,верхний ряд).
   1. Centrifuge образцы крови на 3000 х г,комнатная температура в течение 5 мин и собирать плазму.
   2. Пометьте стандарты, пробные трубки и контрольные трубки. Уравновесите предварительно покрытые колодцы в панели анализа, промыв 2x с стиральным буфером, предусмотренным в комплекте ELISA.
   3. Перенесите стандарты, образцы и элементы управления в скважины. Печать и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 90 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте скважины высохнуть полностью.
   4. Откажитесь от содержимого и добавьте антитела для обнаружения биотина. Печать и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 60 мин.
   5. Отбросьте содержимое и вымойте 3x. Печать доска и инкубировать последовательно с стрептавидин рабочий раствор следуют тетраметилбензидин субстрата при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, светозащищенный. Вымойте 3x между инкубациями. Когда цвет развивается, добавьте стоп-решение и прочтите абсорбцию оптической плотности в микроплите ELISA reader.
2. Используйте иммуномагнитный мультиплексный анализ для определения концентрации фактора некроза опухоли альфа (ТНФЗ) и интерлейкина 1 бета(IL-1)(рисунок 3, нижняя строка).
   1. Пометьте стандарты, пробные трубки и контрольные трубки.
   2. Вортекс магнитных бисерных флаконов на 30 с. Перенесите подвеску бисера в соответствующие по размеру трубки, а затем в колодцы в мультиплексирующей пластине. Периодический вихрь позволяет избежать осадков из бисера.
   3. Надежно вставьте ручную магнитную пластину шайбы. Подождите 2 минуты для шариков, чтобы накопить на дне каждого колодца и быстро инвертировать как ручной магнитной пластины шайбу и пластины сборки, над раковиной или отходов контейнера. Не забудьте использовать ручную магнитную пластину шайбу для поддержания бисера внутри колодцев.
   4. Добавьте 150 л буфера для мытья в каждую скважину и подождите 30 с, чтобы бусы накапливались на дне. Отбросьте содержимое в шаг3.2.3. Затем добавьте 25 юл универсального буфера асссе (предоставленного в комплекте), за которым последуют 25 юл подготовленных стандартов, образцов и элементов управления.
   5. Печать пластины и инкубировать в течение не менее 60 минут при комнатной температуре, светозащищенные, с постоянной тряски при 500 об/мин. Кроме того, инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия, светозащищенный, с постоянной тряской при 500 об/мин, если это возможно.
   6. Вымойте 2x, добавив 150 л буфера стирки и подождите 30 с. Отбросьте содержимое, вставив ручную магнитную шайбу пластины. Подождите 2 минуты и инвертировать над раковиной или контейнером отходов.
   7. Инкубировать последовательно с 25 л обнаружения антитела смеси следуют 25 ЗЛ стрептавидина-PE растворпри температуре 30 мин, герметичной и светозащищенной, с постоянной тряски при 500 об/мин. Вымойте 2x между инкубациями, как описано в шаге 3.2.6.
   8. Получить показания. Добавьте 120 зл и считывающий буфер. Печать пластины и инкубировать 5 мин при комнатной температуре, светозащищенный, с постоянной тряской при 500 об/мин. Выполнить чтение на мультиплексирования считыватель. Отрегулируйте параметры чтения в соответствии с каждым из них.

Результаты

Коронарная, венозная синусовая и периферическая кровь были собраны у 52 пациентов, перенесших коронарную ангиографию(рисунок 1)и показали высокую распространенность гипертонии и дислипидемии. При клиническом последующем последующем исследовании 11 (21,...

Обсуждение

Сбор крови из пораженной коронарной артерии может быть затруднен. Иногда коронарная артерия едва доступна. В этом случае, выборка из венозной синуса может быть альтернативой. Мы провели проверку, сравнивая циркулирующие биомаркеры в коронарной артерии против венозной синусовой синус?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm