Использование аналога пиримидина, 5-йод-2'-дезоксиуридина (IdU) с маркерами клеточного цикла для установления фаз клеточного цикла на платформе массовой цитометрии

Резюме

Этот протокол адаптирует измерения клеточного цикла для использования в платформе массовой цитометрии. Благодаря многопараметрическим возможностям массовой цитометрии прямое измерение включения йода позволяет идентифицировать клетки в S-фазе, в то время как маркеры внутриклеточного цикла позволяют характеризовать состояние каждого клеточного цикла в различных экспериментальных условиях.

Аннотация

Регуляция фазы клеточного цикла является важным аспектом клеточной пролиферации и гомеостаза. Нарушение регуляторных механизмов, регулирующих клеточный цикл, является особенностью целого ряда заболеваний, в том числе онкологических. Изучение клеточного цикла требует способности определять количество клеток в каждой части прогрессии клеточного цикла, а также четко разграничивать каждую фазу клеточного цикла. Появление массовой цитометрии (MCM) обеспечивает огромный потенциал для высокопроизводительного анализа отдельных клеток посредством прямых измерений элементарных изотопов, а разработка метода измерения состояния клеточного цикла с помощью MCM еще больше расширяет полезность MCM. Здесь мы описываем метод, который непосредственно измеряет 5-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU), аналогичный 5-бром-2'-дезоксиуридину (BrdU), в системе MCM. Использование этого MCM на основе IdU дает несколько преимуществ. Во-первых, IdU быстро включается в ДНК во время ее синтеза, что позволяет надежно измерять клетки в S-фазе с инкубацией всего за 10-15 минут. Во-вторых, IdU измеряется без необходимости вторичных антител или необходимости деградации ДНК. В-третьих, окрашивание IdU можно легко комбинировать с измерением циклина B1, фосфорилированного белка ретинобластомы (pRb) и фосфорилированного гистона H3 (pHH3), что в совокупности обеспечивает четкое разграничение пяти фаз клеточного цикла. Комбинация этих маркеров клеточного цикла с большим количеством параметров, возможных с MCM, позволяет комбинировать их со многими другими показателями.

Введение

Масс-цитометрия позволяет обнаруживать около 40 параметров, используя преимущества высокого разрешения и количественного характера масс-спектроскопии. Антитела, меченные металлами, используются вместо флуорофорных конъюгированных антител, которые допускают большее количество каналов и производят минимальный побочный эффект ^1,2. MCM имеет преимущества и недостатки в отношении анализа клеточного цикла по сравнению с проточной цитометрией. Одним из основных преимуществ MCM является то, что большое количество параметров позволяет одновременно измерять состояние клеточного цикла в большом количестве иммунофенотипически различных типов Т-клеток в очень гетерогенных образцах. MCM успешно используется для измерения состояния клеточного цикла при нормальном кроветворении в костном мозге^{человека 3} и трансгенных мышиных моделях дефицита теломеразы⁴. Анализ состояния клеточного цикла при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) показал, что клеточный цикл коррелирует с известными реакциями на клиническую терапию, обеспечивая понимание in vivo функциональных характеристик, которые могут информировать о выборе терапии⁵. Вторым преимуществом массового цитометрического анализа клеточного цикла является возможность измерения большого количества других функциональных маркеров, которые могут быть коррелированы с состоянием клеточного цикла. Недавняя работа смогла коррелировать синтез белка и РНК с состоянием клеточного цикла с помощью IdU и меченных металлами антител к BRU и рРНК⁶. Такой высокопараметрический анализ, измеряющий состояние клеточного цикла в многочисленных популяциях в континууме дифференцировки, был бы практически невозможен с современной технологией проточной цитометрии. Основным недостатком MCM является отсутствие сопоставимых красителей ДНК или РНК, используемых во флуоресцентной проточной цитометрии (например, DAPI, Hoechst, Pyronin Y и т. Д.). Флуоресцентные красители могут давать относительно точные измерения содержания ДНК и РНК, но эта точность возможна только благодаря изменениям флуоресцентных свойств этих красителей, которые происходят при интеркаляции между нуклеотидными основаниями. Таким образом, анализ MCM не может измерить содержание ДНК или РНК с аналогичной точностью. Вместо этого массовый цитометрический анализ клеточного цикла основан на измерениях белков, связанных с состоянием клеточного цикла, таких как циклин B1, фосфорилированный белок ретинобластомы (pRb) и фосфорилированный гистон H3 (pHH3) в сочетании с прямым измерением атома йода от включения IdU в клетки S-фазы. Эти два подхода к измерению дают очень похожие результаты во время нормальной клеточной пролиферации, но потенциально могут быть диссонирующими, когда прогрессирование клеточного цикла нарушается.

Измерение количества клеток в каждой фазе клеточного цикла важно для понимания нормального развития клеточного цикла, а также нарушения клеточного цикла, которое обычно наблюдается при раке и иммунологических заболеваниях. MCM обеспечивает надежное измерение внеклеточных и внутриклеточных факторов с использованием метенных металлом антител; однако измерение S-фазы было ограничено, поскольку интеркалятор ДНК на основе иридия не мог различать 2N и 4N ДНК. Чтобы определить фазы клеточного цикла, Бехбехани разработал метод, в котором используется IdU с массой 127, который попадает в диапазон массового цитометра и позволяет напрямую измерять клетки в S-фазе³. Это прямое измерение обходит необходимость во вторичных антителах или использовании денатурирующих ДНК агентов, таких как кислота или ДНКаза. В сочетании с маркерами внутриклеточного цикла он обеспечивает высокое разрешение распределения клеточного цикла в экспериментальных моделях.

Этот протокол адаптирует измерения клеточного цикла из общих протоколов проточной цитометрии для MCM. Наши методы обеспечивают удобный и простой способ включения параметров клеточного цикла. Для включения образцов IdU in vitro требуется всего от 10 до 15 минут инкубации при 37 ° C, что короче, чем у большинства протоколов окрашивания BrdU, которые рекомендуют время инкубации в несколько часов ^3,7. Образцы, включенные в IdU и BrdU, могут быть зафиксированы с помощью протеомного стабилизатора, а затем храниться в течение некоторого времени в морозильной камере с температурой -80 °C. Это позволяет архивировать большое количество образцов, окрашенных IdU, для пакетного анализа без снижения качества образцов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка запасов IdU

1. Растворить 5-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU) в ДМСО до концентрации 50 мМ. Стерильный фильтр аликвотировать в пробирки по 10-50 мкл и хранить при температуре -80 °C
2. Достаньте IdU из морозильной камеры и разморозьте при комнатной температуре. Разбавьте IdU в RPMI-1640, чтобы получить рабочий раствор при конечной концентрации 1 мМ. Пипеткой вверх и вниз или вихревым для перемешивания.
   1. Как правило, разводят концентрированный IdU в среде, в которой культивируются клетки (например, DMEM, IMDM и т. д.), или разбавляют его в PBS для добавления непосредственно к образцам аспирата периферической крови или костного мозга. Эта стадия предварительного разбавления облегчает смешивание ДМСО с водными средами интересующих клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация IdU во время инкубации должна составлять 10 мкМ; раствор 1 мМ можно добавить в соотношении 10 мкл на каждый 1 мл среды.

2. Инкубация IdU и сохранение образцов

1. Храните образцы в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C. Извлеките образец из инкубатора и переместите образец в колпак биобезопасности.
2. Добавьте 10 мкл 1 мМ IdU на каждый 1 мл образца.
   1. Для 6-луночного планшета добавьте 30 мкл 1 мМ IdU к 3 мл питательных сред в каждой лунке. IdU также можно использовать непосредственно в аспиратах костного мозга, а также в исследованиях на мышах⁴.
3. Поместите образец обратно в инкубатор при температуре 37 °C на 10-15 минут. Поддерживайте клетки в оптимальных условиях роста, представляющих интерес во время воздействия IdU, чтобы получить наиболее точное измерение S-фазы.
4. После инкубации IdU извлеките образец и переложите в коническую пробирку.
5. Отжимайте образец при 400 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
6. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют в 200 мкл PBS.
   1. При необходимости выполните живое/мертвое окрашивание (с использованием цисплатина) на этом этапе, чтобы пометить мертвые клетки перед фиксацией и замораживанием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание живого/мертвого родия плохо работает после пермеабилизации метанолом, поэтому его не рекомендуется использовать в анализе клеточного цикла.
7. Добавьте 18,75 мкл 16% параформальдегида (ПФА) в PBS для получения конечной концентрации 1,5% PFA. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин. Отжимайте образец при 400 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
8. Аспирируйте раствор PBS/PFA и повторно суспендируйте образец в 500 мкл среды для окрашивания клеток (CSM; 1x PBS с 0,5% BSA и 0,02% азида натрия) + 10% ДМСО перед замораживанием.
   1. При использовании коммерческого протеомного стабилизатора добавьте 280 мкл протеомного стабилизатора в образец, повторно взвешенный в 200 мкл PBS (1:1,4). Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем поместите непосредственно в -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было показано, что IdU эффективно включается в течение 10-15 минут инкубации при 37 ° C. Инкубация IdU продолжительностью более 10-15 минут будет постепенно снижать разрешение популяций S и G2-фазы, поскольку меченные IdU клетки покидают S-фазу и переходят в фазу G2 или M. Мы также заметили, что длительная инкубация с IdU может вызвать гибель клеток и артефакты клеточного цикла. Последующая клеточная обработка и окрашивание антител после включения IdU достаточны для вымывания остаточного IdU, который не был включен в клетки S-фазы. Мы не наблюдали значительного йодного фона при использовании протокола in vitro, описанного здесь; Однако мы очень редко наблюдали загрязнение йодом в клинических образцах. Это может произойти из-за медицинских процедур, таких как контрастирование йода при компьютерной томографии, или из-за йодсодержащих фармацевтических препаратов. Если наблюдается большое количество фона IdU, образец не следует запускать, чтобы избежать повреждения детектора масс-цитометра.

3. Окрашивание образцов для массовой цитометрии

1. Снимите образцы с -80 °C и дайте им оттаять перед окрашиванием поверхности.
   1. При использовании метода фиксации SmartTube размораживайте образцы при 0-4 °C, чтобы избежать дополнительной фиксации по мере нагревания образцов.
2. После того, как образцы будут разморожены, перенесите примерно 1-2 миллиона клеток в пробирку FACS объемом 5 мл.
3. Центрифугируйте пробирку FACS при 600 x g в течение 5 мин и заполните пробирку FACS средой для окрашивания клеток (CSM) для промывки клеток. Повторите еще один раз.
   1. Если известно, что клетки слипаются, добавьте 400 ЕД / мл гепарина в промывки CSM, чтобы предотвратить контакт клеток с клетками, но это не является строго необходимым.
4. Инкубируют клетки с FC-блокатором, 5 мкл агента на 100 мкл клеток, в течение 10 мин при комнатной температуре.
5. Приготовьте смесь антител, которые окрасят поверхность или внеклеточную часть клеток. Общая окрашивающая смесь составит 100 мкл на 1-2 миллиона клеток в каждом тесте. Красящая смесь будет уравновешена соответственно CSM и гепарином в коктейле и пробирке FACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление CSM на этом этапе также уменьшит количество неспецифических артефактов окрашивания⁸. Эта окрашивающая смесь полностью зависит от интересующих мишеней и поверхностного фенотипа (например, в исследовании с участием Т-клеток будет использоваться поверхностная смесь CD45, CD3, CD4, CD8 и т. д.). Подробный протокол обработки и окрашивания образцов можно найти в Behbehani and McCarthy et ^al.9,10.
6. Добавьте в клетки смесь для окрашивания поверхности и выдержите при комнатной температуре при непрерывном встряхивании в течение 30-60 мин.
7. После окрашивания заполните пробирку FACS CSM и открутите при 600 x g в течение 5 мин.
8. Промойте еще два раза с помощью CSM, вращая образец при 600 x g в течение 5 минут и аспирируя каждую стирку CSM.
9. Зафиксируйте внеклеточные антитела, добавив 1 мл PBS с 10% CSM и 1,5% PFA.
10. Заполните пробирку FACS, содержащую смесь PBS/CSM/PFA, CSM. Отжимайте при 600 x g в течение 5 минут и аспирируйте надосадочную жидкость.
11. Добавьте метанол при -20 °C.
12. Встряхните образец в течение 1-2 минут, чтобы получить суспензию одной клетки, и убедитесь, что все клеточные скопления были повторно суспендированы.
13. Пока образец медленно вращается, быстро добавьте 1 мл ледяного метанола с помощью пипетки объемом 1000 мкл с наконечником фильтра.
14. Поднесите трубку FAC к свету и убедитесь, что на ней нет видимых комков; Следует ожидать облачности. Любые скопления сделают образец непригодным для последующего анализа MCM.
15. Храните образец при температуре -20 °C в течение 10-20 минут.
16. За это время приготовьте внутриклеточную окрашивающую смесь. Внутриклеточная окрашивающая смесь будет зависеть от интересующих целей. Для анализа клеточного цикла включите в эту окрашивающую смесь CyclinB1, pRb, Ki67 и pHH3, но при необходимости можно добавить и другие внутриклеточные маркеры.
17. Через 10-20 мин при -20 °C извлеките образец, добавьте 1,5 мл PBS и заполните остаток CSM.
18. Центрифугируйте образец 600 x g в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
19. Промойте еще два раза CSM, отжимая образец при 600 x g в течение 5 минут и каждый раз аспирируя надосадочную жидкость.
20. После последней промывки CSM центрифугируйте образец и оставьте остаточный объем примерно 50 мкл.
21. Добавляют приготовленную смесь антител (обычно добавляют 50 мкл коктейля для окрашивания антител для достижения конечного объема окрашивания 100 мкл) к образцу и инкубируют на встряхивающей платформе в течение 30-60 минут при комнатной температуре.
22. После окрашивания добавляют CSM и центрифугу при 600 x g в течение 5 мин.
23. Аспирируйте CSM, снова промойте CSM, вращая при 600 x g в течение 5 минут, аспирируя CSM, затем добавьте PBS.
24. После завершения внутриклеточного окрашивания поместите клетки в интеркаляторный раствор, который фиксирует антитела к клеткам и окрашивает ДНК каждой клетки, чтобы обеспечить идентификацию. Интеркаляторный раствор содержит неизотопно чистый иридиевый интеркалятор (пентаметилциклопентадиенил-Ir(III)-дипиридофеназин), добавленный из исходного раствора производителя в концентрации 500 мкМ. Разбавьте иридиевый запас 1:4000 в растворе PBS и 1,5% PFA. Добавьте раствор иридиевого интеркалатора в концентрации 100-200 мкл на миллион клеток, чтобы равномерно окрасить и предотвратить переокрашивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иридий в этом растворе интеркалатора предназначен для идентификации клеток для синглетного стробирования, его не следует использовать для живых/мертвых пятен. Если желательны живые/мертвые пятна, их необходимо выполнить перед фиксацией, как отмечено выше и в McCarthy et ^al.9.
25. Храните образцы в растворе интеркалятора в холодильнике при температуре 4 °C до двух недель до получения образца на CyTOF.

4. Работа масс-цитометра

ПРИМЕЧАНИЕ: Операция массовой цитометрии может быть специфической для машины. Перед началом работы всегда рекомендуется ознакомиться с руководством пользователя CyTOF. Кроме того, в настоящее время есть две статьи JoVE, посвященные запуску и техническому обслуживанию машин ^9,11.

1. Перед работой масс-цитометра проверьте небулайзер на наличие засоров, трещин и других неровностей.
2. Подключите небулайзер к цитометру и начните процедуру прогревания. Не запускайте массовый цитометр без установленного небулайзера.
3. Пропустите воду через линии отбора проб, как только масс-цитометр закончит прогрев. Перед настройкой или анализом образца температура в распылительной камере должна нагреться примерно до 200 °C.
4. Пропустите воду на 5-10 мин. Через 5-10 минут загрузите решение для настройки и выберите менеджер настройки. Настроечное решение представляет собой раствор, содержащий фиксированные концентрации металлов и используемый для оптимизации массы цитометра перед взятием образца
5. В диспетчере настройки выберите Предварительный просмотр после того, как решение настройки достигнет записи попадания в устойчивое состояние, чтобы начать процесс автоматической настройки.
6. После завершения настройки загрузите пробоотборник водой и дайте воде пройти через пробоотборные линии во время обработки пробы. Подробный протокол ежедневной работы и настройки цитометра можно найти по адресу Leipold¹¹.
7. Иногда автоматическая настройка не настраивается на оптимальную производительность машины. Повторите процедуру настройки, чтобы исправить это.
8. Перед взятием образца промойте образец CSM один раз и чистой деионизированной водой дважды. Промывание водой важно для удаления остатков соли из PBS/CSM.
9. Проверьте чувствительность и расход образца с помощью поставляемых производителем уравновешивающих шариков, полистирольных шариков, загруженных известными концентрациями металлов.
10. Измените режим сбора данных с настройки на режим захвата событий. Установите ограничение по времени остановки сбора данных на уровне 120 с. Подождите 45 секунд, прежде чем выбрать «Запись».
11. Масс-цитометр автоматически остановит сбор образца через 120 секунд. Используйте средство просмотра графика дождя, чтобы проверить интенсивность Eu151 и Eu153.
12. Разбавьте шарики равновесия в чистой деионизированной воде в соотношении 1:20.
13. Перед взятием образца проверьте диспетчера эксперимента. Используйте диспетчер экспериментов, чтобы назначать имена каналам и добавлять каналы для записи.
    1. Убедитесь, что 127-й канал добавлен при использовании IdU.
    2. Обратите внимание, что перед взятием образца важно настроить масс-цитометр для измерения необходимых параметров (например, IdU). Если каналы не выбраны заранее, данные не будут собираться ни с одного невыбранного канала и не могут быть восстановлены.
14. Разбавьте клетки до концентрации примерно 1-2 x 10⁶ / мл, используя чистую деионизированную воду 1:20 и смесь уравновешивающих шариков. Пропустите ячейки через трубку FACS с фильтром, чтобы удалить остатки комков.
15. Загрузите образец и измените время сбора.
16. Нажмите кнопку «Просмотр» и дождитесь стабилизации количества событий в секунду.
    1. Не запускайте события, превышающие 400 событий в секунду, это приведет к значительному количеству дублетов и мусора. Обычно мы собираем от 20 000 до 50 000 клеточных событий, но оптимальное количество будет зависеть от дизайна эксперимента. Окрашивание до 2 миллионов клеток обычно дает от 300 000 до 400 000 клеточных событий. Обратите внимание, что не все события будут ячейками (в подсчет событий будут включены события мусора и бусин).
17. После того, как отбор проб завершен, загрузите моющий раствор, начните индукцию образца и работайте в течение 5-10 минут. Через 5-10 минут прекратите индукцию образца и запустите воду на 10-20 минут. Промывочный раствор представляет собой слабый раствор плавиковой кислоты, предназначенный для удаления остатков металла из линий отбора проб.
18. Выключите масс-цитометр и извлеките небулайзер. Небулайзер будет горячим, будьте осторожны во время обращения.

5. Анализ данных

1. Чтобы удалить шарики, а также исправить дрейф сигнала во время сбора образцов, нормализуйте файлы FCS с помощью программного обеспечения Fluidigm или приложения, разработанного Finck¹².
2. Загрузите FCS в Cytobank или другое программное обеспечение для анализа проточной цитометрии. Файлы FCS могут использоваться в любом совместимом программном обеспечении, для целей этого протокола все стробирование и дальнейший анализ были выполнены в Cytobank¹³.
3. Прежде чем можно будет нарисовать ворота клеточного цикла, исключите любые дублеты или клеточный мусор из последующего анализа, это можно сделать с помощью двухосного графика зависимости длины события от 191-Ir (рис. 1a). Клетки будут формировать отчетливую, яркую популяцию^{Ir high} , которая может быть использована для исключения дублетов и мусора. Это синглетные ворота. Этот метод стробирования обычно удаляет около 50-60% событий дублетных клеток, поэтому могут потребоваться дополнительные стратегии для удаления оставшихся событий дуплетных клеток.
   1. Измените шкалу длины события (минимальную и максимальную), чтобы клетки выглядели более заметными, чтобы помочь в синглетном стробировании.
   2. Далее удалите дублеты и мусор с помощью параметров Гаусса, остатка и смещения. Более высокий остаток с меньшим смещением также является мусором и дублетами, и стробирование вокруг этой популяции может дополнительно удалить дублеты и мусор (рис. 1b, c).
4. Стробирование S-фазы - S-фаза - самый простой затвор для рисования, но также и самый важный. Нарисуйте этот затвор, используя двухосный график IdU против pRb, Ki67 или cyclinB1. Клетки S-фазы IdU⁺ образуют отдельную популяцию при взгляде на эти двухосные графики (рис. 2b).
5. G0/G1-фаза, G2/M-фазовое стробирование – Установите фазовые затворы G0/G1 и G2/M на графике IdU vs CyclinB1, и использование включения IdU имеет решающее значение для установления границы между фазовыми затворами G0/G1 и G2/M. G0 / G1-фаза будет CyclinB1^низкой / IdU-, а G2 / M-фаза будет^{CyclinB1 высокой} / ^IdU-. Хорошее окрашивание CyclinB1 покажет естественную популяцию между популяциями G0-G1 и G2-M; Однако это будет варьироваться в зависимости от образца и типа клеток в экспериментальных условиях. В экспериментальных условиях, когда может быть нарушено распределение клеточного цикла и существует меньшее разделение между G0/G1-фазой CyclinB1 и G2/M-фазой, использование S-фазы позволит обеспечить последовательное стробирование для определенных типов клеток в каждом конкретном эксперименте. Этот метод подробно описан ниже.
   1. Нанесите на график только ячейки S-фазы на CyclinB1 и IdU, чтобы помочь установить разделение между G0 / G1-фазой и G2 / M-фазой. Нарисуйте ворота на^{высокой} популяции CyclinB1 и отрегулируйте их до тех пор, пока примерно 5% верхних 5% популяции S-фазы не окажутся внутри ворот (рис. 2c). При этом устанавливается точка разрыва между фазовыми затворами G0/G1 и G2/M (рис. 2, e,f). Активная популяция будет изменена на интересующую популяцию, и часть, находящаяся внутри предыдущих ворот, будет популяцией G2/M-фазы, а остальная часть будет популяцией G0/G1-фазы.
6. G0-фазное стробирование - Установите G0-фазу на графике pRb против IdU. Фаза G0 будет представлена^{популяцией pRb low/IdU}-. Активная циклическая популяция будет иметь высокую экспрессию включения pRb и IdU, на этой границе можно нарисовать G0-фазовый гейт, поскольку он обычно экспрессируется в двух различных популяциях (рис. 2g,i).
   1. Определите G0-фазу, сделав популяцию S-фазы, нарисованную ранее (рис. 2b), активной популяцией и нарисовав ворота, включающие верхние 90-100% населения^{с высоким} pRb. Это популяция велосипедистов pRb+ (рис. 2i),^низкая популяция pRb за пределами этих ворот — популяция G0 (рис. 2j).
   2. Если pRb недоступен или не может быть записан, используйте Ki67 против IdU для определения популяции G0-фазы. Нарисовав ворота, представляющие большую часть популяции S-фазы, и используя эти ворота в качестве границы для Ki67 и IdU, остальная часть популяции будет G0-фазой (рис. 3a).
7. Стробирование M-фазы - Установите M-фазу на двухосном графике IdU и pH3. М-фаза представляет собой очень маленькую часть клеток и ограничена популяцией^{с высоким} рН3 (рис. 2d).
8. Включение IdU не удалось или было невозможно - Если IdU недоступен, определите циклические и не циклические фракции клеток, используя Ki67 и pRb. Ki67 и pRb в нормальных условиях образуют две различные популяции: Ki67 с^{высоким} /^{высоким} pRb и Ki67^с низким / низким уровнем^pRb. Двойная положительная популяция представляет собой активную велосипедную популяцию, коррелирующую с G1-фазой, S-фазой, G2-фазой и М-фазой. Двойная низкая популяция представляет собой нециклическую популяцию, коррелирующую с G0-фазой (рис. 3b).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможно разграничить каждую отдельную фазу с использованием Ki67 против pRb, но экспериментальное воздействие на относительные циклические/нециклические популяции могут быть определены.
9. Анализ клеточного цикла - После того, как ворота установлены, экспортируйте числовые значения из ворот для дальнейшего анализа. Проценты в каждом цикле могут быть достигнуты путем вычитания отдельных популяций из объединенных популяций. G0-фаза, нарисованная на^{низком уровне} IdU pRb, процент затвора может быть вычтен из G0/G1-фазы, нарисованной на^{CyclinB1 с низкимотрицательным} IdU, чтобы найти процент G1-фазы. Точно так же процент фазы G2 получается из вычитания затвора М-фазы из затвора G2/M-фазы. Это приведет к получению числовых значений для каждой отдельной фазы клеточного цикла; G0, G1, S, G2 и M. Числовые значения, сгенерированные для каждой отдельной фазы клеточного цикла, могут быть использованы для дальнейшего анализа, такого как построение графиков и статистический анализ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя клетки HL-60 и аспират костного мозга человека, можно показать, как экспериментальные условия могут влиять на распределение и анализ клеточного цикла. Во-первых, необходимо разработать стратегию стробирования, чтобы продемонстрировать, как формируются фазы клеточного цикла.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представленные здесь примеры демонстрируют, как использовать платформу MCM для анализа распределения клеточного цикла. Также было продемонстрировано, что анализ клеточного цикла чувствителен к экспериментальным условиям, таким как время и температура, что является важным соображение...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059	Component of CSM
Centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420	Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	Identification of apoptotic cells
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer	Corning	08-771-23	Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	Cell culture growth supplement
Helios	Fluidigm		CyTOF System/Platform
Heparin	Sigma	H3393	Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine)	Sigma	I7125	Incorporates in S-phase
Ki-67	eBiosciences	SolA15	Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit	Fluidigm	201300	Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker	Thermo Scientific	88880023	Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	15710	Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine	Fluidigm	201192	Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	Detection of DNA damage
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Cell culture growth medium
Sodium Azide	Acros Organics	AC447810250	Component of CSM/Antibody buffer, biocide