Мышиная модель инфекции спинальных имплантатов in vivo

Резюме

Протокол описывает новую мышиную модель инфекции спинальных имплантатов in vivo, в которой имплантат из нержавеющей стали с проволокой инфицируется биолюминесцентным золотистым стафилококком Xen36. Бактериальная нагрузка контролируется в продольном направлении с помощью биолюминесцентной визуализации и подтверждается подсчетом колониеобразующих единиц после эвтаназии.

Аннотация

Инфекции спинальных имплантатов предвещают неблагоприятные исходы, поскольку диагностика затруднена, а хирургическая эрадикация противоречит механической стабильности позвоночника. Целью этого метода является описание новой мышиной модели инфекции спинальных имплантатов (SII), которая была создана для предоставления недорогого, быстрого и точного инструмента in vivo для тестирования потенциальных терапевтических средств и стратегий лечения инфекций спинальных имплантатов.

В этом методе мы представляем модель хирургии позвоночника с задним доступом, при которой проволока из нержавеющей стали закрепляется в остистый отросток L4 12-недельных мышей дикого типа C57BL/6J и инокулируется 1 x^10,3 КОЕ биолюминесцентного штамма бактерий Staphylococcus aureus Xen36. Затем мышей проводят продольную визуализацию для биолюминесценции in vivo на послеоперационные дни 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 и 35. Сигналы биолюминесцентной визуализации (BLI) из стандартизированного поля зрения количественно оцениваются для измерения бактериальной нагрузки in vivo.

Для количественного определения бактерий, прилипающих к имплантатам и околоимплантным тканям, мышей усыпляют, а имплантат и окружающие мягкие ткани собирают. Бактерии отделяются от имплантата с помощью ультразвука, культивируются в течение ночи, а затем подсчитываются колониеобразующие единицы (КОЕ). Результаты, полученные с помощью этого метода, включают продольный подсчет бактерий, измеренный с помощью биолюминесценции in vivo S. aureus (средний максимальный поток) и подсчет КОЕ после эвтаназии.

В то время как предыдущие модели инструментальной инфекции позвоночника на животных включали инвазивный анализ тканей ex vivo, мышиная модель SII, представленная в этой статье, использует неинвазивную оптическую визуализацию биолюминесцентных бактерий in vivo в реальном времени для замены статического исследования тканей. Область применения модели широка и может включать в себя использование альтернативных биолюминесцентных штаммов бактерий, включение других типов генетически модифицированных мышей для одновременного изучения иммунного ответа хозяина, а также оценку существующих или изучение новых диагностических и терапевтических методов, таких как антибиотики или покрытия имплантатов.

Введение

Целью данного метода является описание новой мышиной модели инфекции спинальных имплантатов (SII). Эта модель была разработана, чтобы предоставить недорогой и точный инструмент для гибкой оценки влияния переменных хозяина, патогена и/или имплантата in vivo. Тестирование потенциальных терапевтических средств и стратегий лечения инфекций спинномозговых имплантатов в этой модели направлено на руководство развитием исследований перед их применением на более крупных животных моделях и клинических испытаниях.

Инфекция, связанная с имплантатами, после операции на позвоночнике является разрушительным осложнением и, к сожалению, встречается примерно у 3–8% пациентов, перенесших плановую операцию на позвоночнике 1,2,3,4,5, и у 65% пациентов^, перенесших многоуровневую или ревизионную операцию⁶. Лечение инфекций спинномозговых имплантатов часто требует многократных госпитализаций, множественных операций и длительной антибиотикотерапии. СИИ предвещают неблагоприятные исходы для пациентов, включая неврологические нарушения, инвалидность и повышенный риск смертности. Лечение ИИМ является чрезвычайно дорогостоящим и обходится более чем в 900 000 долларов США на одного пациента⁷.

Золотистый стафилококк является наиболее распространенным вирулентным возбудителем SII 8,9,10,11. Бактерии могут проникать в аппаратное обеспечение непосредственно во время операции, через рану в послеоперационном периоде или позже путем гематогенного распространения. При наличии металлических имплантатов золотистый стафилокк образует биопленку, которая защищает бактерии от антибиотикотерапии и иммунные клетки. Несмотря на то, что удаление инфицированного аппаратного обеспечения может помочь эффективно искоренить инфекцию, это часто неосуществимо в позвоночнике, не вызывая дестабилизации и риска неврологических нарушений¹².

При отсутствии эксплейтации зараженного оборудования необходимы новые подходы к профилактике, выявлению и лечению ИИИ. Исторически сложилось так, что существовало ограниченное количество моделей SII на животных для эффективной оценки безопасности и эффективности новых методов лечения. Предыдущие модели SII на животных требовали большого количества животных и сбора данных, требующих эвтаназии, включая подсчет колоний, гистологию и культивирование^13,14,15. Из-за отсутствия продольного мониторинга in vivo эти модели предоставляют только одну точку данных для каждого животного и, следовательно, являются дорогостоящими и неэффективными.

Предыдущая работа по изучению мышиной модели инфекции эндопротезирования коленного сустава установила ценность и точность неинвазивной оптической визуализации in vivo для лонгитюдного мониторинга бремени инфекции¹⁶. Обнаружение биолюминесценции позволяет гуманно, точно и эффективно количественно определять бактериальную нагрузку в течение длительного периода времени у одного животного. Более того, предыдущие исследования продемонстрировали высокую корреляцию между биолюминесценцией in vivo и КОЕ, адгезивными к имплантатам¹⁷. Способность отслеживать инфекцию с течением времени привела к более тонкому пониманию инфекций, связанных с имплантатами. Кроме того, мониторинг лонгитюдной инфекции таким образом позволил точно оценить эффективность антибиотикотерапии и новых противомикробных препаратов^16,17,18.

Используя эти инструменты, мы разработали и валидировали модель послеоперационной инфекции спинальных имплантатов. В представленном методе мы используем посевной материал биолюминесцентного S. aureus Xen36 для создания мышиной модели SII in vivo для лонгитюдного мониторинга бактериальной нагрузки^16,17,18. Эта новая модель представляет собой ценный инструмент для эффективного тестирования потенциальных стратегий обнаружения, профилактики и лечения SII перед их применением на более крупных животных моделях и клинических испытаниях.

протокол

Со всеми животными обращались в строгом соответствии с надлежащей ветеринарной практикой, как это определено в федеральных правилах, изложенных в Законе о благополучии животных (AWA), Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных 1996 года, Политике PHS по гуманному уходу и использованию лабораторных животных, а также в политике и процедурах учреждения, изложенных в Учебном руководстве по уходу за животными и их использованию. и все работы на животных были одобрены Комитетом по исследованиям на животных (ARC) канцлера Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.

1. Выбор биолюминесцентного штамма S. aureus

1. В качестве инокулята используют биолюминесцентный штамм S. aureus Xen36.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот штамм был получен из родительского штамма S. aureus ATCC-49525, который является клиническим изолятом пациента с сепсисом. Золотистый стафилококк Xen36 уникальным образом использует оперон ABCDE lux, который оптимизирован и интегрирован в нативную плазмиду хозяина. ¹⁹ В результате штамм Xen36 способен производить сине-зеленый биолюминесцентный свет с пиковой длиной волны излучения 490 нм. Этот эмиссионный сигнал производится только живыми метаболически активными бактериальными организмами.

2. Подготовка С. золотистый стафилоккаус для инокуляции

1. Добавьте 200 мкг/мл канамицина в бульон Лурии плюс 1,5% агар, чтобы изолировать S. aureus Xen36 от потенциальных загрязнителей, используя ген резистентности к канамицину, связанный с опероном lux ¹⁹.
2. Бактерии S. aureus Xen36 выложить на пластины триптического соевого агара (триптический соевый бульон [TSB] плюс 1,5% агара) и инкубировать при 37 °C в течение 12-16 ч.
3. Изолируют одиночные колонии S. aureus Xen36 и индивидуально культивируют в TSB в течение 12-16 ч при 37 °C во встряхивающем инкубаторе (200 об/мин).
4. Разбавьте полученную культуру в соотношении 1:50.
5. Культивирование в течение дополнительных 2 ч при 37 °C для выделения бактерий средней логарифмической фазы.
6. Гранулирование, ресуспендирование и промывка бактерий в фосфатно-солевом буфере (PBS) три раза.
7. Измерьте абсорбцию при длине волны 600 нм. Идеальный OD600 составляет от 0,700 до 0,750, что соответствует 4x10⁵ КОЕ/мл. Выполняйте последовательные разведения для получения желаемого бактериального посева (1 x 10,³ КОЕ/2 мкл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установлено, что оптимальная концентрация Xen36 для установления хронической инфекции составляет 1 х 10³ КОЕ. Более низкая доза бактерий очищалась иммунной системой хозяина, а более высокая доза вызывала разрушение раны. Разрыв раны не делает различий между глубокой инфекцией имплантата и поверхностной раневой инфекцией, поэтому в этой модели его избегают (рис. 1)²⁰.

3. Мыши

1. Используйте 12-недельных самцов мышей дикого типа C57BL/6J.
2. Содержать мышей в клетках максимум по 4 штуки за раз.
3. Всегда держите воду под рукой. Соблюдайте 12-часовой цикл «свет/темнота» и не экспериментируйте во время темной фазы цикла.
4. Используйте для кормления корм без люцерны из-за потенциальных помех флуоресцентной сигнализации.
5. Попросите научно-исследовательский или ветеринарный персонал ежедневно осматривать мышей, чтобы убедиться в благополучии животных на протяжении всего эксперимента.

4. Хирургические процедуры на мышах

1. Индуцируйте анестезию, поместив мышей в камеру с изофлураном (2%) примерно на 5 минут. Подтвердите надлежащую глубину анестезии, контролируя, чтобы дыхание оставалось ритмичным и медленным, чем в бодрствующем состоянии, и не изменялось в ответ на вредные раздражители (например, хирургические манипуляции, защемление пальца ноги).
2. Перенесите мышей, находящихся под наркозом, на станцию подготовки и удалите шерсть от крестца до верхнего грудного отдела позвоночника с помощью кусачек для грызунов.
3. Очистите и простерилизуйте кожу тройными смывками чередующимся раствором бетадина и изопропиловым спиртом.
4. Обезболиванных и стерилизованных мышей в положении лежа на стерильной хирургической кровати с сохранением анестезии с введением ингаляционного изофлурана (2%) через носовой конус.
5. Максимально согните бедра и определите положение колена на уровне позвоночника, чтобы приблизиться к поясничному отделу тела 4 позвонка.
6. Сделайте продольный разрез 2 см через кожу хирургическим скальпелем с 15 лезвиями.
7. Пальпируйте остистые отростки, чтобы подтвердить срединную линию, и продолжайте разрез до кости.
8. Рассекают субпериостально с правой стороны остистого отростка L4, распространяясь латерально до поперечного отростка.
9. Пропустите рассасывающийся плетеный шовный материал размером 5-0 на головку и хвост к телу L4 через фасцию и оставьте открытым, готовясь к будущему закрытию.
10. С помощью спинномозговой иглы 25 G разверните остистый отросток L4 с помощью спинной иглы 25 G и вставьте L-образный хирургический имплантат из нержавеющей стали диаметром 0,1 мм, длиной 1 см вдоль пластинки с длинной укладкой цефалады.
11. Инокуляция имплантата 1 x 10³ КОЕ/2 мкл биолюминесцентного S. aureus Xen36, следя за тем, чтобы весь раствор контактировал с имплантатом.
12. Подождите примерно 10 секунд перед завязыванием ранее пройденного рассасывающегося шовного материала после посева, чтобы обеспечить удержание посевного материала на имплантате.
13. Подтяните кожу бегом с помощью рассасывающегося шва.
14. Вводите обезболивающее лекарство путем подкожной инъекции бупренорфина (0,1 мг/кг) сразу после остановки, а затем каждые 12 часов в течение 3 дней.
15. Извлекайте мышей на грелку и следите за возвращением к нормальной активности.
16. Получите послеоперационные рентгенограммы для подтверждения правильной установки имплантата.

5. Продольная биолюминесцентная визуализация in vivo для измерения бактериальной нагрузки

1. Обезболивайте мышей ингаляционным изофлураном (2%). Подтвердите надлежащую глубину анестезии, контролируя, чтобы дыхание оставалось ритмичным и медленным, чем в бодрствующем состоянии, и не изменялось в ответ на вредные раздражители (например, хирургические манипуляции, защемление пальца ноги).
2. Удалите волосы от крестца до верхнего грудного отдела позвоночника с помощью машинок для стрижки грызунов.
3. Загрузите мышей в поле зрения платформы биолюминесцентной визуализации для выполнения биолюминесцентной визуализации in vivo (BLI)¹⁹.
4. Захват биолюминесцентного сигнала в течение 5 минут. Используйте большие настройки биннинга с полем зрения 15 см (B).
5. Повторите шаги 5.1-5.4 на послеоперационные дни 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 и 35 (или в другие дни в зависимости от конкретного плана эксперимента) для мониторинга бактериальной нагрузки.
6. Представление данных BLI с помощью цветовой шкалы и наложения на фотографию в градациях серого. Выделите стандартную область интереса (ROI) с помощью программного обеспечения BLI для количественной оценки BLI в общем потоке (фотоны в секунду) или среднем максимальном потоке (фотоны в секунду/сантиметр² на стерадиан).

6. Количественное определение бактерий, прилипших к имплантатам и окружающим тканям

1. Эвтаназия мышей на POD 35 или в альтернативную дату послеоперационного периода по выбору с воздействием углекислого газа в соответствии с рекомендациями AVMA. Подтвердите эвтаназию при вторичном вывихе шейки матки.
2. Стерилизуйте спинную кожу в соответствии с шагом 4.3 и поместите мышь лежа на стерильное операционное поле.
3. Резко надрежьте предыдущий разрез хирургическим скальпелем с 15 лезвиями.
4. Используйте стерильные ножницы, чтобы тупо рассечь остистый отросток L4 и идентифицировать хирургический имплантат.
5. Используйте игольчатую отвертку, чтобы аккуратно скрутить и удалить имплантат из его положения в остистом отростке L4.
6. Используя стерильные щипцы и ножницы, соберите примерно 0,1 г остистых отростковых костей и мягких тканей, непосредственно окружающих хирургический имплантат, и поместите 1 мл PBS в маленькую коническую трубку носорога с 4 острыми гомогенизирующими шариками.
7. Записывайте вес мягких тканей, взвешивая коническую трубку до и после сбора урожая.
8. Поместите имплантат в 0,5 мл 0,3% Tween-80 в TSB и проведите ультразвуковую терапию в течение 15 минут.
9. Встряхивают полученную суспензию имплантата в течение 2 мин и культивируют в течение ночи в течение 12-16 ч.
10. Гомогенизировать мягкие ткани и остистые отростки, предварительно помещенные в 1 мл PBS, окружающего имплантат, с помощью гомогенизатора.
11. Встряхивают полученную суспензию мягких тканей в течение 5 мин и культивируют в течение ночи в течение 12-16 ч.
12. После ночного посева подсчитывают КОЕ из имплантата и окружающих тканей соответственно. Экспресс-значение: общее количество КОЕ/г, собранное для мягких тканей, и КОЕ/мл для ультразвукового имплантата.

Результаты

Представленная здесь процедура была использована для оценки эффективности схем антибиотикотерапии на мышиной модели ИИМ in vivo. В частности, эффективность комбинированной антибиотикотерапии ванкомицином и рифампицином сравнивали с монотерапией ванкомицином и нелеченной инфицирован...

Обсуждение

Инфекции позвоночника, связанные с имплантатами, предвещают неблагоприятные исходы для пациентов 1,2,3,4,5. В отличие от многих других областей тела, инфицированное оборудование в позвоночнике часто ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer	Next Advance	BBY24M	The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP