Производство ближнего инфракрасного чувствительного, Core-Shell платформа доставки вакцин

Резюме

В этой статье описаны протоколы, используемые для производства новой платформы доставки вакцин, "polybubbles", чтобы предотвратить задержку релиза взрыва. Полиэфиры, включая поли (молочно-когликолевая кислота) и поликарлактор, использовались для формирования полипубблов, а в качестве груза использовались небольшие молекулы и антиген.

Аннотация

Стратегии доставки вакцин, которые могут ограничить воздействие груза органическим растворителем, позволяя при этом новые профили выпуска, имеют решающее значение для улучшения охвата иммунизацией во всем мире. Здесь вводится новая инъекционной, ультрафиолетово-излечимая и отсроченный взрыв, позволяющая платформу доставки вакцины под названием polybubbles. Груз вводили в полиэфирные полипублы, которые образовались в 10% карбоксиметицеллюлозы на основе аквеозного раствора. Этот документ включает в себя протоколы для поддержания сферической формы полигубблов и оптимизации размещения и удержания груза, чтобы максимизировать количество груза в полигублах. Для обеспечения безопасности с помощью анализа нейтронной активации анализировался содержание хлорированного растворителя в полиббле. Выпуск исследования были проведены с небольшими молекулами в качестве груза в полибюбл, чтобы подтвердить задержку выброса взрыва. Чтобы еще больше продемонстрировать потенциал для доставки груза по требованию, золотые нанороды были смешаны в полимерной оболочке, чтобы обеспечить ближнее инфракрасное лазерное активацию.

Введение

Ограниченный охват иммунизацией приводит к смерти 3 миллионов человек, специально вызванных болезнями, предотвратимыми с помощью вакцин^1. Неадекватные условия хранения и транспортировки приводят к потере функциональных вакцин и тем самым способствуют сокращению глобальной иммунизации. Кроме того, неполная вакцинация из-за несоблюдения требуемых графиков вакцинации также вызывает ограниченный охват вакцинацией, особенно в развивающихся странах². В течение рекомендованного периода для получения уколов требуется несколько визитов к медицинскому персоналу, что ограничивает процент населения полной вакцинацией. Поэтому необходимо разработать новые стратегии контролируемой доставки вакцин для преодоления этих проблем.

Текущие усилия по разработке технологий доставки вакцин включают эмульсионные полимерные^{системы 3,,4.} Тем не менее, груз часто подвергается большему количеству органических растворителей, которые потенциально могут вызвать агрегацию и денатурацию, особенно в контексте^{белкового груза 5,,6.} Мы разработали новую платформу доставки вакцин, "polybubbles", которые потенциально могут в доме несколько грузовых отсеков при минимизации объема груза, который подвергается^{растворителя 7}. Например, на нашей платформе polybubble core-shell в центре полиббля вводится один грузовой карман диаметром 0,38 мм (SEM). В этом случае площадь поверхности груза, подвергаемого воздействию органического растворителя, составит примерно 0,453 мм^2. После рассмотрения плотности упаковки сфер (микрочастиц) в сфере (грузовом депо), фактический объем микрочастиц (10 мкм в диаметре), которые могли бы поместиться в депо составляет 0,17 мм³. Объем одной микрочастицы составляет 5,24х10^{-8 мм 3 и,} таким образом, количество микрочастиц частиц, которые могут поместиться депо составляет 3,2x10⁶ частиц. Если каждая микрочастица имеет 20 грузовых карманов (в результате двойной эмульсии) диаметром 0,25 мкм, то площадь поверхности груза, подвергаемого воздействию органического растворителя, составляет 1274^{мм 2.} Таким образом, грузовое депо в полигубле имеет в 2800 раз меньше площади поверхности, подверженной воздействию органического растворителя, по сравнению с органическим растворителем, подвергаемого воздействию грузов в микрочастицах. Таким образом, наша платформа на основе полиэстеров потенциально может уменьшить количество грузов, подверженных воздействию органического растворителя, что в противном случае может привести к агрегации и нестабильности грузов.

Полибублы образуются на основе принципа фазового разделения, при котором полиэстер в органической фазе вводится в аковый раствор, что приводит к сферическому пузырю. Груз в aqueous фазе можно впрыснуть в центр polybubble. Другой грузовой отсек потенциально может быть достигнут в полибюбл, смешивая другой груз с полимерной оболочкой. Полибуббл на данном этапе будет податливым, а затем будет вылечен, чтобы привести к твердой структуре полипуббл с грузом в середине. Сферические полигублы были выбраны помимо других геометрических форм для увеличения грузоподъемности в полибюбле при минимизации общего размера полигубля. Полибуббли с грузом в центре были выбраны, чтобы продемонстрировать задержку релиза взрыва. Polybubbles были также включены с ближнего инфракрасного (NIR) - чувствительный (т.е., theranostic-поддержки) агент, а именно золотые нанороды (AuNR), чтобы вызвать повышение температуры полипублей. Этот эффект потенциально может способствовать более быстрой деградации и может быть использован для контроля кинетики в будущих приложениях. В этой статье мы описываем наш подход к формированию и характеристике полигубблов, для достижения задержки выброса всплеска из полигублов, а также для включения AuNR в полибузы, чтобы вызвать NIR-активацию.

протокол

1. Синтез поликапролакиона триакрилата (PCLTA)

1. Сухой 3,2 мл 400 Da polycaprolacyone (PCL) триол ночь на 50 градусов по Цельсию в открытой 200 мл круглой нижней колбы и K₂CO₃ в стеклянном флаконе при 90 градусов по Цельсию.
2. Смешайте триол с 6,4 мл дихлорметана (DCM) и 4,246 г карбоната калия (K₂CO₃) под аргон.
3. Смешайте 2,72 мл хлорида акрилового хлорида в 27,2 мл DCM и добавьте dropwise к реакционной смеси в колбе более 5 мин.
4. Обложка реакционной смеси с алюминиевой фольгой и оставить его нетронутым при комнатной температуре в течение 24 ч под аргоном.
5. После 24 ч, фильтр реакционной смеси с помощью фильтровальной бумаги на воронку Buchner под вакуумом, чтобы отбросить избыточные реагенты.
6. Осадок фильтрата из шага 1.5, который содержит endcapped полимера в диэтил эфира в 1:3 (vol/vol) и rotovape при 30 градусов по Цельсию, чтобы удалить диэтил эфира.

2. Формирование полигуббл

ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекционный полимер в деионизированной (DI) воде приведет к тому, что полифублы мигрируют на дно флакона, что приведет к уплощенему дну. Используйте 10% (wt/vol) карбоксиметил целлюлозы (CMC) заполнить стеклянный флакон вместо того, чтобы избежать уплощения поликубл.

1. Подготовка 10% (wt/vol) CMC раствор в воде DI.
2. Заполните стеклянный флакон 0,92 мл с 0,8 мл 10% CMC с помощью 1 мл передачи трубы.
3. Смешайте 1000 мг/мл 14 кДа PCL в DCM и синтезировать PCLTA в 1:3 (vol/vol) для общего объема 200 л или подготовить 200 л 1000 мг/мл 5 кДа поли (молочно-когликолевая кислота) диакрилат (PLGADA) в хлороформе.
4. Смешайте смесь 2-гидрокси-4"-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон (фотоинициатор) с полимером (PLGADA или PCL/PCLTA) смесью в 0.005:1 (vol/vol).
5. Загрузите 200 мкл полимерной смеси в стеклянный шприц 1 мл, установленный на шприц-насосе, который соединен с дозаторной трубкой из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,016 дюйма.
6. Используйте микромотор для управления движением вперед и назад полимерной трубки, чтобы ввести полимер в 10% CMC в стеклянном флаконе, чтобы сформировать полипуббл.
7. Лечить полигублы под ультрафиолетовым (УФ) на 254 нм длины волны для 60 с при 2 Вт / см².
8. Вспышка заморозить polybubbles в жидком азоте и лиофилизируют на ночь на 0,010 мбар вакуума и при -85 градусов по Цельсию.
9. Отделяйте полигублы от высушенного CMC с помощью типсов и мыть полигубблы с водой DI, чтобы удалить любые остаточные CMC. Обратите внимание, что другие полимеры могут быть использованы, вероятно, с изменениями, чтобы изменить релиз кинетики.

3. Модуляция диаметра полипубля

1. Заполните стеклянный флакон 0,92 мл с 10% CMC с помощью трубы передачи 1 мл.
2. Смешайте PCL/PCLTA в 1:3 (vol/vol) с 1000 мг/мл 14kDa PCL и синтезировать PCLTA. Смешайте фотоинициатор с полимерной смесью в 0.005:1 (vol/vol).
3. Загрузите полимерную смесь в стеклянный шприц 1 мл, установленный на шприц-насосе, который соединен с дозаторной трубкой из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,016 дюйма.
4. Используйте микромотор для управления движением вперед и назад полимерной трубки, чтобы ввести полимер в 10% CMC в стеклянном флаконе, чтобы сформировать полипуббл.
5. Для получения полигубблов различных диаметров, варьировать скорость дозирования от 0,0005 до 1 йл/с.
6. Сделайе снимки флакона с полибубблами разного диаметра.
7. Используйте ImageJ для количественной оценки диаметра полигублов и использования размера флакона в качестве шкалы.

4. Центрирование грузов в пределах полигуббл

1. Модуляция вязкости PCL/PCLTA с использованием K₂CO₃:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вязкость PLGADA не должна быть изменена с помощью K₂CO_3, потому что вязкость 5 kDa PLAGDA при 1000 мг/мл достаточна для центраирования груза.
   1. Добавьте K₂CO₃ (который был выделен после реакции PCLTA) к PCLTA в различных концентрациях, включая 0 мг/мл, 10 мг/мл, 20 мг/мл, 40 мг/мл и 60 мг/мл.
   2. Измерьте динамическую вязкость растворов, изменив скорость стрижки с 0 до 1000 1/с с помощью реометрии.
   3. Вручную впрыскивайте груз в середину (обратитесь к шагу 4.2 для подготовки грузовой смеси) из полигубблов, которые были сформированы с использованием решений PCL/PCLTA с различными концентрациями K₂CO₃ (шаг 4.1.1). Определите оптимальную концентрацию K₂CO_3, наблюдая, какое решение из шага 4.1.1 может привести к удержанию груза в середине.
2. Центрирование груза (уже показанная осуществимость с небольшими молекулами) с CMC
   1. Смешайте груз с 5% (wt/vol) CMC в ротаторе на ночь, чтобы увеличить вязкость груза.
   2. Вручную введите 2 МКЛ грузовой смеси в полигуббл и приступить к УФ-лечения на 254 нм длины волны для 60 с при 2 Вт /^{см 2}.
   3. Вспышка заморозить polybubbles в жидком азоте в течение 30 с и лиофилизовать ночь на 0,010 мБар вакуума и при -85 градусов по Цельсию.
   4. Отделяйте полигублы от высушенного CMC с помощью типсов и мыть водой DI, чтобы удалить остатки CMC.
   5. Разрежьте полибуббл пополам и изображение половинки с помощью конфокальные микроскопии, чтобы гарантировать, что груз по центру (ссылка на шаг 6 для возбуждения и выбросов длин волн используется).

5. Формула груза

ПРИМЕЧАНИЕ: В формуле Polybubble могут быть различные типы грузов, включая небольшие молекулы, белки и нуклеиновые кислоты.

1. Основываясь на предыдущих исследованиях, в случае белковых грузов, используйте excipients в том числе^{полиэтиленгликоль}(PEG) 6 , поливинилпирролидон (PVP), и^{гликополимеры 6 для повышения} стабильности белка во время полибубл формулировки.
2. Форма полигублов на основе протокола в шаге 2.
3. Приготовьте антигенный раствор, добавив 17,11 г трегалозы в 625 мл антигена ВИЧ gp120/41.
4. Вручную ввит 1 МКЛ антигенового раствора в середине полиббл.
5. Откройте полигублы в дни 0, 7, 14 и 21, и записывают флуоресценцию антигена с возбуждением и выбросами длин волн 497 нм и 520 нм, соответственно.
6. Определите функциональность антигена, используя связанный с ферментами иммуносорбентный анализ (ELISA) и используйте 5% обезжиренного молока в качестве блокирующего буфера.

6. Выпуск грузов

ПРИМЕЧАНИЕ: Малая молекула или антиген могут быть использованы в качестве грузового типа

1. Маленькая молекула
   1. Инкубировать поликубблы с центром acriflavine в 400 йл фосфатного буфера солевого раствора (PBS) при 37 градусов по Цельсию, 50 градусов по PLGADA polybubbles и при 37 C, 50 КК, 70 C для PCL / PCLTA polybubbles.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Причина, по которой мы рекомендуем тестирование выше температуры тела является а) имитировать температуру (50 градусов по Цельсию), при которой полигуббл достигает во время лазерирования золотых нанородов (AuNRs) в PCL и PLGA; и б) ускорить процесс деградации ПХЛ (50 градусов по Цельсию, 70 градусов по Цельсию).
   2. В каждый момент времени, собирать supernatants и заменить 400 йл свежего PBS.
   3. Используйте считыватель пластин для количественной оценки интенсивности флуоресценции в собранных супернатантах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ex/em 416 nm/514 nm для acriflavine.
2. Антигена
   1. Инкубировать поликубблы с центром бычьего альбумин сыворотки (BSA)-488 в 400 йл PBS при 37 градусов по Цельсию, 50 градусов по PLGADA polybubbles и при 37 градусов по Цельсию, 50 кк для PCL / PCLTA polybubbles.
   2. В каждой точке времени, собирать supernatants и заменить 400 йл свежих PBS.
   3. Используйте считыватель пластин для количественной оценки интенсивности флуоресценции в собранных супернатантах. Используйте ex/em 497 nm/520 nm для BSA-488.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследование выпуска при температуре 70 градусов по Цельсию для полибблей PCL/PCLTA не должно проводиться, чтобы избежать разоблачения антигена до экстремальной температуры.

7. Токсичность

1. Количественная оценка содержания хлора в полигублах с использованием анализа нейтронной активации (NAA)
   1. Используйте полибублы, которые были лиофилизированы для 2, 4, 6, 20 и 24 ч для этого исследования в вакууме 0.010 mBar и при -85 C.
   2. Измерьте 5-9 мг полигублов и поместите их на флаконы облучения LDPE.
   3. Приготовьте 1000 г/мл раствора калибровки хлора из национального института стандартов и технологий (NIST) - отслеживаемого калибровочного раствора.
   4. Используйте 1-мегаваттный реактор Triga для проведения нейтронных облучений на каждом образце при скорости нейтронной беглости 9,1 ×^{10 12 /см 2}на 600 с.
   5. Перенесите полигублы на необлученые флаконы.
   6. Используйте детектор HPGe для получения гамма-спектров для 500 с после 360 с интервалов распада.
   7. Используйте программное обеспечение NAA от canberra Industries для анализа данных.
2. Количественная оценка содержания хлора, высвобождаемого из полигублов с использованием NAA
   1. Инкубировать полибублы, которые были лиофилизированы в одночасье (при вакууме 0,010 мбара и при -85 градусов по Цельсию) в 400 МКЛ PBS при 37 градусов по Цельсию.
   2. Соберите супернатанты на неделях 1, 2 и 3 после инкубации.
   3. Проанализируйте супернатанты на содержание хлора с помощью NAA с помощью того же метода, что описано выше в шаге 7.1.

8. AuNR Синтез Киттлер, S., и др.⁸

1. Приготовьте раствор для посева AuNR, смешивая 250 л хлороауновой кислоты 10 мМ (HAuCl_4),7,5 мл бромистого цетримония 100 мМ (CTAB) и 600 л 10 мл 10 мл ледяного борогидрида натрия натрия (NaBH_4).
2. Подготовьте раствор роста, смешивая 40 мл 100 мл CTAB, 1,7 мл 10 мл HAuCl_4,250 л нитрата серебра (AgNO₃₎и 270 л аскорбиновой кислоты 17,6 мг/мл в трубку.
3. Энергично смешайте 420 мл семенного раствора с раствором роста при 1200 об/мин в течение 1 мин. Затем оставьте смесь спокойно реагировать на 16 ч.
4. Удалите излишки реагентов из смеси путем центрифугирования при 8000 × в течение 10 минут и отбросьте супернатант.

9. Гидрофобизация AUNRs Солиман, М.Г., и др.⁹

1. Отрегулируйте рН 1,5 мл синтезированных стабилизированных АТБ 10 с использованием гидроксида натрия 1 мМ (NaOH).
2. Перемешать раствор с 0,1 мл 0,3 мМм метилированного ПЕГ (mPEG) тиола при 400 об/мин на ночь.
3. Смешайте PEGylated AuNRs с 0,4 M додедиламин (DDA) в хлороформ при 500 об/мин в течение 4 дней.
4. Pipet из верхнего органического слоя, содержащего гидрофобных AUNRs и хранить при 4 градусов по Цельсию до будущего использования.

10. NIR-активация полигубблов

1. Смешайте раствор полимера (PLGADA или PCL/PCLTA) с гидрофобными auNRs в 1:9 (vol/vol).
2. Добавить фотоинициатор в смесь полимер-AuNR в 0.005:1 (vol/vol).
3. Форма polybubbles путем впрыскивания полимера-AuNR смеси в 0,92 мл стеклянный флакон с 10% CMC (wt/vol) (ссылка на шаг 2).
4. Лечить полигублы на 254 нм длины волны для 60 с при 2 Вт / см².
5. Вспышка заморозить в жидком азоте на 30 с и лиофилизовать на ночь при 0,010 мбар вакуума и при -85 градусов по Цельсию.
6. Отделить сушеные полигузы с помощью типсов и мыть водой DI, чтобы удалить остатки CMC.
7. Инкубировать полигублы в 400 МКЛ PBS при 37 градусов по Цельсию.
8. Активировать полигублы с помощью 801 нм NIR лазера на 8A в течение 5 минут каждый понедельник, среду и пятницу.
9. Возьмите перспективные инфракрасные (FLIR) изображения полибюбл до и после лазерной активации для получения температурных значений.
10. Рассчитайте температурные различия между до и после лазерной активации на основе температурных значений на снимках FLIR.

Результаты

Polybubbles были широко охарактеризованы с помощью SEM и NAA. Груз был успешно центрирован, чтобы привести к задержке релиза взрыва. Polybubbles были также успешно лазерной активации из-за присутствия AUNRs в полигублов.

Характеристика Полигоббл

Обсуждение

Современные технологии и вызовы
Микро- и наночастицы на основе эмульсии широко используются в качестве носителей лекарств. Хотя релиз кинетики груза из этих устройств были тщательно изучены, контроль выброса всплеска кинетики была серьезной проблемой¹¹. Универ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution	Thermo scientific	34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone	TCI AMERICA	H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab17152
Acryloyl chloride	Sigma Aldrich	A24109-100G
Acriflavine	Chem-Impex International	22916
Anhydrous ethyl ether	Fisher Chemical	E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates	Invitrogen	A13100
Bromosalicylic acid	Acros Organics	AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC)	Millipore Sigma	80502-040
Centrimonium bromide (CTAB)	MP Biomedicals	ICN19400480
Chloroform	Fisher Chemical	C2984
Coating buffer	Abcam	ab210899
Dichloromethane (DCM)	Sigma Aldrich	270997-1L
Diethyl ether	Fisher Chemical	E1384
Dodeacyl Amine	Acros Organics	AC117665000
Doxorubicin hydrochloride	Fisher BioReagents	BP251610
L-ascorbic acid	Acros Organics	A61 100
Legato 100 Syringe Pump	KD Scientific	14 831 212
mPEG thiol	Laysan Bio	NC0702454
Nonfat dry milk	Andwin Scientific	NC9022655
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Phosphate saline buffer	Fisher BioReagents	BP3991
(Poly(caprolactone)	Sigma Aldrich	440744-250G
(Poly(caprolactone) triol	Acros Organics	AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate	CMTec	280050
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein	Abcam	ab49054
Silver nitrate	Acros Organics	S181 25
Sodium borohydride	Fisher Chemical	S678 10
Tetrachloroauric acid	Fisher Chemical	G54 1
Trehalose	Acros Organics	NC9022655
Triethyl amine	Acros Organics	AC157910010