Сочетание лазерного захвата микродиссекции и микрофлюидных qPCR для анализа транскрипционных профилей отдельных клеток: Системная биология Подход к опиоидной зависимости

Резюме

Этот протокол объясняет, как собирать одиночные нейроны, микроглии и астроциты из центрального ядра миндалины с высокой точностью и анатомической специфичностью с помощью микрорассечения лазерного захвата. Кроме того, мы объясняем наше использование микрофлюидных RT-qPCR для измерения подмноза транскриптома этих клеток.

Аннотация

Глубокая транскрипционная неоднородность в анатомически смежных одиночных клетках позволяет предположить, что надежная функциональность тканей может быть достигнута за счет разнообразия клеточного фенотипа. Одноклеточные эксперименты, исследующие сетевую динамику биологических систем, демонстрируют клеточные и тканевые реакции на различные состояния при биологическом разрешении. В этом мы объясняем наши методы сбора одиночных клеток из анатомически конкретных мест и точного измерения подмножества их профилей экспрессии генов. Мы комбинируем микродиссекцию захвата лазера (LCM) с микрофлюидной обратной транскрипцией количественных полимеразных цепных реакций (RT-qPCR). Мы также используем эту микрофлюидную платформу RT-qPCR для измерения микробного изобилия содержимого кишечника.

Введение

Измерение профилей экспрессии генов отдельных клеток продемонстрировало обширную фенотипическую неоднородность в ткани. Эта сложность осложнила наше понимание биологических сетей, которые регулируют функцию тканей. Наша группа и другие исследовали это явление во многих тканях и условиях^1,2,3,4,5^,6. Эти эксперименты не только показывают, что регулирование сетей экспрессии генов лежат в основе такой неоднородности, но и то, что одноклеточное разрешение показывает сложность функции тканей, которую не оценить разрешение на уровне тканей. Действительно, лишь небольшое меньшинство клеток может реагировать на конкретные условия или вызов, но влияние этих клеток на общую физиологию может быть существенным. Кроме того, подход системной биологии, который применяет многовариантные методы к высокомерным наборам данных из нескольких типов клеток и тканей, может выяснить общесистемные эффекты лечения.

Мы объединяем LCM и микрофлюидные RT-qPCR для получения таких наборов данных. Мы используем этот подход здесь в отличие от сбора одиночных клеток с помощью флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS) и с помощью РНК секвенирования (РНК-сек) для измерения их транскриптома. Преимущество LCM перед FACS является то, что точная анатомическая специфика одиночных клеток может быть документально с LCM, относительно и абсолютно. Кроме того, в то время как РНК-сек может измерять больше функций, которые RT-qPCR, микрофлюидные RT-qPCR дешевле и имеет более высокую чувствительность и специфичность⁷.

В этом репрезентативном эксперименте, мы исследовали влияние опиоидной зависимости и налтрексон-поспешный опиоидный вывод на крыснейронных, микроглии и экспрессии генов астроцитов в центральном ядре миндалины (CeA) и кишечной микрофлоры изобилие⁴. Были проанализированы четыре группы лечения: 1) Плацебо, 2) Морфин, 3) Налтрексон, и 4) Вывод(рисунок 1). Мы обнаружили, что опиоидная зависимость существенно не изменила экспрессию генов, но этот опиоидный вывод индуцировал экспрессию воспалительных генов, в частности Tnf. Астроциты были наиболее пострадавших типа клеток. Микрофлора кишечника была глубоко пострадавших от опиоидных вывода, как указано на снижение в Firmicutes к Bacteroides отношение, которое является установленным маркером дисбактериоз кишечника^8,9.

протокол

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Томаса Джефферсона и Медицинского колледжа Университета Дрекселя. Протокол был одобрен Университетом Томаса Джефферсона и Университетом Дрекселя медицинского колледжа IACUC.

1. Модель животных

1. Вставьте два 75 мг медленно-релиз морфина сульфат гранулы или два пеллеты плацебо подкожно у взрослых мужчин Sprague-Dawley крыс.
   1. Используйте платье и перчатки надлежащим образом для незначительных стерильных операций. При необходимости сбрить крысиную сморцу с помощью ножниц.
   2. Нанесите ветеринарную мазь на глаза животного. Анестезируйка крысы с примерно 20 с изофлюранинга ингаляции. Анестезия подтверждается потерей сознания.
   3. Сделайте разрез средней линии в крысиной сонной сумсе с помощью стерилизованных тупых ножниц и отделите дерму от стенки тела стерилизованный зонд. Вставьте гранулы под дерму с бисо-стерилизованные щиптем. Шов разреза закрыты стерильной иглой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура занимает около 5 минут на крысу. Свежие стерильные перчатки используются для каждой крысы.
   4. Поместите крысу в изолированную клетку для послеоперационного восстановления. Проверьте на сердцебиение и регулярный дыхательный ритм. Наблюдайте за крысой, пока сознание не придет в себя. Оцените послеоперационную боль.
   5. Оцените крыс 8 ч постхирургии и каждые 12 ч после для восстановления и инфекции. Поместите крыс в клетку с остальной частью когорты, когда они полностью оправились от операции, около 24 ч послеоперации.
2. Дайте интраперитонеальной инъекции налтрексона (75 мг/кг) в G и вывод когорты после 6 дней воздействия морфина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом представительном эксперименте было четыре крысиные когорты (см. рисунок 1).

2. Сбор проб

1. Урожай мозга 6 дней после вставки гранул или 24 ч после инъекции налтрексона.
   1. Поместите животное в изофлюранальную камеру примерно на 30 с или до потери сознания, о чем свидетельствует отсутствие движения и снижение частоты дыхания.
   2. Используйте острую гильотину, чтобы быстро обезглавить животное.
   3. Вскрыть мозг из черепа животного.
   4. Используйте острую портативную бритву, чтобы сделать следующие грубые разрезы на удаленный мозг: Во-первых, отрезать мозжечок и отказаться. Во-вторых, отделить ствол мозга от передового с поперечным разрезом. В-третьих, гемисектировать передний мозг и/или ствол мозга с помощью средней линии сагитальной разреза.
   5. Поместите передний мозг и ствол мозга в пластиковую ткань встраивающей форму с 3-4 см оптимальной резки температуры соединения (OCT) в нижней части формы. Обложка остальной части образца с OCT.
   6. Немедленно поместите пластиковую ткань встраивающей форму с образцом, покрытым OCT, в ванну, содержащую сухой лед и метанол. Не позволяйте метанолу разлива в ткани встраивания формы. Держите встраивающую форму с образцом мозга в метанол-ледяной ванне до тех пор, пока сбор тканей не будет закончен (максимум 10-15 мин).
   7. Поместите образец мозга в морозильную камеру -80 градусов как можно скорее.
2. Урожай кишечника образцов одновременно.
   1. После быстрого обезглавливания сделайте скальпелем разрез средней линии в брюшной полости животного.
   2. Найти cecum и разорвать его связь с восходящей толстой кишки.
   3. Сожмите содержимое цекала в коническую трубку 15 мл.
   4. Немедленно поместите коническую трубку на сухой лед и поставьте в морозильную камеру -80 градусов как можно скорее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Содержимое тонкой кишки также может быть собрано с помощью тех же методов, что и отрицательный контроль.

3. Нарезка

1. Нарежьте гемисектированный крысиный предтечи с помощью криостата.
   1. Удалите пластиковую форму встраивания с предмозгом из морозильной камеры -80 градусов и поместите в криостат -20 градусов.
   2. Удалите OCT-встроенный hemisected переднего мозга образца из встраивания формы. Используйте бритву, чтобы нарезать углы пластиковой формы встраивания вертикально, если это необходимо. Маунт предтеча для ростральной к каудальной корональной нарезки на криостат патрон с помощью OCT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анатомические ориентиры для идентификации CeA включают оптический тракт и stria terminalis(Рисунок 2B). Оптический тракт ветвит от оптического chiasm и отслеживает подошво-боковой по мере того как мозг отрезан rostral к caudal. Когда оптический тракт имеет морфологию похож на то, что видели в атласе мозга крысы bregma -2.12 мм¹⁰, тест ломтики могут рассматриваться под микроскопом. Оптический тракт и stria terminalis морфологии могут быть проверены в атласе мозга^{крысы 10,} чтобы определить bregma и является ли CeA окружает stria терминалов.
   3. Нарежьте 10 мкм толщиной корональных секций от hemisected предреченного предреченного до каудаля до тех пор, пока разделы, содержащие CeA не будут достигнуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина и высота секций приблизительно 200 мм.
   4. Соберите 10 мкм разделов, содержащих CeA, или предпочтительной области мозга, путем оттаивания монтажа 10 мкм разделы на простые стеклянные слайды. Немедленно поместите стеклянные горки на металлическую кастрюлю, опираясь на сухой лед. Поместите слайды с секциями мозга в морозильную камеру -80 градусов как можно скорее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько срезов могут быть размещены на одном слайде. При использовании различных пятен типа клеток для ломтиков на том же слайде, оставьте около 100 мм между ломтиками, чтобы гидрофобная ручка может быть использована для разделения клеточных типов антител на слайде. Оставьте около 20 мм от края слайда с каждой стороны от ломтика.

4. Иммунофлуоресценция окрашивания

1. Пятно передний мозг разделы для клетки мозга выбора (например, нейрон, микроглии, астроцитов и т.д.) с использованием иммунофлуоресценции.
   1. Удалите один или несколько слайдов с 10 мкм разделов CeA из -80 градусов морозильной камеры.
   2. Закрепите слайды с 75% этанола на 30 с. Удалите лишнюю жидкость.
   3. Блок ломтики для 30 с с 2% бычьей сыворотки антигена (BSA) в 1x фосфат буфера соливого (PBS). Вымойте 1x с PBS.
   4. Добавьте основной антитело раствор на слайд в течение 2 мин. Промойте 1x с 2% раствором BSA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичное решение антитела состоит из 2% первичных антител, 1% RNase Out, и 96% того же решения BSA PBS для блокирующего шага выше (шаг 4.1.3). В репрезентативном эксперименте использовались анти-нейн-антитела, анти-Cd11 и анти-GFAP антитела в следующих количествах: 3 Зл первичного, 1,88 л ингибитора РНК, и 145,12 л раствора BSA.
   5. Добавьте вторичный раствор антитела к слайду в течение 3 мин. Промойте 1x с PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичный раствор антитела состоит из 1 зл козла анти-мыш 488 нм флуоресцентные метки (1:500), 2,5 л ингибитора РНК, 1,3 зл и DAPI (1:10,000), и 196,5 л 2% BSA.

5. Этанол и ксилен обезвоживания серии

1. Опустите слайды в 75% этанола на 30 с. Сразу после этого опустите горки в 95% этанола на 30 с. Сразу после этого опустите слайды на 100% этанола на 30 с. Сразу после этого опустите слайды во второй контейнер, содержащий 100% этанола на 30 с.
2. После серии обезвоживания этанола окуните слайды в свежевылитый ксилен на 1 мин. Сразу после этого окуните слайды во второй контейнер из ксилена в течение 4 мин.
3. Удалите слайды из ксиленовой ванны и дайте воздуху высохнуть в темноте в течение 5 мин.
4. Поместите горки в сушилку в течение 5 минут, чтобы высохнуть дальше.

6. Лазерный захват микрорассечения

1. Если окрашенные, поместите слайд в микроскоп и найти область интереса (CeA) с использованием анатомических ориентиров (т.е. оптический хиазмы и stria terminalis).
2. Используйте флуоресценцию для определения типа окрашенных клеток и их ядра в интересуемом регионе. Выберите одну ячейку или несколько ячеек, если вы делаете одноклеточные объединенные образцы. Отметьте интересуемые ячейки с помощью программного обеспечения LCM.
3. Поместите крышку LCM поверх среза на интересуемый регион.
4. Используйте тестовые снимки инфракрасного (ИК) лазера для регулировки силы, размера и продолжительности ИК-лазера, чтобы клейкая крышка LCM расплавилась только над областью выбранной одноклеточной ячейки. Это гарантирует, что никакие другие ячейки не будут собраны, кроме выбранных ячеек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом репрезентативном эксперименте, 10 пулов клеток того же типа клетки были использованы как одиночный образец для того чтобы ограничивать изменчивость клетки-к-клетки в выражении гена между образцами с таким же обработкой. Тем не менее, этот метод может быть использован для истинных экспериментов одной клетки^1,3.
5. Выберите отдельные ячейки, которые будут собраны для анализа с помощью программных средств LCM(рисунок 2C). Выбранные клетки должны находиться в анатомической области CeA (или области мозга выбора) на основе атласа мозга крысы и bregma¹⁰. Клетки должны быть не менее 3 мкм от соседних окрашенных ядер.
6. Пожар ИК-лазер для сбора выявленных одиночных ячеек.
7. Поместите крышку в станции контроля качества (КК) и просмотрите ее, чтобы убедиться, что были выбраны только нужные ячейки. Если другие клетки были выбраны по ошибке, ультрафиолетовый лазер может быть использован для уничтожения нежелательных клеток в то время как крышка остается в кк станции.
8. Сфотографируйте раздел ткани от где клетка была собрана для того чтобы документировать свою анатомическую специфичность. Запись расстояние ломтик от bregma при необходимости с помощью атласа мозга крысы в качестве эталона¹⁰.
9. Снимите крышку LCM со станции КК, прикрепите устройство экстракции образца и пипетку 5,5 л буфера лисиса на образец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Решение буфера лисиса состоит из 0,5 злителли усилитель лиза и 5 зл буфера повторного действия.
10. Приспособите устройство ExtracSure на микроцентрифугную трубку 0,5 мл и поместите на горячую панель при 75 градусах По цельсию в течение 15 минут.
11. Скрутите образец и буфер лисиса на 30 с на низкой скорости (0,01-0,02 х г)и поместите собранный образец в морозильную камеру -80 градусов.

7. Одноклеточная микрофлюидная RT-qPCR

1. Преамплификация одноклеточного мРНК для чипа динамического массива 96.96
   1. Объедините передние и обратные праймеры генов mRNA qPCR для всех генов, которые ассссируются в грунтовом пуле для преамплиции (500 нм концентрации каждого грунтовки). Например, 1 зл из 100 праймеров в 80 л плюс 120 л буфера суспензии ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров, используемые для репрезентативного эксперимента, можно найти в O'Sullivan et al.⁴.
   2. В новой пластине 96 x 96 ПЦР добавьте 1 кL 5x VILO к каждой скважине.
   3. Удалите образцы одной ячейки LCM из образцов, хранящихся при -80 градусов по Цельсию, дайте оттепели кратковременно, центрифуге кратко на низкой скорости (0,01-0,02 х г),и добавьте 5,5 л из лизатого одноклеточного образца к пластине ПЦР. Каждый образец добавляется в свой колодец.
   4. Поместите пЦР пластины с образцами и VILO в термоциклизатор и тепла при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 1,5 мин. Спин пластины в течение 1 мин на 1300 х г при 4 C и поместите пластину на лед.
   5. Добавьте 0,15 л мастер-микса синтеза 10x cDNA, 0,12 л белка T4 Gene 32 и 0,73 л буфера суспензии ДНК к каждому колодцу.
   6. Поместите пластину ПЦР в термоциклер и запустите следующий протокол: 25 градусов по Цельсию в течение 5 мин, 50 градусов по Цельсию в течение 30 мин, 55 градусов по Цельсию в течение 25 мин, 60 градусов по Цельсию в течение 5 мин, 70 градусов по Цельсию в течение 10 мин, от 4 до конца.
   7. Добавьте 7,5 л мастер-микси Taq полимеразы к каждому колодцу.
   8. Добавьте 1,5 л грунтового пула (см. выше) к каждой скважине.
   9. Поместите пластину ПЦР в термоциклер и запустите следующий протокол предамплификации: 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем 22 циклов 96 градусов по Цельсию в течение 5 сек, 60 градусов по Цельсию в течение 4 мин.
   10. Добавьте 0,6 л буфера реакции exonuclease I 10x, 1,2 л экзонуклеазы I и 4,2 л буфера суспензии ДНК к каждой скважине.
   11. Поместите пластину ПЦР в термоциклер и запустите следующий протокол: 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин, 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
   12. Добавьте 54 qL буфера TE к каждому колодцу. Спин ПЦР пластины на 1300 х г на 5 мин. Хранить при 4 кв С, если сразу же продолжается до следующего шага. Храните при -20 градусов по Цельсию, если ждать более 12 ч для следующего шага.
2. Подготовьте образец пластины для чипа динамического массива 96.96.
   1. В новой пластине ПЦР 96 скважин ы на 96 скважин добавьте 0,45 л 20-x ДНК связывающего красителя и 4,55 л низкой мастермикса ROX к каждой скважине.
   2. Добавьте 3 злицита к каждой скважине, закрутите пластину ПЦР при 1300 х г,затем положите тарелку на лед.
3. Подготовьте пластину ассеа для чипа динамического массива 96.96.
   1. В новой пластине ПЦР 96 скважин, добавьте 3,75 л 2x GE анализа загрузки реагента и 1,25 л буфера подвески ДНК к каждой скважине.
   2. Добавьте 2,5 л из 10 км qPCR грунтовки к каждой соответствующей скважине. Спин ПЦР пластины на 1300 х г в течение 5 мин.
4. Загрузите и запустите чип динамического массива 96.96.
   1. Прайм чип с жидкостью контрольной линии.
   2. Поместите чип в контроллер IFC HX и запустите сценарий Prime (136X).
   3. Добавьте 6 зЛ образца из образца циряда ПЦР в соответствующие скважины образца в чипе динамического массива 96,96.
   4. Добавьте 6 зЛ образца из пластины асссея ПЦР в соответствующие скважины Assay в чипе динамического массива 96.96.
   5. Используйте иглы, чтобы поп любые пузырьки воздуха в колодцах 96,96 Динамический Array Чип.
   6. Поместите 96.96 Динамический массив чип в контроллер IfC HX и запустить нагрузки Mix (136x) сценарий.
   7. Удалите чип с контроллера IFC HX, снимите защитную наклейку и поместите чип Dynamic Array 96.96 в микрофлюидную платформу RT-qPCR. Выполнить протокол GE Fast 96 x 96 PCR (30 циклов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество РНК и достоверность результатов оцениваются несколькими методами, включая проверку с помощью геля электрофорез, переплавления кривых температуры, репликации образцов и анализов, а также стандартные участки серии разбавления. Кроме того, транскрипционные выводы могут быть подтверждены независимыми методами на гемисекции мозга, включая западные подясти и иммунофлуоресценции анализы.

8. Измерение бактериального изобилия с помощью микрофлюидных РТ-кПКр

1. Извлеките бактериальную ДНК, следуя указаниям комплекта для извлечения ДНК стула.
2. Оцените концентрацию бактериальной ДНК с помощью qPCR.
3. Добавьте извлеченную бактериальную ДНК в новую пластину ПЦР. Добавьте 1 зл из извлеченной бактериальной ДНК и 9 Зл буфера суспензии ДНК.
4. Подготовьте пластину ассеа для чипа динамического массива 48.48 (см. шаги 7.2.1-7.2.2)
5. Подготовьте образец пластины для чипа динамического массива 48.48 (см. шаги 7.3.1-7.3.2)
   1. В новой пластине ПЦР 96 скважин добавьте 0,45 л 20-х связывающих красителя ДНК и 4,55 л низкой мастермикса ROX к 48 скважинам.
   2. Добавьте 3 qL образца из пЦР пластины, содержащей бактериальную ДНК, в 48 скважин и вращайте вниз пЦР пластину при 1300 х г в течение 5 мин. Хранить при 4 градусах Цельсия.
6. Загрузите и запустите чип dynamic Array 48.48 (см. шаги 7.4.1-7.4.7).

Результаты

Выбор одиночных ячеек был проверен как визуально, так и молекулярно. Визуально клеточная морфология рассматривалась до сбора клеток. Собранные клетки затем были просмотрены на станции КК и клеточное пятно ядер (DAPI) перекрывается с флуоресценцией выбор одного ячеек.

Обсуждение

Одноклеточная биология продемонстрировала неоднородность клеточных фенотипов и надежность функции тканей. Эти выводы позволили получить представление об организации биологических систем как в макро-, так и на микроуровне. Здесь мы описываем сочетание двух методов, LCM и микрофлюидных...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-48.48	NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β Antibody	Genway Biotech	CCEC48	Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis buffer solution components
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Sample Extraction Device	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube	ThermoFisher Scientific	N8010611
GFAP Monoclonal Antibody	ThermoFisher Scientific	A-21294	Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A28175	Seconadry Antibody
IFC Controller	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher Scientific	11754250	Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA