Протокол поэтапного дозирования для увеличения пропускной записи в label-Free Impedance основе GPCR анализы

Резюме

Этот протокол демонстрирует в режиме реального времени запись полной дозы-реакции отношений для агониста индуцированной активации GPCR из одного слоя клеток, выращенных на одном микроэлектроде с использованием без этикетки импеданса измерений. Новая схема дозирования значительно увеличивает пропускную схему без потери во времени разрешения.

Аннотация

Без этикетки impedance основе анализы все чаще используются для неинвазивного изучения лиганд-индуцированной активации GPCR в экспериментах клеточной культуры. Этот подход обеспечивает мониторинг клеток в режиме реального времени с разрешением времени, зависящим от устройства, до нескольких десятков миллисекунд, и он полностью автоматизирован. Однако, когда число образцов становится высоким (например, доза-ответ исследований для различных лигандов), стоимость одноразовых электродов массивов, а также доступное разрешение времени для последовательных хорошо хорошо записи могут стать ограниченными. Таким образом, мы представляем серийный протокол дополнения агониста, который имеет потенциал для значительного увеличения выпуска без этикетки GPCR анализов. Используя протокол последовательного добавления агониста, агонист GPCR добавляется последовательно в увеличении концентраций к одноклеточному слою при постоянном мониторинге импеданса образца (агонистовый режим). С помощью этого последовательного подхода теперь можно установить полную кривую реакции дозы для агониста GPCR только из одного слоя клеток. Протокол последовательного агониста применяется к различным типам соединения GPCR, G_q G_i/0 или G_s и совместим с рекомбинантными и эндогенными уровнями экспрессии исследуемого рецептора. Блокирование рецепторов антагонистами GPCR также оценивается (антагонистский режим).

Введение

В этом отчете представлено подробное описание серийного протокола добавления, разработанного для количественной оценки активации рецептора белка, индуцированного Г-жа (GPCR) в правильно выращенных клетках по измерениям без этикетки импеданса. G белковые рецепторы (GPCRs) участвуют во множестве физиологических функций и заболеваний человека¹. Из-за этого и их хорошей доступности на поверхности клетки, GPCRs являются одной из наиболее важных целей наркотиков. Эта оценка находит свое отражение в, по оценкам, число 700 утвержденных препаратов, ориентированных на GPCRs, что эквивалентно 35%-ной доле на всех продаваемых препаратах^2.

Разработка новых препаратов включает в себя два центральных процесса: i) идентификацию и функциональную характеристику биологических молекул-мишеней и ii) обнаружение новых свинцовых веществ и их развитие в управляемые препараты. В обоих процессах необходимы эффективные методы количественной оценки взаимодействий с целевыми препаратами и последующего биологического реагирования. Различные этапы доклинического процесса разработки препарата используют различные методы анализа, начиная от исследований биомолекулярного взаимодействия между препаратом и мишенями, по сравнению с функциональными исследованиями клеток в культуре, экспериментами на вырезанном органном материале или целых животных. И физиологическая значимость, и биологическая сложность увеличиваются с первого до последнего^3. Хотя это общая цель, чтобы свести к минимуму эксперименты на животных, фармакологические исследования с использованием изолированных органов из лабораторных животных или даже целых животных считаются неизбежными, чтобы всесторонне охарактеризовать новых кандидатов наркотиков. С точки зрения аналитического чтения, орган фармакологии исследования обеспечивают дистальный, интегративный "целостный" функциональный ответ высокой физиологической значимости. Недостатком таких экспериментов является то, что они не совместимы с высокой пропускной способностью скрининга по техническим, а также этические причины и были в значительной степени заменены исследования, основанные на культуре клеток in vitro⁴.

Методы количественной оценки активации GPCR в клеточных культурах включают различные химические анализы на основе этикеток, которые конкретно обнаруживают вторых посланников, состояние фосфорилирования вниз по течению сигнальных белков, транскрипционную активацию через определенные транскрипционные факторы или торговлю внутриклеточными рецепторами на основе лигандов^4,5. Недостатком таких анализов на этикетке является необходимость обозначения клеток потенциально вредными красителями или радиоактивными маркерами. Это часто требует выполнения ассеа в качестве конечного определения для времени экспозиции, которое должно быть определено априори. Использование этикетки на основе конечных анализов страдает от этого очень ограниченное и предвзятое время эксперимента и риск того, что химические этикетки и зонды могут вмешиваться в регулярной физиологии клеток - потенциально незамеченным экспериментатором.

В последние годы появились анализы без этикеток для мониторинга активации GPCR, такие как методы на основе импедеданса или оптические методы, применяющие резонансные волноводы, решетки^5,6. Маркировка клеток экспериментально не требуется с этими подходами. Поскольку эти физические считыватели работают на сигналах низкой амплитуды, такие методы считаются неинвазивными, они позволяют осуществлять непрерывный мониторинг клеток потенциально в режиме реального времени, а время наблюдения ограничивается только клеточной культурой, а не считывателем. Подобно считываниям из целых органов, подходы, свободные от этике, обычно сообщают о целостных реакциях клеток, далеко вниз по течению активации рецепторов, когда интеграция по всей сигнальной сети приводит к зависящим от времени, но скорее неспецифическим изменениям в морфологии клеток или перераспределению массы. В то время как impedance основе анализов измерения диэлектрической подписи изменений в форме ячейки^7,8, измерения с помощью резонансных волнообразных решеток чувствительны к изменениям в рефракционном индексе на ячейке субстрата интерфейса, вытекающих из динамического перераспределения массы (DMR)⁹. Интегративный характер делает методы без этикетки чрезвычайно чувствительными к событиям, опосредованным рецепторами, независимо от типа (ы) белка G (G_q,G_i/0, G_s,G_12/13) или q-arrestin, участвующих в сигнальном каскаде⁶ и хорошо подходящих для эндогенных уровней экспрессии рецептора.

В стандартном без этикетке impedance основе анализ клетки adherently выращены в нескольких колодцев с копланарной пленки электродов, отложенных на дне каждого колодца¹⁰. Эти электродные массивы соединены с анализатором импеданса, и реакции клеток на экспериментальный стимул регистрируются из отдельных скважин с помощью временных показаний импеданса. В типичном асссе GPCR лиганд добавляется в индивидуально различных концентрациях к каждому отдельному человеку. Лиганд-индуцированные изменения в курсе времени impedance после этого проанализированы по отношению к характерным характеристикам кривой such as максимальная изменение сигнала, зона под кривой, изменение сигнала в пределах, котор дали интервал времени или наклон кривой на затем указанном пункте времени, для того чтобы количественно количественно потенции ligand и эффективности^11.

Стоимость электродных массивов может ограничить применение этого метода в кампаниях скрининга высокой пропускной силы (HTS). Кроме того, с увеличением числа образцов, которые должны следовать параллельно, количество индивидуальных измерений увеличивается и тем самым уменьшает разрешение времени для каждого колодца постепенно - даже для современных многоканальных записей. В таких условиях быстрая и переходная реакция клеток может избежать измерения. Кроме того, обычный хорошо - один подход концентрации налагает значительное время и фактор затрат на perfused орган-на-чипе или тело-на-чип события в отношении их пригодности в ligand-GPCR анализа взаимодействия.

По этой причине мы разработали пошаговый протокол дозирования, который позволяет записывать полную кривую реакции на дозу активации гЦКр в культурных клеточных монослойах, постоянно отслеживая препятствие одной скважины, в то время как концентрация агониста увеличивается поэтапно. Протокол последовательного агониста значительно увеличивает пропускную стоимость в скважине от одной концентрации до 10 или более концентраций, как показано на текущем примере клеток U-373 MG человека, которые эндогенно выражают рецептор гистамина 1 (H1R). Таким образом, метод имеет потенциал для значительного улучшения пропускной связи в безэтикетки доза-ответ исследований, в то время как разрешение времени сохраняется на инструментальной максимум.

протокол

1. Посев клеток на электродных массивах

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор макета электрода является компромиссом между чувствительностью и количеством исследуемых ячеек. Чем меньше электрод, тем более чувствительным является измерение, но чем меньше количество исследуемых ячеек. Для клеток, показывающих сильные колебания импеданса с течением времени в базовых условиях, более крупные или межцифровые электроды предпочтительнее.

1. Предварительно согреть все растворы, необходимые для стандартного пропуска ячеек и посева в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Для анализов с человеческими U-373 МГ клеток он принимает: фосфат буферного сольникового раствора (PBS) без кальция и магния, 0,05% (w/v) трипсин, среда клеточной культуры (Игл Минимальная основная среда (EMEM) дополнена 5% (v/v) сывороткой икроножной мышцы плода (FCS), 2 мМ L-глютамина и 100 мкг/мЛ пенициллин/стрептомицин).
2. Промыть клеточный слой фондовой культуры, выращенной на дне обычных фляг или клеточных культур ы с PBS дважды.
3. Удалить PBS, добавить раствор трипсина (1 мл на 25 см²) и пусть клетки инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин (применяется к U-373 МГ клеток).
4. Контроль для полного отрыва клеток со дна роста субстрата с помощью микроскопии.
5. Остановите реакцию трипсина, как только клетки полностью отделены, добавив 9 мл среды клеточной культуры на 1 мл трипсина в клеточную подвеску. Тщательно промыть оставшиеся клетки со дна клеточной культуры субстрата, прокладывая подвеску над подпортом.
6. Соберите клеточную подвеску с помощью пипетки и перенесите ее в центробежную трубку (15 мл или 50 мл трубки).
7. Спин вниз клетки центрифугации на 110 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
8. Тщательно удалите супернатант и тщательно приостановите клеточной гранулы в культурной среде перед подсчетом клеток (например, с помощью гемаситометра для фазовых контрастных микроскопов и ручного подсчета).
9. Отрегулируйте суспензию клетки до нужной плотности клеток. Для экспериментов с u-373 MG клетки, использовать 100 000 клеток / см² расти сливочного слоя клеток в течение 48 ч. Это приводит к плотности клеток 200 000 ячеек/мл для 8-колодных электродных массивов с областью роста 0,8 см² и объемом скважины 400 л.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для воспроизводимых экспериментов активации GPCR, клетки должны быть выращены, чтобы совмещеть монослой на электродных массивах. Для обеспечения правильного экспрессии рецепторов на поверхности клетки, клетки должны быть посеяны по крайней мере 36 ч перед выполнением эксперимента. Тестирование различных плотностей клеток для посева клеток часто имеет значение для определения лучших экспериментальных условий.
10. Добавьте клеточную подвеску к скважинам электродного массива и дайте продавцам осесть при комнатной температуре в течение 10 - 15 минут, чтобы обеспечить однородное распределение клеток на дне скважин.
11. Выращивайте клетки не менее 36 ч в стандартном инкубаторе культуры клеток с 5% CO₂ (зависит от среднего типа) при 37 градусах Цельсия и увлажненной атмосфере. Изменение культуры клеток среднего 24 ч до эксперимента.
12. В день эксперимента осмотрите слои клеток на электродных массивах по микроскопии (фазовой контрастности), чтобы обеспечить полное покрытие электродов клетками.

2. Равновесие клеток в среде, свободной от сыворотки

1. Предварительно теплая среда без сыворотки, в этом исследовании: L15 среды Лейбовица.
2. Удалить среды клеточной культуры из клеток, выращенных на электродных массивах и заменить предварительно разогретых сыворотки свободной среде. Используйте 200 зл для 8-колодных электродных массивов и 150 л для 96-колодных электродных массивов.
3. Пусть клетки уравновесить в сыворотке свободной среде на 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 2 ч. Время равновесия сильно зависит от типа ячейки. Например, U-373 MG клетки нужно 2 ч, CHO клетки должны 4 ч, BAEC может потребоваться ночное равновесие в L-15 среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: L-15 среда CO₂ независима и требует CO_{2-свободной}атмосферы. Для уравновешись в L-15 установите инкубатор до 0 % CO_2. Равновесие может контролироваться с помощью показаний импеданса, которые мы рекомендуем делать для первых экспериментов.

3. Мониторинг уравновешизм клеток с показаниями импеданса

1. Поместите электродный массив в держатель соединительного массива анализатора импеданса.
2. Обеспечить надлежащий низкий контакт с импедедантом между электродами и анализатором импедеданса. Эта проверка индивидуально отличается для различных инструментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если прибор не в состоянии сделать подключение к электродам, открыть контактзательный зажим снова, сделать электрод массивдля для правильного позиционирования внутри держателя и повторной попытки.
3. Выберите тип электрода и/или формат мульти-хорошего из пользовательского интерфейса программного обеспечения.
4. Настройка параметров измерения. Доступны различные варианты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выбрать наиболее чувствительную частоту переменного тока, мы ссылаемся на литературу и руководство по инструментам, поскольку это зависит от макета электрода и исследуемого типа клеток. Как правило, частота зондирования находится в диапазоне 4 кГц - 50 кГц. Здесь клетки U-373 MG выращивались на круглых рабочих электродах диаметром 250 мкм и отслеживались с частотой переменного тока 12 кГц.
   1. Если доступны режимы сбора одно- и нескольких частотных данных, выберите режим единой частоты, чтобы обеспечить максимальное разрешение времени. Измерение будет проводиться на этой одной частоте. Для наиболее широко распространенных инструментов, есть ряд заданных частот вдоль доступного окна частоты.
   2. Если количество исследуемых скважин низкое или разрешение времени не является критическим, выберите несколько частотных записей. Показания impedance на определенном количестве частот будут записаны для каждого колодца для последующего углубленного анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение времени уменьшается с увеличением числа частот, зарегистрированных на скважину, и увеличением числа скважин. Варианты выбора режима частоты и сбора данных варьируются в зависимости от типа инструмента и версии.
5. Начало получения данных о курсе времени.
6. Следуйте за импеданом клеточного слоя (не менее 2 ч) до тех пор, пока импеданс не стабилизируется. В то же время, подготовить агонистовые решения.
7. Когда слои клеток достигли стабильного уровня импеданса, либо (i) переходите к последовательному агонисту в рамках того же эксперимента или (ii) прекращают сбор данных и запускают новый набор данных для мониторинга активации рецепторов, вызванных агонистом.

4. Подготовка агонистовых решений для экспериментов в агонистике

1. Рассчитайте концентрацию агонистовых растворов по мере необходимости для каждого шага последовательной дозирования в соответствии с уравнением (1). n колеблется от 1 до общего числа серийных дополнений i. x, обозначает концентрацию и объем в скважине на шаг n. y, обозначает концентрацию и объем "решения к быть добавленной" в шаге n.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим количество репликаций и вычислите общий объем "решения, которые будут добавлены" для каждого шага концентрации. Результаты типичного расчета приведены в таблицах 1-4. Требуется общее представление о агонистике диапазона концентрации, который будет изучен, поскольку диапазон определяет концентрации и количество частей, которые будут вводиться во время последовательного добавления. Используя протокол последовательного дополнения агониста, концентрация агониста увеличивается поэтапно. Таким образом, количество агониста уже в колодце, когда следующая доза добавляется должен быть принят во внимание. Когда количество молекул агониста, уже присутствующих в колодце, составляет n_x q c _x x x (с текущей концентрацией c_x и объемом V_x)и количество молекул в колодце после следующего добавления n_x'y, количество молекул, которые будут добавлены n_y, определяется концентрацией c_y и объемом V_y решения, который будет применяться к хорошо_(n y y y_y). После добавления порции агониста, новое количество молекул агониста в колодце: c _x'y Этот расчет применяется для каждого последующего шага. Из-за взаимозависимости концентрации агониста в скважине и количества агониста в порциях, которые будут добавляться с каждого шага, важно определить окончательные концентрации после каждого шага заранее.

Режим 1: Объем в скважине будет увеличиваться с каждым шагом по мере непрерывного добавления жидкости.
Используя этот режим и 8-колодец формат, используйте V_x1 200 л и V_{y1 ....} V_yi 30 qL.

Режим 2: Объем в скважине является постоянным, так как объем, добавленный с каждым шагом, удаляется непосредственно перед последующим добавлением.
Используя этот режим и 96-колодский формат, используйте V_x1 и 150 л и V_{y1 ....} V_yi 75 qL.

2. Печать листа данных с общим объемом на концентрацию и подробные инструкции по пайпеттингу.
3. Подготовьте все решения в необходимом количестве. Сделайте все агонистовые растворы в той же среде, свободной от сыворотки, что и для уравновешения клеток.
   ВНИМАНИЕ: Дигидрохлорид гистамина считается опасным стандартом связи OSHA 2012 (29 CFR 1910.1200). Гистамин вызывает раздражение кожи, серьезное раздражение глаз, может вызвать аллергическую кожную реакцию, аллергию, симптомы астмы или затрудненное дыхание при вдыхании и может вызвать раздражение дыхательных путей. Пожалуйста, рассмотрим лист данных о безопасности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сделать агонист решения как можно более свежими. Стабильность агонистов в растворе может значительно различаться. Храните растворы при 4 градусах цельсия или ниже до использования в эксперименте. Для некоторых молекул могут быть рассмотрены дополнительные стабилизирующие добавки, такие как BSA при использовании молекул на основе пептида или липидов, для предотвращения адсорбции на стенки колодцев и труб.
4. При выполнении эксперимента в формате 96 скважин перенесите растворы на обычную 96-пуговую пластину (без электродов) и используйте 8- (или 12-) канал пипетку для быстрого перехода жидкости в электродный массив.

5. Подготовка агонистовых решений для эксперимента в режиме антагонист

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте антагонистрешение раствор (ы) с концентрацией, которая будет применяться во всем. Объем и концентрация антагонистского раствора зависят от режима агониста (1 или 2). Примеры для экспериментов в формате 8-ну или 96-ну в дополнительном режиме 2: (A) 8-ну ну колодец формат (V_x1 200 л, V_{Антагонист} 200 Л); (B) 96-колодец формат (V_x1 150 л, V_{Антагонист} No 75 qL).

1. Рассчитайте концентрацию каждого агониста, необходимого для каждого шага последовательной дозировки, как описано в шаге 4.1.
2. Сделайте все агонистовые растворы в той же среде, свободной от сыворотки, используемой для уравновешивания клеток, и добавьте антагониста в той же конечной концентрации, что и планировалось для соответствующих скважин в эксперименте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае раствор гистамина (10 мМ) готовится в среде L-15. Когда агонисты растворяются в других растворителях (например, диметил сульфоксид (DMSO), этанол) контроль растворителя должен быть включен для учета увеличения нагрузки растворителя с каждым шагом добавления.

6. Выполнение протокола последовательного добавления в агонистике режиме

1. Начало сбора данных, описанное в шагах 3.1 - 3.5.
2. Предварительно разогреть агонист решения до использования, поместив их в инкубатор около 10 - 15 минут до добавления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании термо-лабильных веществ, растворы не должны храниться при 37 градусах Цельсия слишком долго. Если предварительное потепление в течение 10 - 15 минут считается критическим, довести решения до 37 градусов по Цельсию незадолго до добавления в водяной бане.
3. Выполнить агонист серийного дозирования в зависимости от выбранного режима добавления. После режима 1 общий объем в колодце увеличивается с каждым добавлением следующей дозы. В режиме 2 тот же объем, который добавляется с каждым шагом, также удаляется снова перед добавлением следующей более высокой дозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для уравновешивания клеточного слоя между двумя последующими дозами агониста, зависит от времени отклика клеток. Первоначальный эксперимент в параллельном режиме (одна хорошо - одна концентрация) показывает (i) время отклика клеток для различных концентраций агониста и (ii) наиболее чувствительный параметр кривой (например, максимальный импеданс, импеданс после времени x).

A: Режим 1 / 8-ну хорошо формат

1. Добавьте 30 кЛ первого раствора с наименьшей концентрацией агониста к клеткам, которые были уравновешваны в 200 л среды, свободной от сыворотки.
2. Пусть клетки реагируют и уравновеш— в течение заранее определенного периода времени (например, 15 мин).
3. Добавьте 30 кл второго раствора со следующей более высокой концентрацией.
4. Повторите шаги 6.3.1-6.3.3 с третьим, четвертым и так далее, агонистным решением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с 10 шагами концентрации приведет к общему объему 500 qL в конце эксперимента, что чуть ниже максимально применимого объема этих скважин в 550 евро.

B: Режим 2 / 96-ну колодец формат

ПРИМЕЧАНИЕ: Пауза обработки данных во время каждого шага обработки жидкости (дополнение / удаление) с помощью программного обеспечения impedance инструмента при запуске экспериментов в формате 96-ну хорошо. Более сложная обработка жидкости может помешать получению данных. Используйте многоканальный пипетка.

1. Приостановить получение данных.
2. Добавьте 75 кЛ первого раствора с наименьшей концентрацией агониста к клеткам, которые были уравновешваны в 150 л среды, свободной от сыворотки.
3. Возобновить сбор данных.
4. Пусть клетки реагируют и уравновеш— в течение заранее определенного периода времени (например, 15 мин).
5. Примерно за 1 - 2 мин до окончания регулярного времени равновесия, приостановите измерение и удалите 75 л из каждой скважины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время, в которое решение должно быть удалено, зависит от количества скважин, контролируемых параллельно, и скорости трубации. Время, необходимое для удаления решений, не должно превышать время между последующими шагами.
6. Добавьте 75 кл второго раствора со следующей более высокой концентрацией и возобновите измерение.
7. Повторите шаги 6.3.8-6.3.10 с третьим, четвертым и так далее, агонистным решением.

7. Выполнение протокола серийного добавления в режиме антагониста

1. Начало измерения, описанного в шагах 3.1 - 3.5.
2. Во время уравновешения клеточных слоев подготовьте антагонист-раствор (например, 200 л из 1,5 мл димедромного гидрохлорида в среде L15).
   ВНИМАНИЕ: Димедрол гидрохлорид имеет потенциальные острые последствия для здоровья. Это вредно, если проглотить или вдыхать, может вызвать раздражение глаз и кожи. Это может вызвать раздражение дыхательных путей и пищеварительного тракта. Пожалуйста, рассмотрим лист данных о безопасности.
3. Предварительно разогреть антагонист и агонист решения, поместив их в инкубатор около 10 - 15 минут до добавления к клеточной культуры (ср. 6.2). Если в ассоциатив включены колодцы без антагониста, то предварительно теплая среда без сыворотки.
4. Добавьте антагонистское решение в назначенные скважины. Пусть клетки уравновеш— антагонист от 15 до 20 мин. Если включены скважины, свободные от антагониста, добавьте к этим скважинам тот же объем среды, свободной от сыворотки.
5. Согласно антагонист дополнение в режиме 2, удалить решение из скважин
   (A) 8-колодец формат (200 Л)
   (B) формат 96-ну колодец (75 л)
6. Выполнить агонист дополнение последовательность, описанную в шаге 6.3.

8. Экспорт и анализ данных

1. Экспортные данные с использованием программного обеспечения инструмента impedance для преобразования всех записанных данных из несвободных в общие форматы данных (например, csv). Этот шаг позволяет реорганизовать данные и презентацию с другими пакетами программного обеспечения.
2. Загрузите данные csv-форматированных в программное обеспечение для анализа научных данных.
3. Нормализовать значения impedance путем вычесть impedance последней точки данных перед первым добавлением агониста разрешения и путем устанавливать время добавления к t q 0. Участок времени курс нормализованного импеданса.
4. Участок отдельных курсов времени и определить максиму в impedance после каждого шага добавления. Составьте лист данных с этими значениями.
5. Участок значения максимального (или минимального, если применимо) изменения импеданса как функция концентрации агониста. Это может быть сделано для отдельных скважин или для средних (средний sD).
6. Используйте режим установки данных для определения полумаксимальных эффективных концентраций (EC₅₀₎и максимального ответа (E_Max)с помощью четырех параметров логистической модели (уравнение 2):

ПРИМЕЧАНИЕ: c указывает на агонист концентрации, A₁ является минимальным и ₂ является максимальным asymptote сигмоидальной дозы-ответ кривой (A₂ и E_Макс). EC₅₀ является концентрацией в точке перегиба кривой, и n соответствует склону холма.

Результаты

Типичная схема для подготовки различных агонистовых решений показана для эксперимента с использованием 8-колодных электродных массивов с гистамином в качестве агониста в таблицах 1-4. Таблица 1 и таблица 2 представляют объемы и концентрации для эксперимента ?...

Обсуждение

Этот протокол описывает метод для измерения импеданса без этикетки для определения отношения доза-реакции активации гЦКр в отсутствие или наличии конкретных антагонистов для одного и того же рецептора. Доказательство концепции этого метода было представлено в недавней публикации

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bürker counting chamber	Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany)	640210
cell culture flasks 25 cm2	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Centrifuge (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Diphenhydramine hydrochloride	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D3630
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D5671
Impedance Instrument (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\
8-well electrode Arrays (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)
96-well electrode arrays (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom (Berlin, Germany)	S0615
Histamine dihydrochloride	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	4017.1
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	51022515	class II safety cabinet
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	21083-027
L-glutamine	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	G7513
Micropipette large (100 - 1000 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704780
Micropipette large (20 - 200 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704778
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)	Nikon (Düsseldorf, Germany)
Penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	P0781
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D8537
Pipette, serological	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	607 180
Pipettor (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Germany)	26300
Trypsin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	T4174	in PBS with 1 mM EDTA
Tube, 15 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	188 271
Tube, 50 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	210 261
U-373 MG cells	ATCC (Rockville, MD, USA)	ATCC HTB-17
water bath (TW21)	Julabo (Seelbach, Germany)	\