Комбинированные Условный Нокдаун и Адаптированные Сфера Формирование Анализ для изучения Stemness-Ассоциированный ген пациента полученных стволовых клеток рака желудка

Резюме

В этом протоколе мы представляем экспериментальную конструкцию с использованием условной нокдаунной системы и адаптированного анализа формирования сферы для изучения влияния кластерина на ствольность ГКС, полученных пациентом. Протокол может быть легко адаптирован для изучения как in vitro, так и in vivo функции генов, связанных со стволом, в различных типах CSC.

Аннотация

Раковые стволовые клетки (ККС) вовлечены в инициирование опухоли, развитие и рецидив после лечения, и стали центром внимания многих исследований в последние десятилетия. Поэтому важно разработать методы исследования роли ключевых генов, участвующих в стволе раковых клеток. Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных и смертных видов рака. Стволовые клетки рака желудка (GCSCs), как полагают, корень рецидива рака желудка, метастазы и лекарственной устойчивости. Понимание биологии GCSCs необходимо для продвижения разработки целевых методов лечения и, в конечном итоге, для снижения смертности среди пациентов. В этом протоколе мы представляем экспериментальную конструкцию с использованием условной нокдаунной системы и адаптированного анализа формирования сферы для изучения влияния кластерина на ствольность ГКС, полученных пациентом. Протокол может быть легко адаптирован для изучения как in vitro, так и in vivo функции генов, связанных со стволом, в различных типах CSC.

Введение

Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных и смертных видов рака¹. Несмотря на достижения в комбинированной хирургии, химиотерапии и лучевой терапии в терапии GC, прогноз остается плохим и пятилетнюю выживаемость по-прежнему очень низка². Рецидив и метастазы являются основными причинами смерти после лечения.

Раковые стволовые клетки (CSCs) являются подмножеством раковых клеток, которые обладают способностью к самообновлению и генерации различных клеточных линий, которые воссоздают^{опухоль 3}. CSCs, как полагают, несет ответственность за рецидив рака и метастазы из-за их возможности самооб обновления и посева новых опухолей, а также их устойчивость к традиционной химиотерапии и^{радиотерапевтии 4}. Таким образом, ориентация на CSCs и устранение CSCs обеспечивают захватывающий потенциал для улучшения лечения и снижения смертности онкологических больных.

CSCs были изолированы от многих типов твердых опухолей^5. В 2009 году стволовые клетки рака желудка (GCSCs), изолированные от линий раковых клеток человека, были первоначально описаны Takaishi et al.^6. Чэнь и его коллеги впервые определили и очищали GCSCs от аденокарциномы желудка человека (GAC) опухолевых тканей⁷. Эти выводы не только дают возможность изучать биологию GCSCs, но и обеспечивают большое клиническое значение.

Особенностью ККС является их способность формировать сферу^8. Одиночные клетки поцаряются в неадхерентных условиях при низкой плотности, и только клетки, одержимые самообъемом, могут вырасти в твердое сферическое скопление, называемое сферой. Таким образом, анализ формирования сферы был расценен как анализ золотого стандарта и широко используется для оценки потенциала самообжиления стволовых клеток in vitro.

РНК-интерференция (РНК) является мощным инструментом исследования для изучения функции генов путем нокдауна конкретного гена^9. Тем не менее, долгосрочные стабильные технологии нокдауна генов имеют определенные ограничения, такие как проблема изучения функции гена, который имеет важное значение для выживания клеток. Условные системы РНК могут быть полезны для downregulation желаемых генов в височной и / или специально контролируемой образом администрации индуцирующего агента. Тетрациклин (Tet)-неуявимые системы являются одной из наиболее широко используемых условных систем РНК¹⁰. Системы Tet-inducible могут навести глушитель гена цели путем контролировать выражение shRNA на добавлении exogenous индуктора (преимущественно doxycycline, Dox). Системы Tet-inducible можно разделить на два типа: Tet-On или Tet-Off. Выражение shRNA может быть включено (Tet-On) или выключено (Tet-Off) в присутствии индуктора. В системе Tet-ON без индуктора, constitutively выраженный репрессор Tet (TetR) связывает к последовательности Tet-responsive элемента (TRE) содержа Tet-отзывчивый Pol III-зависимый промоутер для выражения shRNA, таким образом подавляя выражение shRNA. В то время как после добавления Dox, TetR улавливлен от Tet-реакции Pol III-зависимого промоутера. Это облегчает экспрессию шРНК и приводит к гену нокдаун.

Протокол, описанный здесь использует функциональную тетрациклин-индуцированную shRNA систему и адаптированный анализ формирования сферы для изучения функции кластерина в пациент-производных GCSCs. Clusterin был определен как новая ключевая молекула для поддержания стволовости и выживания GCSCs в предыдущем^{исследовании 11}. Мы используем описанный протокол для изучения влияния кластерина в самообувечении GCSCs. Эта методология также применима к другим типам раковых стволовых клеток.

протокол

Все эксперименты с использованием пациентов полученных стволовых клеток рака желудка, описанных в этом был одобрен местным комитетом по этике⁷.

1. Культура стволовых клеток рака желудка

1. Подготовка GCSCs полной среды культуры
   1. Подготовка GCSCs полной среды культуры, добавив свежие DME / F12 среды со следующими основными ингредиентами: 20 нг / мл EGF, 10 нг / мл bFGF, 1% Инсулин / Трансферрин / натрий селенит, 0,2% глюкозы, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% несущественных аминокислот, 10 МК 2-меркаптоэтанол, 0,75 мг/мл NaHCO₃, 10 МК тиоглицерол, 100 МЕ/ МЛ пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина. Фильтр и стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: GCSCs полная среда культуры рекомендуется хранить предпочтительно не более двух недель при 4 градусов по Цельсию.
2. Восстановление ГККС и культуры
   ПРИМЕЧАНИЕ: GCSCs были получены следующим образом: Образцы опухоли были подвергнуты механической и энзиматической диссоциации. Одноклеточные суспензии были получены путем фильтрации с нейлоновой сеткой из хорошо разбросанной подвески. Полученные раковые клетки были выучты в GCSCs Complete Culture Medium, а некоторые клетки выросли до сфер. Затем эти сферы подверглись энзиматической диссоциации, и GCSC можно получить с помощью цитофторометрической сортировки популяции клеток, окрашенных маркерами CD44/CD54. Подробный протокол и функциональные анализы GCSCs были зарегистрированы⁷.
   1. Предварительно теплые GCSCs завершить культуру среды при 37 градусов по Цельсию, не более 30 мин.
   2. Разморозить GCSCs от жидкого хранения азота и быстро оттаивать криовиалы в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Держите закрученного флаконы, пока все содержимое тает полностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оттепель замороженных клеток быстро (Lt;1 мин) в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
   3. Перенесите все содержимое криовилов в 15 мл центрифуги трубки, содержащей 10 мл GCSCs полной культуры среды. Центрифуга при 800 x g в течение 5 мин на RT.
   4. Аспирировать супернатант тщательно и приостановить ячейки гранулы в 10 мл свежих GCSCs полной среде. Плита клеточной суспензии в 100 мм чашки Петри. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в 5% CO_{2 инкубатора} и добавить 5 мл свежей полной среде на третий день.
3. Субкультура опухолевыхсфер GCSCs
   ПРИМЕЧАНИЕ: GCSCs центра tumorspheres только имеют достаточные питательные вещества перед размером сфер расти до 80-100 мкм в диаметре. После того, как темные и низкие сферы рефракционности появляются (около 6 дней культуры), необходимо субкультуры опухолевыхсфер.
   1. Встряхните блюдо осторожно и передать GCSCs опухолевой культуры среды (средних и непритяжки опухолевыхсфер) в стерильные 15 мл центрифуги трубки. Для больших средних объемов могут потребоваться более крупные центрифуги.
   2. Центрифуга при 600 х г в течение 5 мин и тщательно распоряжаться супернатантом. После центрифугации будет видна небелая гранула.
   3. Добавьте 2 мл раствора диссоциации клеток, чтобы повторно использовать гранулы для механической и энзиматической диссоциации при 37 градусах Цельсия. Аккуратно трубят вверх и вниз 10 раз каждые 2-3 минуты в процедуре пищеварения, чтобы разбить сферы друг от друга, пока опухолевые сферы не будут рассеяны в одноклеточную подвеску. Этот общий процесс диссоциации рекомендуется менее 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните визуальную проверку под микроскопом, чтобы подтвердить, что больших сфер или клеточных агрегатов не остается.
   4. Добавьте 10 мл свежей предварительно разогретой GCSCs полной культуры среды (5x объем клеточного раствора отряда), чтобы прекратить процедуру пищеварения и центрифуги на 800 х г на RT в течение 5 мин.
   5. Откажитесь от супернатанта и повторно посовела клетки с помощью 1 мл свежей предварительно разогретой GCSCs полной среды культуры. Семя соответствующее количество клеток в новую 100 мм Петри блюдо с 10 мл свежих предварительно разогретых GCSCs полной культуры среды и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂.
   6. Refeed tumorspheres культур после 3 дней, добавив 5 мл свежей предварительно разогретой полной среде. Через 6 дней проходные клетки, когда опухолевыесферы вырастают до 80-100 мкм в диаметре.
4. Криоконсервация ГККС
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не криопресервные клетки GCSCs, добавляя средние к опухолевыхсфер напрямую. GCSCs tumorspheres должны быть переварены в одиночные клетки, так что клеточный защитный агент может войти в каждую клетку, чтобы обеспечить долгосрочное стабильное хранение клеток. Убедитесь, что клетки находятся в здоровой ситуации и без загрязнения.
   1. Урожай GCSCs опухолевыхсфер. Центрифуга по 600 х г в течение 5 мин.
   2. Отбросьте супернатант и добавьте 2 мл раствора диссоциации клеток, чтобы разъедать опухолевые области GCSCs при 37 градусах Цельсия. Прекратите процедуру пищеварения, добавив 10 мл GCSCs полной среды культуры.
   3. Центрифуга на 800 х г в течение 5 минут и собирать одиночные GCSCs.
   4. Аккуратно приостанавливайте GCSCs с криоконсервативной средой без сыворотки. Рекомендуемая окончательная концентрация составляет 5 х 10⁵ - 5 х 10⁶ клеток/мл.
   5. Выпределите подвесную клетку в 1 мл aliquots в отмеченные криогенные флаконы.
   6. Немедленно поместите криовиалы, содержащие клетки, в изопропаноловую камеру и храните их при -80 градусов по Цельсию. Перенесите флаконы в жидкий азот на следующий день для длительного хранения.

2. Поколение неудобоваемых нокдаун GCSCs линий

ВНИМАНИЕ: Рекомбинантные лентивирусы были назначены в качестве организмов уровня 2 Национальным институтом здравоохранения и Центром по контролю заболеваний. Работа с лентивирусом требует обслуживания объекта уровня биобезопасности 2, учитывая, что вирусные супернатанты, производимые этими лентивирусными системами, могут содержать потенциально опасный рекомбинантный вирус.

1. Поколение частиц лентивируса
   1. Синтезировать 2 лентивирусных вектора, несущих неизгладимую шРНК, нацеленную на человеческий кластерин, и нецелевый контрольный лентивирусный вектор (GV307) от GeneChem на основе конструкции таблицы 1 (вектор GV307 содержит: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
   2. Семя 4 х 10⁶ 293T ленти-вирусных упаковочных клеток в 100 мм Петри блюдо с 10 мл DMEM дополняется 10% плода бычьей сыворотки.
   3. Инкубировать 293T клетки на ночь при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂. Убедитесь, что плотность клеток 293T составляет около 50-80% стечения в день трансфекции.
   4. Довнесите пониженную среду сыворотки до комнатной температуры и приготовьте трубку А и трубку B, как описано в таблице 2.
   5. Перенесите трубку А в трубку B, хорошо перемешайте и инкубировать комплексы в течение 20 минут при комнатной температуре для подготовки липидо-ДНК комплексов.
   6. Удалите 5 мл среды, прежде чем добавлять липидо-ДНК комплекс, оставляя в общей сложности 5 мл.
   7. Добавить 5 мл липидо-ДНК комплекса в культуру блюдо dropwise и осторожно вихрем блюдо распространять комплекс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно обойтись жидкостью против стенки блюда, чтобы избежать тревожных 293T клеток.
   8. Инкубационое блюдо культуры для 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂.
   9. Через 24 часа после трансфекции аккуратно удалите трансфекцию среды и аккуратно замените 10 мл предварительно разогретого DMEM, дополненного 10% FBS. Инкубационный в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все supernatant и советы должны рассматриваться с 10% отбеливатель до удаления.
   10. Примерно через 48 часов после трансфекции, урожай 10 мл лентивируссодержащих супернатантов.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Все сосуды и кончики клеточной культуры должны быть обработаны 10% отбеливателем до удаления.
   11. Фильтр лентивирусный супернатант с помощью фильтра поры 0,45 мкм для удаления клеточного мусора.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Все фильтры и шприцы должны быть обработаны 10% отбеливателя до удаления.
   12. Перенесите уточненный супернатант в стерильный контейнер, добавьте концентратор Lenti-X (1/3 тома очищенного супернатанта) для смешивания нежной инверсией.
   13. Инкубировать смесь при 4 градусах по Цельсию на ночь.
   14. Образцы центрифуги при 1500 х г в течение 45 мин при 4 градусах Цельсия. После центрифугации, и небелые гранулы будут видны. Аккуратно удалите супернатант, заботясь о том, чтобы не беспокоить гранулы.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Все supernatant и советы должны рассматриваться с 10% отбеливатель до удаления.
   15. Аккуратно перерасходовать гранулы в 1 мл DMEM дополняется 10% FBS в качестве вирусного запаса, хранить при -80 градусов по Цельсию.
2. Поколение стабильных трансфицированных клеточных линий
   1. Семя 6 х 10⁶ GCSCs в 100 мм Петри блюдо с 10 мл DMEM дополнен 10% FBS для 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ (70-80% слияния до инфекции).
   2. Аспирировать среду в блюде, добавить концентрированные лентивирусные частицы, разбавленные 4 мл полной среды DMEM, содержащей полибренский реагент (5 мкг/мл) в блюдо. Инкубационный на 18 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация полибрена зависит от типа клеток и, возможно, потребуется проверить в различных концентрациях, чтобы решить эффективные концентрации. В противном случае, это может быть эмпирически определено, как правило, в диапазоне 2-10 мкг/мл. Все трубки и кончики должны быть обработаны 10% отбеливателя до удаления.
   3. Изменение среды, заменить 10 мл DMEM с 10% FBS среднего и инкубировать на 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все средние и советы должны быть обработаны 10% отбеливатель до удаления.
   4. Аспирировать супернатант с клеточным мусором, заменить свежим DMEM дополнен 10% FBS среды, содержащей пуромицин (2,5 мкг/мл) и инкубировать в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂. Затем замените свежий DMEM, дополненный 10% FBS среды, содержащей пуромицин (5 мкг/мл) и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ для дополнительных 24 ч.
   5. Промыть адепт GCSCs дважды с 5 мл DPBS без кальция и магния.
   6. Разобщить GCSCs с 1 мл предварительно разогретого раствора диссоциации клеток и инкубировать 2-3 мин при 37 градусов по Цельсию.
   7. Добавьте 5 мл свежей предварительно разогретой GCSCs полной культуры среды к подвеске клетки.
   8. Раздай 3 мл в центробеченную трубку 15 мл (трубку А) для криоконсервирования клеток, а остальные 3 мл в центробежную трубку 15 мл (трубку В) для индуцирования доксициклином.
   9. Центрифугная трубка А и трубка В по 800 х г в течение 5 мин.
   10. Повторно посовещая гранулы трубки А с 1 мл криоконсервативной среды без сыворотки, перенесите флакон на -80 градусов по Цельсию на ночь и удалите его в жидкое хранилище азота.
   11. Аспирировать супернатант и повторно израсходовать клетки трубки B в 1 мл свежей предварительно разогретой GCSCs полной среды культуры. Семя соответствующее количество клеток в новый 100 мм Петри блюдо 10 мл свежих предварительно разогретых GCSCs полной культуры среды с доксициклиного (Dox) (2,5 мкг / мл) и инкубации для 48 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация Dox может варьироваться между линиями клеток. Каждая линия клеток должна быть протестирована в различных концентрациях Докса, чтобы определить эффективные концентрации для KD и токсичности на клетках.
   12. Подтвердите стабильные репрессии clusterin в GCSCs западным blotting.

3. Анализ формирования сферы

1. Оттепель замороженных неудобовательно нокдаун GCSCs линий (см. шаг 1.2).
2. Определите жизнеспособную плотность клеток образца 10 йл с помощью автоматизированного счетчика клеток.
3. Отрегулируйте громкость с предварительно разогретой GCSCs полной среды культуры, чтобы получить концентрацию 2 х^{10 4 жизнеспособных} клеток / мл.
4. Обойтись в 3 новых 96-ну ультра-низкой крепления культуры пластины скважин (0,1 мл / хорошо) каждой группы.
5. Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию с 5% CO₂. Формирование сферы должно происходить в течение 3-10 дней. Мониторинг и запись визуализации образования опухолевыхсфер каждые 2 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда не рекомендуется менять в случае какого-либо нарушения образования опухолевыхсфер. Эти опухолевыесферы следует легко отличить от одиночных и агрегированных клеток.
6. Определите результаты формирования опухолевой системы, оценив размеры сформированных опухолевыхсфер с помощью программного обеспечения для визуализации.

Результаты

Стволовые клетки рака желудка из первичной аденокарциномы желудка человека были выучинены в среде культуры, свободной от сыворотки. Через 6 дней клетки расширились от одноклеточного фенотипа(рисунок 1А)до больших сфер(рисунок 1

Обсуждение

ГК является третьей по величине причиной смерти, связанной с раком, во всем мире. GCSCs имеют решающее значение в рецидив рака желудка, метастазы и лекарственной устойчивости. Использование GCSCs от больных раком желудка позволит нам исследовать их слабое место и разработать целевые препар?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1