Индукция смерти мозга у мышей с использованием внутриартериального мониторинга кровяного давления и вентиляции через трахеостомию

Резюме

Мы представляем муриновую модель индукции смерти мозга для оценки влияния его патофизиологического воздействия на органы, а также на последовательные трансплантаты в контексте сплошной трансплантации органов.

Аннотация

В то время как живое пожертвование и донорство после смерти в кровеносном организме предоставляют альтернативные возможности для трансплантации органов, донорство после смерти донора мозга (БД) по-прежнему является основным источником твердых трансплантаций. К сожалению, необратимая потеря функции мозга, как известно, вызывают несколько патофизиологических изменений, в том числе гемодинамических, а также гормональные изменения, наконец, приводит к системной воспалительной реакции. Модели, позволяющие систематически исследует эти эффекты in vivo, скудны. Мы представляем мурин модель индукции BD, которая могла бы помочь расследования разрушительных последствий BD на качество аллотрансплантата. После проведения внутриартериального измерения артериального давления через общую сонной артерии и надежную вентиляцию через трахеостомию, БД индуцируется постоянно растущим внутричерепным давлением с помощью катетера воздушного шара. Через четыре часа после индукции БД органы могут быть собраны для анализа или для дальнейших процедур трансплантации. Наша стратегия позволяет провести всесторонний анализ донорского БД в модели мурин, что позволяет углубленное понимание связанных с БД эффектов при трансплантации твердых органов и потенциально прокладывает путь к оптимизации предки органов.

Введение

Трансплантация в настоящее время является единственным лечебным лечением для отказа органов на конечную стадию. До сих пор, смерть мозга (BD) пациенты были основным источником для донорства органов, хотя живое пожертвование и пожертвование после смерти кровообращения являются ценными альтернативами¹. БД определяется необратимой комой (с известной причиной), отсутствием стволовых рефлексов мозга и апноэ². К сожалению, органы BD демонстрируют более низкие результаты в долгосрочном выживании трансплантата независимо от человеческого антигена лейкоцита (HLA)-несоответствие и холодное ишемическое время³. Между тем, интенсивные исследования по этому антиген-независимый фактор риска было проведено в результате трех основных аспектов патофизиологических изменений опосредовано в результате БД: гемодинамические, гормональные, и воспалительные⁴.

На сегодняшний день экспериментальные модели BD у грызунов в основном выполняются с использованием крыс. Для того, чтобы получить более глубокое понимание иммунологических последствий для твердых органов после БД, мы стремились создать модель murine BD, так как в настоящее время только мыши модели позволяют всестороннее расследование генетических или иммунологических факторов. В этом контексте система мыши предоставляет более широкий спектр аналитических инструментов.

Принцип индукции БД, описанный здесь, основан на увеличении внутричерепного давления, вызванного инфляцией катетера воздушного шара, вставленного под череп. Повышенное внутричерепное давление имитирует физиологический механизм БД, блокируя перфузию головного мозга, мозжечка и ствола мозга^5,,6. Для обеспечения достаточного перфузии периферических органов, измерение артериального давления является обязательным во время процедуры. Катетер, используемый для этой цели, в то же время служит для сосудистого введения для стабилизации артериального давления путем замены жидкости. Поскольку БД сопровождается прекращением спонтанного дыхания, необходима достаточная вентиляция легких. Электрическое одеяло поддерживает физиологическую температуру тела ядра.

Таким образом, эта модель позволит углубленного исследования влияния BD-индуцированной травмы, на миграции лейкоцитов⁷, комплимент активации⁸, ишемическая реперфузионная травма⁹, и другие факторы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперименты на животных проводились в соответствии с принципами лабораторного ухода за животными, разработанными Национальным обществом медицинских исследований и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, подготовленным Национальной академией наук и опубликованным Национальными институтами здравоохранения (публикация NO 86-23, пересмотренный в 1985 году). Все эксперименты были одобрены Министерством образования, науки и культуры Австрии (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).

1. Артериальная катетеризация

1. Анестезия мыши с интраперитонеальной инъекции кетамина и ксилазина¹⁰ и анальгетик в соответствии с местной практикой (например, бупренорфин).  Pinch задние конечности с щипками, чтобы подтвердить правильную глубину анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования использовались мыши C57BL/6N в возрасте от 8 до 12 недель (вес 20–25 г). Авторы протестировали мужской BALB/c того же возраста безуспешно, но не пробовали другие штаммы (см. Обсуждение).
2. Удалите волосы в интересующих регионах (голова, шея) с помощью электрической бритвы. Убедитесь, что не осталось свободных волос, чтобы предотвратить раневого загрязнения. Затем дезинфицировать хирургическое поле с 70% этанол / хлоргексидин / бетадин и место мыши supine с головой перед хирургом.
3. Сделайте разрез средней линии шейки матки с рассекающими ножницами.
4. Вскрыть подчелюстные железы и ткани шеи мышечной ткани и отделить их для того, чтобы разоблачить общую сонную артерию. Используйте в основном тупой рассечение через щипки.
5. Место три 8-0 шелковые лигатуры под правой общей сонной артерией.
6. Поместите зажим на проксимальной лигатуре и принести напряжение в артерии так, что поток подвешивается.
7. Закройте самую дистальную лигатуру.
8. Вставьте артериальный катетер через небольшое, предварительно сформированное отверстие кожи на черепном аспекте разреза. Сожмите и деформируйте просвет катетера, если он кажется слишком большим, чтобы уменьшить приток крови. Зафиксировать со всеми тремя лигатурами.
9. Прикрепите катетер к коже, чтобы избежать вывиха. Сделайте это с помощью шва (например, 5-0 монофилом, неабсорбируемый), который соединяет катетер с кожей в области предварительно сформированного отверстия кожи.

2. Трахеостомия

1. Вскрыть предтрахеальной мускулатуры прямо с помощью щипки.
2. Место два 8-0 шелковые лигатуры под трахеей.
3. Трахеотомизировать с помощью микро ножниц как можно более проксимически, чтобы избежать односторонней вентиляции. Используйте горизонтальную линию резки между двумя трахеальными хрящами.
4. Вставьте вентиляционную трубку и зафиксировать с обеих подготовленных лигатур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проксимальный конец трахеи не должен быть ligated.
5. Закройте кожу бегущим швом (например, 6-0 монофилом, неабсорбируемым).
6. Вентиваю мышь с частотой 150/мин и приливным объемом 200 л.

3. Индукция смерти мозга

1. Расположите мышь в положении склонного.
2. Удалить кожу из черепа с помощью хирургических ножниц и щипцы, чтобы держать кожу.
3. Просверлите скважину калибра 1 мм парамедиалло над левой теменной корой. Прекратите бурение перед нарушением внутренней компактной кости и дюра-матер.
4. Проникают в окончательный тканевый мост черепа с помощью тупых щипц, удаляя острые края.
5. Вставьте воздушный шар катетер, так что это полностью в полости черепа. Убедитесь, что воздушный шар предварительно заполнен сольнием и весь воздух эвакуирован.
6. Начните инфляцию на уровне 0,1 мл/мин в течение 10-15 мин (общий объем 0,8-1,2 мл) с помощью шприского насоса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь будет проявлять миоклон, мидриаз, дальнейшее захват деятельности и агональных вздохов.
7. Произносите мыши мозга мертвым, как только хвост мыши пошел жесткой и возведен.
   ПРИМЕЧАНИЕ: BD подтверждается характерным начальным пиком артериального давления (Cushing reflex), отсутствием стволовых рефлексов мозга и спонтанным дыханием. Регулярное тестирование апноэ следует избегать во время экспериментов, как мышей может стать кровообращения нестабильной из-за недостатка кислорода.
8. Остановите инфляцию катетера воздушного шара.
9. Положите отопительное одеяло над мышью, чтобы избежать переохлаждения.

4. В период БД

1. Регулярно отслеживайте и документируйте артериальное давление. Исключить мышей с длительной гипотензивной фазой (среднее артериальное давление (MAP) (MAP) (мят) на 50 мм рт. ст.
2. Настоять 0,1 мл солья каждые 30 минут, чтобы стабилизировать кровяное давление мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 0,8 мл соля было введено к каждой мыши в этом исследовании.
3. После 4 ч продолжительности BD, урожай органов мыши / тканей. Исключите мышь из эксперимента, если сердце мыши не бьется в конце эксперимента.

5. Процедура Шама

1. Выполните шаги 1.1'3.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не открывайте внутреннюю компактную кость. Не вставляйте и не надувайте катетер воздушного шара.
2. Оставайтесь рядом с мышью и постоянно наблюдайте за животным. Неоднократно щипать задние конечности с щипками, чтобы подтвердить правильную глубину анестезии. Примените дополнительную анестезию подкожно (примерно 1/2 от стартовой дозы), если мышь показывает признаки пробуждения, что, по нашему опыту, происходит примерно после 2/3 ч после анестезии.
3. Нанесите такое же количество внутривенного солика, как и у BD мышей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивная мышь восстановит спонтанное дыхание после прекращения вентиляции. Мышь BD не будет. Тестирование апноэ должно быть сделано при создании модели, но во время экспериментов его следует избегать из-за ненужного физиологического стресса.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Модель murine BD была успешно выполнена более 100 раз с показателем успеха более 90%. Кроме того, после интервенционной трансплантации органов сердца и почек было безопасно выполнено⁷.

BD вызывает различные патофизиологические из...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

BD, фактор риска для качества аллотрансплантата у многоорганных доноров, влечет за собой множество патофизиологических изменений, которые могут быть достаточно оценены с использованием моделей in vivo. Гемодинамические изменения, цитокин буря, гормональные изменения и их конечное влияни...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G)	BD	391349
Blood Pressure Transducers (APT300)	Harvard Apparatus Inc.	73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3	Edwards Lifesciences Corporation	120403F
Forceps	FST	11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus Inc.	55-7020
Ketansol	Graeub	6680110
Micro scissor	FST	15018-10
Needle holder	FST	12060-02
Prolene 5-0	Ethicon	8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single	Harvard Apparatus Inc.	70-4500
Scissor	FST	14075-11
Stereotactic microscope	Olympus	SZX7
Transpore Tape	3M	1527-1
Underpads	Molinea.A	274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845)	Harvard Apparatus Inc.	73-0043
Xylasol	Graeub	7630109