Улучшенная жизнеспособность для Ex vivo 3D гидрогелевых культур ксенотрансплантатов, полученных пациентами, в переливной микрофлюидной платформе

Резюме

Этот протокол демонстрирует методы, позволяющие расширенную культуру in vitro ксенотрансплантатов пациентов (PDX). Один из шагов повышает общую жизнеспособность многоклеточных кластерных культур в 3D гидрогелях, путем прямого удаления не жизнеспособных одиночных клеток. Вторичный шаг демонстрирует лучшие практики для культуры PDX в перфлитированных микрофлюидных платформ.

Аннотация

Ксенотрансплантаты пациентов (PDX), генерируемые при ресектировании опухолевой ткани пациента, присвякаются непосредственно в иммунокомпромиссных мышей, остаются биологически стабильными, тем самым сохраняя молекулярные, генетические и гистологические особенности, а также неоднородность первоначальной опухоли. Однако использование этих моделей для проведения множества экспериментов, включая скрининг на наркотики, является непомерно высоким как с точки зрения затрат, так и с точки зрения времени. Трехмерные (3D) системы культуры широко рассматриваются как платформы, в которых раковые клетки сохраняют свою биологическую целостность посредством биохимических взаимодействий, морфологии и архитектуры. Наша команда имеет большой опыт культивирования клеток PDX in vitro с использованием 3D матриц, состоящих из гиалуроновой кислоты (HA). Для того, чтобы отделить мышь фибробластов стромальных клеток, связанных с PDXs, мы используем культуру вращения, где стромальные клетки придерживаются поверхности ткани культуры обработанных пластин в то время как диссоциированные клетки опухоли PDX плавать и самостоятельно ассоциировать в многоклеточных кластеров. Кроме того, плавающие в supernatant являются одними, часто мертвые клетки, которые представляют собой проблему в сборе жизнеспособных кластеров PDX для инкапсуляции вниз по течению в гидрогели для 3D-клеточной культуры. Для того, чтобы отделить эти одиночные клетки от живых клеточных кластеров, мы использовали градиентную центрифугирование плотности. Описанный здесь протокол допускает истощение не жизнеспособных одиночных клеток из здоровой популяции клеточных кластеров, которые будут использоваться для дальнейших экспериментов в пробирке. В наших исследованиях мы включаем 3D-культуры в микрофлюидные пластины, которые позволяют перфузии средств массовой информации во время культуры. После оценки результатных культур с использованием флуоресцентного изображения на основе анализа жизнеспособности очищенных по сравнению с неочищенные клетки, наши результаты показывают, что этот дополнительный шаг разделения существенно сократили число нежизнеспособных клеток из наших культур.

Введение

За последнее десятилетие, область исследований рака продемонстрировала новый энтузиазм для пациентов, полученных ксенотрансплантатов (PDXs) в качестве инструмента для оценки рака клеток пути опоры и лекарственной^{восприимчивости 1}. Наиболее распространенные модели PDX устанавливаются подкожной или ортопедической имплантацией опухолевых клеток человека – фрагментом опухоли, скоплением диссоциированных опухолевых клеток или образцом изолированных циркулирующих опухолевых клеток (КТК) — в хозяина грызунов. Если опухоль "взять" успешно, ксенотрансплантат клетки будут размножаться, васкуляризации, и в противном случае взаимодействовать с принимающей ткани для создания опухоли, которые могут быть собраны при оптимальном размере, подразделяется, и повторно имплантированы в других хозяев. Среди их многочисленных преимуществ в качестве модели системы, PDXs обычно сохраняют значительную часть неоднородности популяции опухолевых клеток и позволяют оценить человека конкретных путей и клеточных^{реакций 2,3}. Контекст in vivo позволяет взаимодействие опухоли с сосудами и другими смежными стромами и резюмирует характеристики тканей, такие как динамика диффузии наркотиков, кислородное напряжение и внеклеточное матричное влияние, которое биологически и механически влияет на прогрессирование опухоли. Негативным аспектом PDX является их зависимость от грызунов хозяина, как для расширения опухоли и в конечном итоге для тестирования гипотез. Поскольку многие PDX не могут адаптироваться к традиционной двумерной (2D) культуре тканей полистирола, не теряя при этом многих из своих желательных характеристик, существует минимальная середина для исследователей между этим относительно контролируемым методом in vitro, и значительным увеличением расходов, средств и требований времени для использования in vivo PDX.

Мы описали несколько моделей in vitro, которые реализуют культуру 3D клеток в рамках поддерживающей матрицы, а недавно расширили эту работу, чтобы продемонстрировать культуру ex vivo множественного рака простаты (PCa) полученных PDXs, как в одиночку, так и в совместной культуре с костным мозгом полученных^{фибробластов 4,5}. Гиалуроновая кислота (HA) на основе гидрогеля матрицы обеспечивают настраиваемую и биологически релевантную поддержку для обоих типов клеток, с поверхностным контролем над характеристиками гидрогеля и оптической ясности для визуализации через гидрогель^{глубины 6}.

Зрелые опухолевые ткани PDX состоят из переменной смеси неоднородных раковых клеток человека и стромы мыши (фибробласты, эндотелиальные клетки и т.д.). Для изучения клеточного типа конкретных вкладов в прогрессирование опухоли в пробирке, это может быть выгодно, чтобы отделить опухоли, отделить популяции клеток, и экспериментально включить их в организованном порядке, чтобы вскрыть пути межклеточной связи. Смешанные популяции клеток в тканях дигестатов имеют дифференциальную совместимость с конкретными культурными условиями. Например, связанная с опухолью фибробластная жизнеспособность требует либо поверхностного присоединения, либо 3D матриц, функционируют с лигандами интегрина, в то время как эпителиальные клетки PDX обычно не имеют этих требований, вместо этого отдающих предпочтение взаимодействиям клеток и клеток. Эти различия могут быть использованы для достижения эффективного отделения клеток PDX от загрязняющих мыши стромальных клеток. Культура вращения тканей дигеста позволяет стромальной клеточной приверженности поверхности культуры тканей в то время как клеточные спайки диск PDX клетки, плавающие над вращающейся поверхностью культуры, чтобы сформировать многоклеточные кластеры в супернатант в 24-48 ч. Специфические характеристики этих скоплений варьируются в зависимости от PDX (например, большие, плотные, высокосферические кластеры или меньшие, более свободные агрегаты, напоминающие гроздь винограда), но, как правило, имеют биологически релевантные размеры (диаметр 50–250 мкм), достаточные для оценки клеточных взаимодействий, которые опираются на межклеточные контакты.

Поиск и обработка опухолей неизбежно приводит к определенной степени сопутствующей гибели клеток либо из-за кратковременного повреждения в результате механических/энзиматических нарушений, либо к длительной несовместимости субпопуляций с выбранными культурными условиями. Несмотря на полезность культуры вращения как первоначального массового разделения, мертвые или умирающие клетки неизбежно передаются с кластерами PDX и могут влиять на связанную с этим культуру. Эти мертвые клетки часто являются отдельными клетками PDX, которые не были интегрированы в кластер, мыши стромальные фибробласты, которые не могут выжить в определенных условиях культуры, или особенно хрупкие эндотелиальные клетки. Такие умирающие клетки могут влиять на экспериментальные результаты "выживших" и могут существенно влиять на количественную оценку, например, с помощью анализов флуоресцентного скрининга жизнеспособности на основе изображений. Чтобы улучшить выбор живых клеток PDX из этого метода, мы адаптировали методы центрифугации с шагами плотности, чтобы легко удалить отдельные мертвые/умирающие клетки из смесей PDX и сохранить преимущественно живые многоклеточные кластеры.

Для повышения изучения результатов PDX полученных кластеров в 3D-культуре, мы использовали микрофлюиды основе перфузии культуры платформы, OrganoPlate (Рисунок 1), который является высокой пропускной способностью орган-на-чипе платформы, которая позволяет для одновременной культуры до 96 отдельных проникнуты, 3D культур на 384-ну микротитер пластины базы (^,Рисунок 1A)⁷.⁸ В 2-полосной микрофлюидной пластине один чип ткани соединен двумя микрофлюидными каналами(рисунок 1B,гель-канал: красный, перфузионый канал: синий), которые охватывают четыре скважины подряд. Два микрофлюидных канала разделены коротким пластиковым хребтом под названием Phaseguide, который предотвращает переполнение одного канала в соседний соседний канал, и одновременно позволяет без мембраны интерфейс между содержимым геля и перфузии^{канала 9}. Поскольку дно микрофлюидной пластины состоит из микроскопического стекла, культуры можно рассматривать в окне наблюдения через дно пластины со стандартным или автоматизированным микроскопом. Перфузия устанавливается в микрофлюидной пластине с программируемой рокер, используя гравитацию для привода средств массовой информации через микрофлюидные каналы, междускважинами резервуара (рисунок 1C). Перфузионный поток-мимикрирует более тесно recapitulates микроокноронности опухоли, чем статическая культура, что позволяет для включения стресса стрижки и расширение распределения газов и питательных веществ. Преимущества поддержания перфлитой культуры раковых клеток в микрофлюидной пластине ранее были описаны как переплетаются культуры рака молочной железы выставлены оптимальной жизнеспособности по сравнению со статической 3D-культуры тех же^{клеток 7}.

В настоящем докладе описывается адаптированный метод центрифугирования плотности для изоляции живых многоклеточных кластеров PDX и демонстрируется его полезность в создании 3D культур PDX в пределах перфузируемых микрофлюидных пластин. Поскольку все большее число исследовательских лабораторий ищут методы для облегчения использования PDX, мы ожидаем, что представленные здесь протоколы будут иметь непосредственную полезность.

протокол

Опухолевая ткань была получена с согласия пациента и в соответствии с утвержденным протоколом Институционального совета по обзору (IRB). Ксенотрансплантаты были имплантированы, выращены и собраны в соответствии с принятым институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC).

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся работа должна быть выполнена в стерильном биологическом шкафу безопасности для поддержания стерильности. Все шаги должны проводиться при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовка материалов для обработки PDX

1. Автоклавы миппы и скальпель ручка или лезвия бритвы.
2. Раствор фермента диссоциации оттепели при температуре 4 градусов по Цельсию на ночь или при комнатной температуре в тот же день, что и диссоциация тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таяние при 37 градусов по Цельсию не рекомендуется, так как это может инактивировать некоторые диссоциации ферментов.
3. Подготовьте не менее 100 мл среды культуры PDX (модифицированная смесь среднего питательного вещества Eagle Dulbecco F-12 «DMEM-F12» со 100 U/mL пенициллином и стрептомицином и 30% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и не менее 25 мл среды обработки PDX (DMEM-F12 со 100 U/mL пенициллином и стрептомицином и без FBS). Хранить при 4 градусов по Цельсию до готовности к использованию.

2. Диссоциация PDX и первоначальная очистка стромального компонента

1. Соберите автоклавную посуду, 70 мкм клеточных ситечкой (2х3), 60 мм круглых тканей культуры посуды (2), 6-хорошо ткани культуры пластины, стерильные 50 мл конической центрифуги трубки, и стерильные 1x фосфат-буферный солевой раствор (PBS). Теплая культура среднего до 37 градусов по Цельсию и позволяют диссоциации фермента раствор прийти к комнатной температуре.
2. Когда ткань PDX достигла диаметра 1,0-1,5 см в мышиного хозяина, хирургическим путем удалить опухоль из мыши стандартными средствами (например, под принятой анестезией) и хранить на льду в 50 мл трубки с PDX культурысреды (рисунок 2A). Обработать ткани быстро, через шаги ниже, чтобы максимизировать жизнеспособность клеток, предпочтительно в течение 1'2 ч после сбора урожая.
3. Передача опухолевой ткани в предварительно взвешенную стерильную коническую трубку 50 мл. Промыть 6x с 30 мл стерильных PBS для удаления крови и загрязняющих веществ. Удалите как можно больше жидкости и взвесить опухолевые ткани.
4. Передача опухолевой ткани в 60 мм круглые ткани культуры блюдо и фарш в 1^{мм 3 штук с} помощью стерильного лезвия бритвы или скальпеля.
5. Добавьте 5 мл среды обработки PDX для сбора опухолевой суспензии и перенесите в новую стерильную трубку 50 мл. Промыть культуру блюдо с другой 5 мл PDX обработки среды, а затем с диссоциации фермента раствора (10 мл / г опухоли, по крайней мере 5 мл), добавив все полоскания в 50 мл трубки.
6. Инкубировать 20 мин при 37 градусов по Цельсию с нежной тряской. Закружить трубку мягко на полпути через инкубацио время.
7. Pipette вверх и вниз мягко с серологическим пипеткой, чтобы разбить сгустки. Фильтр-клетки с 70-метровым ситечком клеток помещаются над новой стерильной трубкой 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться более одного ситечко.
8. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин для гранулированных клеток. Удалите супернатант и повторное перерасход в 2-3 мл среды культуры PDX. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
9. Используйте таблицу 1 для оценки необходимого количества диссоциированных клеток, полученных из PDX, необходимых для достижения желаемой плотности клеток на чип.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения в таблице 1 предназначены для отправной точки. Фактические значения будут варьироваться в зависимости от жизнеспособности тканей / клеточной и потери клеток от замораживания / восстановления. Опухоли PDX являются отдельными лицами даже в пределах данного типа рака, поэтому эти значения должны быть скорректированы эмпирически.
10. Из числа, рассчитанного в шаге 2.9, пластина 1'2 x 10^{6 клеток} в 5 мл среды культуры PDX на колодец пластины культуры 6-хорошо ткани. Инкубационный (37 градусов по Цельсию, 5% CO₂, влажность 95%) для 48 ч с нежной тряской (50-55 об/мин) для содействия образованию кластера(рисунок 2B). После формирования кластера переходите к разделу 3 для центрифугации.
11. Cryopreserve неиспользованные клетки PDX от первоначальной диссоциации в 50% FBS - 40% DMEM-F12 - 10% диметилсуфсид (DMSO) или коммерчески доступной среде замораживания первичных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приверженцы мыши стромальных клеток также могут быть извлечены из поверхности пластины ткани, при желании, путем полоскания кратко с культурой среды и расширения стандартными средствами.
12. Для более позднего использования криоконсервированных опухолевых клеток PDX/мышиной стромы, талых клеток в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин. Подсчитайте и плита в плите культуры 6-хорошо ткани как описано в шаге 2.10 перед продолжать к разделу 3. Увеличьте количество ячеек PDX на 20%, чтобы учесть потери жизнеспособности от криоконсервации.

3. Отделение кластеров, полученных из PDX, на основе градиентной центрифугации от одиночных ячеек

1. Приготовьте 20 мл градиентного раствора 100% плотности, тщательно смешивая 18 мл раствора градиентной центрифугации плотности с 2 мл стерильного 10x хэнксового сбалансированного соленого раствора (HBSS) в стерильной конической трубке 50 мл. Сделать 10 мл каждый из 20%, 30%, 40%, и 55% плотность градиентных решений путем разбавления этого 100% раствора с стерильным 1x HBSS и смешивания хорошо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этих объемов достаточно для двух градиентов 15 мл, которые могут быть использованы для размечения 15 х 10^{6 ячеек} каждый. При разделении менее 15 х 10^{6 ячеек} второй градиент следует использовать в качестве баланса для центрифугации.
2. Добавьте 3 мл градиентного раствора плотности 55% на дно конической трубки 15 мл. Удерживая трубку под углом, очень осторожно слой 3 мл 40% плотности градиентного раствора на верхней части 55% слоя, медленно распределяя жидкость на угловой стороне трубки, чтобы избежать смешивания слоев. Повторите с градиентом плотности 30%.
3. Соберите супернатант культур вращения PDX с помощью серологического пипетки 5 мл, мягко опоясыв поверхность пластины. Центрифуга при 200 x g в течение 2 мин к гранулам.
4. Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в 3 мл градиентного раствора плотности 20% в зависимости от количества градиентов, необходимых для разъединю клеток. Тщательно слой 20% плотность градиентного раствора с клетками на верхней части градиента (ы). Если только с помощью одной градиентной трубки для клеток, верхней баланс градиентной трубки с клеткой, свободной 20% плотность градиентного раствора.
5. Крышка трубки и центрифуги в качели ведро ротор центрифуги в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию, 2000 хг , и 0 тормоза.
6. После центрифугации будут видны фракции(рисунок 2C). Соберите 2,3 мл фракций в свежие трубы 15 мл. Добавьте 3,4 тома стерильного 1x HBSS к каждой фракции и инвертировать, чтобы тщательно перемешать.
7. Центрифуга при 1000 х г в течение 3 мин для гранулированных клеток. Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в 1-2 мл среды обработки PDX.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособные кластеры ячеек PDX обычно находятся на интерфейсе градиентного решения плотности 40-55%(рисунок 2D)с одиночными мертвыми/умирающими ячейками, накапливаемыми на интерфейсе градиентного решения плотности 20-40% для большинства протестированных PDX.
8. Удалите небольшую репрезентативную алицитацию (50–100 мкл) для повторной диссоциации с равным объемом раствора фермента диссоциации для оценки количества клеток в кластерной клеточной суспензии. Подсчитайте клетки с гемоцитометром или автоматизированным счетчиком клеток.

4. Гидрогель подготовки и микрофлюидных пластин посева

1. Восстановленные гидрогельные растворы HA (тиол-модифицированный HA, HA-SH; тиол-реактивный полиэтиленгликоль диакрилат, PEGDA) в соответствии с инструкциями производителя.
2. Используя многоканальный пипетку, добавьте 50 л HBSS ко всем скважинам в столбцах окна наблюдения (колонка 3, 7, 11, 15, 19, 23) 2-полосной микрофлюидной пластины для поддержания влажности культуры и оптимальных условий визуализации.
3. Рассчитайте объем клеточной суспензии из раздела 3, необходимого для 50 МКЛ гидрогеля при желаемой плотности клеток (т.е. 5000 клеток/КЛ). Для посева одной микрофлюидной пластины, aliquot рассчитанный объем в каждом из 4 стерильных 1,5 мл центрифуг трубки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: HA гидрогели имеют фиксированное время для гелеобразования. Отрегулируйте объем гелеобразующих растворов aliquots для эффективности пользователя при диспансеризации, если происходит преждевременное гелеобразование.
4. Отрегулируйте рН раствора HA-SH до 8.0 с 1 N NaOH непосредственно перед использованием. Выполните тест гелеобразования путем смешивания 40 МКЛ HA-SH с 10 йл PEGDA и мониторинга гелеобразования с течением времени. Гелация обычно начинается через 5-8 минут после смешивания HA-SH с кросслинкером PEGDA.
5. Центрифуга клеточной подвески aliquots в течение 2 мин (200 х г, комнатная температура) гранулы клеток. Тщательно удалите супернатантные и повторное течение клеток в соответствующем объеме HA-SH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный гидрогель 4:1 HA-SH:PEGDA решение (по объему), поэтому клетки должны быть повторно использованы в 40 йл HA-SH для 50 йл конечного объема.
6. Добавьте 10 МКЛ PEGDA к одной алиците клеток в HA. Хорошо перемешайте и подождите 1-3 мин (в зависимости от времени геля от шага 4.4) перед посевом микрофлюидной пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение гелеобразной реакции начала перед посевом помогает свести к минимуму оседание клеток.
7. Прикрепите наконечник для распределения объемов 1,5 мкл к одному каналу, повторяющего пипетку, и загрузите ячейками в растворе гидрогеля HA. Не забудьте сохранить гидрогель aliquot хорошо смешанные для обеспечения равномерного распределения клеток.
8. Чтобы посеять микрофлюидную пластину, выровнять наконечник пипетки перпендикулярно пластине, аккуратно поместив кончик в центр входного геля (колонки 1, 5, 9, 13, 17, 21), чтобы обеспечить контакт, но без давления при дозирования раствора гидрогеля. Работая быстро, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание гидрогеля, обойтись 1,5 мл гель раствора в каждом входе геля.
9. Наблюдайте за состоянием заполнения микрофлюидных каналов, просматривая с верхней части пластины, нижней части пластины, или микроскопом, и оценить нагрузку, используя рисунок 3 в качестве руководства (успешная загрузка на рисунке 3A, пипетное позиционирование руководство на рисунке 3B, пропущенная загрузка на рисунке 3C, не заполнены до конца на рисунке 3D, переполнение на рисунке 3E). Определите любые необходимые корректировки в технике, которые могут улучшить успех заполнения для следующего раунда чипов (см. обсуждение советов по устранению неполадок).
10. Повторите шаги 4.6-4.9 с оставшимися 3 aliquots ячеек в растворе HA. Инвертировать пластину при подготовке следующего aliquot (1 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мин время ожидания и инверсии пластины улучшить 3D распределение клеток за счет сокращения клеток урегулирования, как гелеобразование происходит.
11. После того, как все микросхемы будут заполнены, инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию во влажном инкубаторе до тех пор, пока гелеобразование не будет завершено (45 мин).
12. Используя предоставленное руководство, убедитесь, что перфузионная рокер установлена в инкубаторе культуры клеток с правильными настройками перфузии (угол 14 градусов, интервалы 4 мин).
13. Добавьте 50 МКЛ среды культуры PDX ко всем средним входам (колонки 2, 6, 10, 14, 18, 22) и проверьте, заполнены ли каналы должным образом, перелистыв пластину. Аккуратно коснитесь пластины о поверхность, чтобы стимулировать жидкость для заполнения микрофлюидных каналов.
14. Добавьте 50 МКЛ DMEM-F12 (10% FBS) для всех средних точек (колонка 4, 8, 12, 16, 20, 24). Если какие-либо пузырьки воздуха оказались в ловушке в канале перфузии, удалите, осторожно нажав пластины против поверхности.
15. Использование микроскопа и формы макета пластины(Дополнительный рисунок 1), запись чип заполнения успеха. Исключите неправильно заполненные чипы из дальнейшего экспериментального использования.
16. Поместите пластину на наклонный рокер, установленный на наклон 14 "и 4 мин цикла, чтобы начать перфузии. Заменить PDX культуры среды каждые 2 дня (сначала 50 йл в входе, а затем 50 йл в розетке).

5. Окрашивание клеток, визуализация и количественная оценка изображений

1. Подготовьте клеточное решение для анализа жизнеспособности, содержащее три флуоресцентных красителя (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, кальциин ацетоксиметил (AM).
   1. Подготовка фондовых растворов каждого красителя следующим образом: Hoechst 33342 при 1,6 мМ (1 мг/мл) в деионизированной воде; кальцеин АМ на 4 мм в ангидроусе ДМСО; этидий гомодимер-1 на 2 мМм в ДМСО/Н₂O (1:4, в/в).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовый кальцеин AM и этидий гомодимер-1 решения предоставляются в отмеченном комплекте в таблице материалов.
   2. Подготовье единого рабочего решения в среде HBSS или фенола, свободной от фенола, содержащей все три красителя. Оптимизируйте окончательную рабочую концентрацию для каждого типа клетки и матрицы в пределах 1,6–8,0 МКМ для Hoechst 33342, 0,1–10 МКМ для кальцеина AM и 0,1–10 МКм для ethidium homodimer-1.
2. Удалите культурную среду и примените решение для красителя рабочей жизнеспособности к желаемым микрофлюидным чипам (75 МКЛ в входе, 25 л в розетке) и поместите обратно на перфузионную рокер в инкубаторе клеточной культуры на 1 ч.
3. Изображение окна наблюдения окрашенных культур с помощью ручного или автоматизированного конфокального микроскопа (Таблица материалов) с флуоресцентными фильтрами (перечисленные как возбуждение / выброс длин волн, в нм) наблюдать все ядра (Hoechst 33342, 350/461), ядра мертвых клеток (ethidium homodimer-1, 528/617) и цитоплазму живых клеток (calcein AM, 494/517).
4. Захват 140 мкм-стеки с размером шага ≤1 мкм с помощью 20x воздушной цели. Для изображения всего микроканал с небольшим количеством перекрытия необходимы три поля зрения. Чтобы избежать двойной выборки, изображение только два поля зрения на чип.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия визуализации должны быть оптимизированы для обеспечения надлежащей выборки NyQuist. По опыту авторов, быстрая система визуализации, основанная либо на деконволюции обычного источника эпифлуоресценции, либо в режиме резонансного сканирования на конфокаляции, необходима для полного анализа полного стека, с тремя лазерными цветами, через 96 фишек на пластине в течение разумного периода времени (примерно 3,5 ч с автоматизированной визуализацией, включая установку).
5. Используя программное обеспечение для анализа изображений, проконсализуйте изображения, полученные с помощью q-stack, для получения желаемых количественных данных, таких как морфология, состояние агрегации или другие функции. Для количественной оценки жизнеспособности клеток подсчитайте количество мертвых клеток (красных) и общих ядер клеток (голубых).

Результаты

Программируемый перфузионый рокер был подготовлен в стандартном инкубаторе культуры клеток с водяным гнездом, а двухполосные микрофлюидные пластины были подготовлены в стандартном кабинете биобезопасности дляпогрузки (рисунок 1). MDA-PCA-118b PDX опухоль была расширена in vivo...

Обсуждение

Здесь мы описываем метод обработки и культивирования жизнеспособных опухолевых клеток, полученных PDX, в высокой пропускной способности, пролитой 3D-культуре. Хотя этот протокол использует PCa PDX ткани, он одинаково эффективен для других эпителиальных полученных опухолей. Характеристики ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable