Направленная сборка эластиноподобных белков в определенные супрамолекулярные структуры и грузовую инкапсуляцию In Vitro

Резюме

На стыке органических и aqueous растворителей, с учетом амфифилических эластиноподобных белков, собираемых в сложные надмолекулярные структуры, такие как пузырьки, волокна и коацерваты, вызванные экологическими параметрами. Описанные протоколы сборки дают Белковые Мембраны на основе Сравнения (PMBCs) с настраиваемыми свойствами, что позволяет инкапсуляции различных грузов.

Аннотация

Специализированные белковые строительные блоки являются универсальными кандидатами для сборки надмолекулярных структур, таких как минимальные клетки, средства доставки лекарств и ферментные леса. Благодаря своей биосовместимости и тюнике на генетическом уровне, эластиновые белки (ELP) являются идеальными строительными блоками для биотехнологического и биомедицинского применения. Тем не менее, сборка протеиновых надмолекулярных структур с различными физиохимическими свойствами и хорошим инкапсуляционным потенциалом остается сложной задачей.

Здесь мы предоставляем два эффективных протокола для управляемой самосборки амфифилических ELPs в надмолекулярные белковые архитектуры, такие как сферические коакерваты, волокна и стабильные пузырьки. Представленные протоколы сборки генерируют белковые мембранные компоненты (PMBCs) на основе ELPs с адаптируемыми физикохимическими свойствами. PMBCs продемонстрировать фазовое поведение разделения и выявить метод зависимых мембранных синтеза и способны инкапсулировать химически разнообразные флуоресцентные молекулы груза. В результате PMBCs имеют высокий потенциал применения в качестве платформы разработки и доставки наркотиков, искусственных клеток, и разрозненные пространства реакции.

Введение

Сборка надмолекулярных структур для биотехнологических применений становится все более важной^{1,,2,,3,,4,,5}. Для сборки функциональных архитектур, таких как коацерваты, пузырьки и волокна с желаемыми физикохимическими свойствами, важно понимать и контролировать физико-химические и конформационные свойства компонентов. Благодаря молекулярной точности молекул, найденных в природе, строительные блоки для надмолекулярных структур все чаще основаны на липидах, нуклеиновых кислотах или белках. По сравнению с синтетическими полимерами, белковые строительные блоки позволяют точно контролировать возникающие надрамолекулярные структуры⁶ на генетическом уровне. Первичная аминокислота (аа) последовательность отдельных блоков здания протеина внутренне кодирует информацию для их потенциала агрегата от молекулярного до макроскопического уровня также, как трехмерная форма и физические свойства окончательной надмолекулярной структуры^7.

Сообщаемые методы сборки различных надмолекулярных структур часто связаны с амфифильные белки, такие как чувствительные к температуре эластиновые белки (ELP)^5,8,9, рекомбинантный олеозин¹⁰и искусственный белок амфифилов¹¹. Методы срабатывания температуры привели к сборке мицеллей^4,10,12Волокон¹³Листы¹⁴и везикулы^9,15,16. Применяются методы, связанные с органическими растворителями, для формирования динамических белковых пузырьков^8,11,14. До сих пор применяемые протоколы для формирования везикулчастой часто не имеют контроля сборки над сборками размером с микрометр^16,17или имеют ограниченный урожай сборки⁵. Кроме того, некоторые сообщили ELP на основе пузырьков имеют нарушения инкапсуляции потенциал¹²или ограниченная стабильность с течением времени⁹. Устранение этих недостатков, представленные протоколы позволяют самосборку микрометра и субмикрометрового размера надмолекулярных структур с различными физиохимическими свойствами, хорошим потенциалом инкапсуляции и длительной стабильностью. Специализированные амфифилические ELPs собираются в надмолекулярные структуры, охватывающие диапазон от сферических коацерватов и высоко упорядоченных витой волокна пучки униламеллярных пузырьков в зависимости от прикладного протокола и связанных с ними условий окружающей среды. Большие везикулярные белковые мембранные сосульки (PMBC) выявляют все основные фенотипы, такие как мембранное слияние и поведение фазового разделения, аналогичное липосомам. PMBCs эффективно инкапсулировать химически разнообразные флуоресцентные молекулы груза, которые могут контролироваться с помощью простой эпифлюоресценции микроскопии. Повторяющиеся области ELP, используемые в данном исследовании, являются привлекательными строительными блоками для супрамолекулярных архитектур на основе белка¹⁸. ELP pentapeptide repeat unit (VPGVG), как известно, переносит различные аа, кроме пролина на четвертой позиции (valine, V), сохраняя при этом свои структурные и функциональные свойства¹⁹. Конструкция амфифильных ELPs, содержащая отличительные гидрофильные и гидрофобные домены, была реализована путем вставки остатков гостя aa (X) в повтор ЕС VPGXG с ярко выраженной гидрофобичностью, полярностью и зарядом²⁰. Амфифильные области ELP, где оснащены гидрофобных фенилаланин (F) или изолейцин (I), в то время как гидрофильный домен содержал заряженную глутаминовую кислоту (E) или аргинин (R) в качестве остатков гостя. Список подходящих амфифилических конструкций ELP и соответствующих последовательностей aa можно найти в дополнительной информации и ссылках^8,21. Все строительные блоки, где оснащены либо небольшими флуоресцентными красителями или флуоресцентными белками для визуализации с помощью флуоресценции микроскопии. mEGFP и другие флуоресцентные белки были N-терминально слиты с гидрофильных доменов амфифилов ELP. Органические красители были спряжены с помощью медь-свободного штамма способствовали алкин-азид цикловуда (SPAAC) в совместное переводно введены неестественные аминокислоты (UAA). Сотрансляционная инкорпорация UAApara-азидофенилаланин (pAzF)²²позволяет N-терминал модификации гидрофильных домен ELP. Таким образом, зеленый флуоресцентный краситель BDP-FL-PEG₄-DBCO (BDP) или любой небольшой флуоресцентной молекулы с напряженной циклоктин может быть использован в качестве флуоресцентного зонда. Успешное включение UAA pAzF и циклоaddition красителя через SPAAC может быть легко подтверждено с помощью LC-MS/MS благодаря эффективной ионизации соответствующих триптических пептидов⁸. Этот небольшой органический краситель был применен для расширения выбора растворителя для протоколов сборки, так как флуоресцентные белки несовместимы с большинством органических растворителей. Ниже описаны два наиболее эффективных протокола сборки надмолекулярных структур, разработанных в нашей лаборатории. Метод отеков THF совместим только с органическим красителем модифицированных амфифилических ELP. В отличие от этого, метод экструзии 1-бутанол (BuOH) совместим со многими белками, как флуоресцентный зонд, например, mEGFP, так как описанный метод полностью сохраняет флуоресценцию этих белков синтеза. Кроме того, инкапсуляция малых молекул и везикулярное поведение синтеза лучше всего работает, используя метод экструзии BuOH.

протокол

1. Проектирование и клонирование амфифильных эластиноподобных белков (ELPs)

1. Клон и дизайн конструкций, как описано в другом месте^8,20. Плазмиды доступны по запросу.

2. Выражение белка, очищение и приготовление

1. Выражение F20E20-mEGFP и F20E20-mCherry
   1. Прививать основную культуру выражения от ночной предкультуры до OD₆₀₀ из 0,3. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 200 об/мин в стерильной среде LB 400 мл, дополненной присваиваемыми антибиотиками в 2 л колбе.
   2. Подготовьте акционерное решение IPTG (1 M) для индукции культуры экспрессии в ультрачистой воде.
   3. При достижения OD₆₀₀ 0.5-0.8 добавьте IPTG к культуре выражения к конечной концентрации 1 мМ и снижайте температуру инкубации до 20 градусов по Цельсию. Разрешить выражение при 20 градусах по Цельсию в течение примерно 20 ч при 200 об/мин.
2. Выражение амфифилического ELP, содержащего UAA pAzF
   1. Прививать основную культуру выражения от ночной E. coli pre-culture, содержащей две плазмиды pEVOL pAzF и, например, pET28-NMBL-(TAG)R40F20-его до OD₆₀₀ 0.3 (см. дополнительную информацию для аминокислотных последовательностей). Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 200 об/мин в стерильной среде LB 400 мл, дополненной канамицином и хлорамфениколом в 2 л колбе.
   2. Приготовьте 100 мМ пасетного раствора в ультрачистой воде. Для 10 мл бульонного раствора ПАЗФ, весят 206,2 мг ПАЗИ и повторно применяем его в 8 мл ультрачистой воды. Чтобы растворить pAzF поднять рН раствора с 3 M NaOH и тщательно перемешать. При растворении ПАУЗ внимательно опустите рН до 10,5 и добавьте ультрачистую воду до конечного объема в 10 мл. Используйте стерильный фильтр (0,22 мкм) и подайте раствор в 2 мл реакционных труб.
   3. Приготовьте 1 M штуч-раствор IPTG в ультрачистой воде и 20% растворе арабинозы в ультрачистой воде.
   4. При достижения OD₆₀₀ 0.5-0.8 добавьте pAzF к культуре выражения к окончательной концентрации 2 мМ. Инкубировать культуру в течение 10 мин, 37 КВ, 200 об/мин, чтобы обеспечить поглощение ПАЗФ.
   5. Индуцировать экспрессию целевого белка и экспрессию необходимого синтеза tRNA/t-RNA при одновременном добавлении IPTG (1 мМ) и арабинозы (2%) и снизить температуру инкубации до 20 градусов по Цельсию.
   6. Разрешить выражение при 20 градусах по Цельсию в течение примерно 20 ч при 200 об/мин. Культура выражения урожая при центрифугации при 4 градусах по Цельсию, 4000 х г,40 мин.
3. Лиза и очистки белка
   1. Отстегивайте пеллеты E. coli в буфере излисебя (10 мл на литр культуры; 50 мМ Tris-HCl pH 8, 500 мМ NaCl, 4 M мочевины, 0,25% Triton X-100), содержащие лисозим (0,1 мг/мл) и PMSF (0,1 мл мл). Инкубировать в течение 30 минут на льду и заморозить и оттаивать два раза после этого, погрузив образец в жидкий азот.
   2. Сонифицировать подвеску (30%, 15 раз, 30 с: 10 с перерывом) и очистить лизат через центрифугацию (4 кв.к., 10 000 х г в течение 40 мин).
   3. Очистите белок с помощью хроматографии сродства (например, на колонке никеля 1 мл с помощью системы FPLC, подключенной к сбору фракций; см. Таблица материалов). Вылейте белок с элюционным буфером (50 мм Tris-HCl, 500 мМ NaCl, 4 M мочевины, 250-500 мм имидазола) и хранить при 4 градусах Цельсия до дальнейшей обработки.
   4. Проанализируйте эффективность очистки с помощью SDS-PAGE.

3. Краситель-модификация ELPs через SPAAC

1. Грубо оцените концентрацию раствора ELP.  Поглощение₂₈₀ для оценки концентрации не является ценным, так как последовательность pAzF-R40F20 не хватает аминокислот, поглощающих в УФ-диапазоне. Таким образом, ранее лиофилизированный и взвешенный амфифил ELP может быть использован в качестве эталона для сравнения полосы SDS PAGE. Путем сравнения суммированных серых значений intesity sDS PAGE полос из ELP решений с известными концентрациями и ваш образец грубой концентрации образца может быть оценена.
2. Добавьте 1 зллю флуоресцентного красителя BDP-FL-PEG4-DBCO (10 мМ конечной концентрации; 20 мкм конечной концентрации) до 500 л л раствора ELP (20 мкм). Инкубировать реакцию около 10 ч при 15 градусах Цельсия, в то время как встряхивая и защищены от света.
3. Для дальнейшего использования диализировать реакцию, чтобы удалить чрезмерное BDP.
   1. Равновесие диализа мембраны (например, 12 kDa отсечения) в ультрачистой воде в течение 10 мин. Вырезать диализм мембраны в правильный размер, который будет помещен на верхней части открытия реакции трубки, содержащей нажал ELP раствор. Чтобы исправить диализную мембрану в отверстие, поместите крышку реакционной трубки с пробитым ядром на отверстие, тем самым закрыв трубку.
   2. Поместите реакционную трубку вверх дном в выбранный буфер. Обмен буфера (2-5 L) дважды после диализа, по крайней мере 3 ч каждый раз. Удалите любые пузырьки воздуха, оказавшись между мембраной диализа и буфером, чтобы обеспечить успешный диализ.

4. Протокол отеков THF

1. Диализ однородный раствор ELP против фосфата или трис-буфера (10 мМ) со стабильным рН 7,5 для удаления солей и оставшихся соединений из его тега очистки.
2. Приготовьте лиофилизатор и охладите до стартовой температуры для замораживания сушки.
3. Aliquot диализированный белковый раствор в 1,5 мл реакционных трубок (50-500 л на трубку) и шоковый замораживание жидкого азота. Чтобы избежать нежелательного смешивания различных белковых растворов во время замораживания сушки, шапки с небольшим отверстием можно положить поверх реакционной трубки, чтобы запечатать его частично.
4. Возьмите замороженные образцы белка из жидкого азота и сразу же поместите их в лиофилизатор, чтобы начать замораживание сушки. Замораживание сушки завершается, когда образец полностью сухой (примерно 24-48 ч). Впоследствии проветривайте лиофилизированные амфифилические ЭЛП с сухим N_2,затем сразу же закрывают крышки реакционной трубки, чтобы избежать контакта с влагой воздуха.
5. Добавьте чистый THF в лиофилизированные образцы (ELP, 5-10 мкм) и поместите раствор в водяной ванне соникатор, содержащий ледяную воду в течение 15 минут, чтобы обеспечить отек ELP в THF.
6. Разогреть термоциклопер до 30-60 градусов по Цельсию для образования везикул или до 90 градусов по Цельсию для образования волокна и подготовить новые реакционные трубки, содержащие либо ультрачистую воду или буфер (50 мм₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 мМ NaCl, рН 5-13). Сферические коакерваты собираются преимущественно при 20 градусах по Цельсию в пределах рН 9-13. Формирование Vesicle благоприятствует при 50-60 градусах Цельсия между рН 7 и 9. Образование волокна предварительно индуцированно над 60 c между pH 5 и 12.
7. После звукового шага поместите раствор ELP/THF, а также подготовленный ультрачистый раствор воды или буфера в термоциклер и нагрейте до нужной температуры в течение 5 мин. При достигаете температуры разогретый раствор ELP/THF должен быть тщательно стратифицирован поверх разогретой ультрачистой воды или буферного раствора. Должно быть видно четкое разделение двух этапов с определенным интерфейсом.
8. Поместите смесь в термоцикл снова и инкубировать в течение 20 минут, чтобы обеспечить везикул или волокна формирования на интерфейсе. После этого дайте образцам остыть до комнатной температуры в течение 10 минут до анализа с помощью флуоресценции или диализа.
9. Диализный раствор, содержащий надмолекулярные структуры против ультрачистой воды или буфера (50 мм₂PO₄/Na₂HPO_4,50 мМ NaCl, рН 7-10).

5. Протокол экструзии BuOH

1. Подготовьте раствор ELP 1-50 мм в ультрачистой воде или буфере (50 мм ПБ рН 7,5, 100 мм NaCl, может содержать до 4 М мочевины). Концентрация амфифилических ELP F20R20-mEGFP и раствора F20R20-mCherry можно определить с помощью коэффициентов вымирания моляров (F20R20-mEGFP A₂₈₀ - 22015 M^-1 см^-1 и F20R20-mCherry A₂₈₀ - 34380 M^-1 см^-1sequencea)
2. Добавьте 10%-20% (v/v) 1-бутанол и сразу же смешайте раствор, прокладывая трубку вверх и вниз или рисуя его через шприц несколько раз. Можно нанести общий пипетку калибра 100 л или шприц Hamilton, оснащенный иглой 0,25 х 25 мм. Мутность раствора во время смешивания должна увеличиваться, что указывает на образование везикулы. 1-октанол 5%-15% (v/v) также может быть использован для везикулы экструзии вместо 1-бутанола.
3. Для достижения узкого распределения размеров, выдавливать пузырьки с помощью мини-экструдера через мембрану с размером поры 1 мкм при комнатной температуре. Размер мембраны, используемый для экструзии, определяет верхний размер отсечения пузырьков.
4. Диализ пузырьков, как описано выше (шаг 3.3), чтобы удалить остаточный 1-бутанол.

6. Инкапсуляция красителя с протоколом экструзии BuOH

1. Смешайте примерно 40 мл ELP раствор в 10 мм Tris-HCl, рН 8 с 1 L Dextran Texas Red (0,0025 мг/мл конечной концентрации).
2. Добавьте в раствор 10 кЛ BuOH и выдавливайте 5-10 раз через шприц, оснащенный иглой 0,25 х 25 мм.

7. Анализ надмолекулярных структур с использованием флуоресценции микроскопии

1. Поместите подкрепление кольцо на стеклянную горку и твердо прижмите клей стороны к стеклу.
2. Добавьте 5 зл и пилули образца на внутреннюю часть арматурного кольца и поместите крышку скольжения сверху.
3. Печать образца с лаком для ногтей по краям крышки скольжения, чтобы избежать испарения образца во время анализа.
4. Провести флуоресценцию микроскопии, как ранее описано⁸.

Результаты

Разработка протокола для производства везикул
На рисунке 1 описаны два различных метода подготовки везикля. Метод отеков THF на левой стороне состоит из трех последовательных шагов и приводит к различным надмолекулярным сборкам ELP в зависимост...

Обсуждение

Неисправность при следовании описанным протоколам для сборки определенных надмолекулярных структур в основном приводит либо к образованию неспецифических агрегатов(рисунок 2,IV), либо к однородно распределенным ЭЛП-амфифилам. Критические шаги протокола рассматривают...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm and 0.2 µm Steril Filter	VWR
1,4-Dithiothreitol	Merck
1-butanol. >99.5% p.a.	Roth
2log DNA ladder	NEB
2-Mercaptoethanol	Roth
50 mL Falcon tubes	VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye	Sigma Aldrich
Acetic acid glacial	VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)	Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)	Roth
BspQI	NEB
Camera DS Qi1	Nikon
Centrifuge 5417r	Eppendorf
Centrifuge 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid	EMS
Chloramphenicol	Roth
CompactStar CS 4	VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral	Life Technologies
Digital sonifier	Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Applichem
Dnase I	Applichem
EarI	NEB
EcoRI-HF	NEB
Environmental shaker incubator ES-20	Biosan
Ethanol absolute	Roth
Ethidium bromide solution	Roth
Filter supports	Avanti
Glass plates	Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade	Amresco
Glycin	Applichem
H4-Azido-Phe-OH	Bachhem
Heat plate MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF crude column	GE Life Sciences		Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.	Merck
Illuminator ix 20	INTAS
Illuminator LAS-4000	Fujifilm
Imidazole	Merck
Immersions oil for microscopy	Merck
Incubators shakers Unimax 1010	Heidolph
Inkubator 1000	Heidolph
IPTG, >99%	Roth
Kanamycinsulfate	Roth
L(+)-Arabinose	Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE	Sartorius
LB-Medium	Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC	Christ
Lysozyme, 20000 U/mg	Roth
Microscope CM 100	Philips
Microscope Eclipse TS 100	Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)	VWR
Microscopy slides	VWR
Microwave	Studio
Mini-Extruder Set	Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.	Roth
Natriumhydroxid pellets	Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro	5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane	Avanti
PH meter 766 calimatic	Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)	Roth
Polypropylene Columns (1 mL)	Qiagen
PowerPac basic	BioRad
Propanol-2-ol	Emplura
Protein ladder 10-250 kDa	NEB
Recirculating cooler F12	Julabo
Reinforcement rings	Herma
SacI HF	NEB
SDS Pellets	Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4	VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate	VWR
T4 DNA Ligase	NEB
TEMED	Roth
TexasRed Dextran-Conjugate	MolecularProbes
Thermomix comfort	Eppendorf
THF, >99.5% p.a.	Acros
Triton X 100	Roth
Trypton/Pepton from Casein	Roth
Ultrasonic cleaner	VWR
Urea p.a.	Roth
Vacuum pump 2.5	Vacuubrand
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)	Roth