Лазерная захват микродиссекция субрегионов глиомы для пространственной и молекулярной характеристики внутриопухолевой гетерогени, онкостримов и вторжения

Резюме

Лазерная микродиссекция (LMD) является чувствительным и высоко воспроизводимым методом, который может быть использован для выявления путей, которые посредничают неоднородность глиомы и вторжения. Здесь мы описываем оптимизированный протокол для изоляции дискретных областей от глиомной ткани с помощью лазерного LMD с последующим транскриптомическим анализом.

Аннотация

Глиомы являются первичными опухолями головного мозга, характеризующимся их инвазивностью и неоднородностью. Специфические гистологические модели, такие как псевдопализады, микрососудистая пролиферация, мезенхимальная трансформация и некроз характеризуют гистологическую неоднородность полноценных глиом. Наша лаборатория показала, что наличие высокой плотности мезенхимальных клеток, названных онкостримами, коррелирует со злокачественностью опухоли. Мы разработали уникальный подход к пониманию механизмов, лежащих в основе роста и вторжения глиомы. Здесь мы описываем всеобъемлющий протокол, который использует лазерный захват микродиссекции (LMD) и секвенирования РНК для анализа дифференциального мРНК выражение внутриопухолевых неоднородных многоклеточных структур (т.е. мезенхимальных областей или областей вторжения опухоли). Этот метод поддерживает хорошую гистологию тканей и целостность РНК. Перфузия, замораживание, встраивание, секционирование и окрашивание были оптимизированы для сохранения морфологии и получения высококачественных образцов лазерной микродиссекции. Результаты показывают, что перфузия глиомы подшипников мышей с использованием 30% сахарозы обеспечивает хорошее морфологии и качества РНК. Кроме того, окрашивание опухолевых секций с 4% Cresyl фиолетовый и 0,5% эозин приводит к хорошему ядерному и клеточному окрашиванию, сохраняя при этом целостность РНК. Описанный метод является чувствительным и высоко воспроизводимым и может быть использован для изучения морфологии опухоли в различных моделях опухолей. Таким образом, мы описываем полный метод для выполнения LMD, который сохраняет морфологию и качество РНК для секвенирования для изучения молекулярных особенностей неоднородных многоклеточных структур в твердых опухолях.

Введение

Глиомы являются наиболее агрессивными первичными опухолями центральной нервной системы. Они очень инвазивные и неоднородные¹. Анализ клеточных и молекулярных компонентов опухоли выявит новые терапевтические цели.

Среди различных методов в настоящее время доступны, лазерный захват микродиссекции (LMD) замороженных тканей опухоли головного мозга является экономически эффективным, надежным методом, который позволяет изоляции отдельных анатомических областях или конкретных популяций клеток из опухолевых тканей для изучения их молекулярного профиля^2,3. LMD позволяет анализанализ мРНК генэкспрессии профилей отдельных клеток или многоклеточных структур^4,5. LMD может быть использован для получения углубленных механических знаний о молекулярных событиях, которые происходят во время прогрессирования опухоли. Улучшение обработки опухолевых тканей необходимо для получения оптимального оптического разрешения морфологии тканей и РНК-качества^6. Хотя параформальдегид фиксации является лучшим вариантом для морфологического анализа, качество РНК влияет и ухудшается в этих условиях, в результате чего плохое качество РНК для анализа РНК-сек. Использование замороженных секций ткани позволяет избежать образования кристалла льда, которые могут сломать клеточные мембраны и производить отверстия в клетках, и остается лучшим вариантом для анализа РНК-Seq⁷.

Здесь мы описываем оптимизированный метод фиксации секции и окрашивания для обработки замороженных тканей опухоли мозга мыши для LMD. Чтобы предотвратить образование кристаллов льда в тканях, мы проникнуты мышам раствором 30% сахарозы. Это решение нарушает взаимодействие между молекулами полярной воды и предотвращает образование кристаллов льда, сохраняя морфологию тканей. Ткань окрашивания необходимо дифференцировать и получить конкретные популяции клеток или анатомически различных областях в опухоли. Важно, чтобы исправить и испачкать ткани безобидными красителей для поддержания целостности РНК. Ранее было показано, что окрашивание ткани гематоксилин / эозин (H и E) ухудшает целостность РНК⁸. Мы зафиксировали и запятнали ткани интереса с этанолом, cresyl фиолетовым 4% и eosin Y 0.5% разрешениями. Кресил фиолетовый является ацидофильные красителя, который пятна ядра клетки с темно-синим цветом. Eosin Y является базофильной красителя, который пятна основных компонентов клеток, обеспечивая различие между цитоплазмы и других клеточных структур⁸. Оба красителей растворяются в этаноле и не ухудшают качество РНК. Чтобы избежать повреждения тканей и поддерживать высокое оптическое разрешение клеточных структур, мы смонтировали секции тканей до LMD^9.

протокол

Все методы, описанные здесь, что использование экспериментальных животных были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) Мичиганского университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Глиома нейросфер, генерируемых из GEMM или стабильные линии могут быть использованы для внутричерепной опухоли прививок у мышей¹⁰ и обрабатываются для lMD и РНК секвенирования. Эти клетки, как правило, выражают светлячок люциферазы и GFP белки, которые будут дополнительно использоваться для анализа роста опухоли и локализации.

1. Поколение внутричерепной модели глиомы мыши из нейросфер, полученных из генетически модифицированных моделей глиомы

1. Для создания первичной культуры нейросферных клеток из генно-инженерной мыши (GEMM) модели, используйте протокол, описанный ранее^10,11.
2. Подготовка нейросферной культуры среды, как описано: 500 мл Dulbecco в модифицированных Eagle Средний F-12 (DMEM/F12) дополнен 10 мл 50x B-27 и 5 мл 100x N-2 нейрональной культуры добавки, 5 мл 100x антибиотик-антикотик, и 1 мл нормоцин. Перед покрытием нейросфер, добавить 20 нг / мл человека рекомбинантных EGF и FGF в культуре среды.
3. Культура нейросфер глиомы в инкубаторе культуры тканей при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ в течение 2-3 дней до внутричерепного инплантации опухоли.
4. В день операции соберите нейросферы глиомы и раскрутите их при 550 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Тщательно удалите супернатант, не нарушая клеточные гранулы.
5. Чтобы разъединить нейросферы, переприостановите клеточные гранулы в 1 мл раствора отслоения клеток и инкубируете при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ в течение 2-4 мин. После инкубационного периода, пипетка нейросферы вверх и вниз с 1 мл микропайпет, чтобы обеспечить подвеску одной клетки.
6. Инактивируйте раствор отслоения клеток, разбавляя нейросферную подвеску 10 мл недополняемых средств DMEM/F12. Спин нейросферы на 550 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Осторожно, удалите супернатант.
7. Приостановите действие клеточных гранул в 100 Л DMEM/F12 носителей без добавок. Сделайте 1:50 разбавления клеточной подвески, а затем добавить 50 зл Ит Трипан синий рассчитывать жизнеспособных клеток. Используйте следующую формулу для определения концентрации клеток:
   клетки/мл /("клетки, подсчитанные на квадрат) / q квадратов, подсчитанных) x 50 x 10 000 ячеек/мл
8. После определения количества клеток, для достижения целевой концентрации 30000 клеток / Л в 100 л объема, спина нейросфер вниз и повторно их в соответствующем объеме DMEM / F12, не содержащий добавок.
9. Поместите нейросферы в предварительно маркированную трубку 0,6 мл на льду.
10. Подготовка рабочих решений анестезии, анальгетик, и анестезии разворота до имплантации: Для кетамина / дексмедетомидина анестезии, добавить 0,6 мл 100 мг/мл гидрохлорида и 0,8 мл 0,5 мг/мЛ dexmedetomidmidine гидрохлорид стерильный 8,6 мл. Для бупренорфин анальгетик, добавить 1 мл 0,3 мг / мл бупренорфин 9 мл 0,9% NaCl содержащие флакон. Для разворота анестезии атипамезола, добавить 1 мл 5 мг/мл атипамезола до 9 мл 0,9% NaCl, содержащий флакон.
11. Используйте 6-8-недельных C57BL/6J самок мышей для внутричерепной опухоли прививок.
12. В комнате, одобренной для хирургии выживания грызунов, навязали стерильные припасы для внутричерепного инплантирования опухоли. Выполняйте операции на стереотаксической раме грызунов, оснащенной стерилизованным шприцем Гамильтона 10 Л.Л. со съемной иглой 33G. Используйте стерилизатор из биса для стерилизации инструментов между операциями.
13. Анестезия мышей с одной интраперитонеальной (т.п.) инъекцией анестезиологического раствора, приготовленного в шаге 1.11 (кетамин:75.0 мг/кг и дексмедетомидин:0,5 мг/кг). Приблизительно, 250 л объем анестезирующего раствора будет доставлен в мышь весом 20 г. Убедитесь, что мышь не реагирует на педали рефлекс до начала работы.
14. После того, как мышь находится в глубоко обезоживаемом состоянии, применять стерильные бензиновая смазка для глаз, чтобы предотвратить сушки. Бритье меха на черепмыши мыши. Для дезинфекции на несите 10% повид-йодный актуальный раствор в бритву.
15. Защищайте череп мыши в стереотаксической раме. Во-первых, осторожно открыть рот с щипками и осторожно потяните язык и переместить его в одну сторону рта, чтобы предотвратить удушье. Держите рот открытым с щипками и поместите верхние резцы в замочную скважину зубной панели на стереотаксической раме.
16. Держа мышь голову за уши, поместите ухо баров против посторбитальных костей и закрепите их. Убедитесь, что череп мыши находится на одном уровне с хирургической столешницы. Безопасные ухо баров тщательно не применяя давление на череп. Далее, тщательно закрепите нос бар.
17. Используя размер 15 скальпель лезвие, сделать разрез вдоль головы мыши, подвергая черепа. Уреждавайте кожу на месте разреза с помощью втягивающих агрегатов Colibri. Используйте стерильный аппликатор для удаления всех перикраниальных тканей.
18. Определите брегму и опустите иглу шприца Гамильтона прямо над ней. Используя раму, положение иглы 1 мм передней брегмы и 1,5 мм боковой. Используя иглу 26G, отметьте это место, забив черепа.
19. Используйте беспроводную силовую дрель, оснащенную сверлом 0,45 мм, чтобы создать отверстие заусенца в целевом объекте. Просверлите до достижения основной матер дюра. Тщательно извлекайте оставшуюся кость в заусенец отверстие с 26G иглы.
20. Используя пипетку, гомогенизировать клетки тщательно и составить 7 л нейросферной подвески в шприц. Чтобы убедиться, что шприц работает должным образом, распределить 1 л суспензии на 70% пропитанной алкоголем площадку.
21. Опустите иглу на поверхность dura mater. Опустите шприц на 3,5 мм брюшной брюшной полий и уреждение на 0,5 мм. Это создаст 0,5 мм пространства в мозге для нейросфер на хранение при введении.
22. Оставьте иглу на месте в течение 2 мин для уравновешись давления. Медленно и плавно доставить 1 кл/ склеизм клеток в течение 1 мин. Разрешить клеткам поселиться в течение 6 мин. Удалить шприц медленно и плавно из мозга в течение 2 мин.
23. Используя стерильный сольный раствор, промойте поверхность черепа три раза. Распределите лишние клетки в шприце на 70% спиртовой площадки, и протрите иглу чистой с другой 70% алкоголя площадку. Промыть шприц стерильным PBS, чтобы избежать засорения иглы.
24. Удалите втягивающую и осторожно выньте мышь из стереотаксической рамы. Закройте разрез с помощью 3-0 нейлоновых швов, щипцы, и иглы водителя.
25. Администрирование атипамезола (1,0 мг/кг), примерно 100 л для мыши 20 г. Администрирование бупренорфин (0.1мг/кг подкожного) подкожно, примерно 70 л для мыши 20 г. Поместите послеоперационных мышей в чистую клетку восстановления и контролировать их до оповещения и активных.

2. Перфузия животных и сохранение мозга

1. Для мониторинга прогрессирования опухоли, определить in vivo биолюминесценции с помощью системы визуализации in vivo, пока животные не проявляют признаки бремени опухоли. Эвтаназия мышей, когда они достигают сигнала между 10⁶ до 10⁷ фотон / с.
2. Анестезия мышей, демонстрирующих признаки опухолевого бремени с интраперитонеальной (т.п.) инъекцией кетамина (75,0 мг/кг) и дексдетомидина (0,5 мг/кг) раствора. Доставьте мышь весом около 250 л. Затем убедитесь, что мышь не реагирует на педали рефлекс.
3. Используя щипцы, удерживайте кожу над полостью перитонеальной полосты, и с помощью большой пары ножниц рассечения сделайте разрез "Y", проникая в стенку, прокалывая диафрагму, а затем перерезая грудную клетку.
4. Вставьте тупую канюль 20G в левый желудочек сердца мыши. Затем отрежь правое предсердие сердца, чтобы для exsanguination.
5. Разрешить кислородом раствор Tyrode (0.8% NaCl, 0.0264% CaCl₂, 0.005%₂PO₄, 0,1% глюкозы, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl) течь через систему кровообращения мыши, пока печень и легкие полностью очищены из-за удаления крови ( й 5 минут).
6. Продолжайте проникать животным 30% раствором сахарозы, растворенного в растворе Tyrode в течение еще 15 мин. Чтобы оценить успех перфузии, подтвердите, что шея, хвост и ноги являются жесткими пост 30% кровообращения сахарозы.
7. Используя небольшую пару ножниц вскрытия, вырезать кожу головы в средней линии. Начиная с затылочной кости и работает вперед к монике. Это разоблачит череп.
8. Используя пару rongeurs, прорваться через череп, начиная с затылочной кости и продолжать вперед, чтобы полностью разоблачить поверхности мозга. Затем поверните голову вверх и вскрыть нервы в основании мозга, чтобы освободить его от черепа.
9. Приготовьте 30% раствор сахарозы с помощью свободной воды RNase и процедите его через 40 м/м нейлоновый сетчатый фильтр для уменьшения деградации РНК.
10. Чтобы максимизировать инфильтрацию раствора сахарозы, поместите расчлененные мозги в 30% раствор сахарозы и храните их при 4 градусах Цельсия на ночь. Перед дальнейшей обработкой убедитесь, что мозг достигает нижней части труб, содержащих раствор сахарозы.

3. Криоконсервация мозгов, укрывающих опухоли глиомы

1. Перед криоконсервированием мозга, подготовить банку, наполненную холодным isopentane /2-метилбутан и поместить банку в контейнер, наполненный жидким азотом. Дайте растворителю остыть.
2. Удалить мозг из 30% сахарозы раствора и пятно его сухой на фильтровальной бумаге.
3. Пометьте криомольд постоянным маркером. Осторожно, добавить примерно 5 мл OCT (оптимальное соединение температуры резки) в центре криомолд избегая пузырьков воздуха.
4. Поместите мозг в криомольд, содержащий OCT в нужной ориентации. Заполните форму с OCT до тех пор, пока мозг полностью погружен. Используя чистые щипцы, быстро поместите криомольд с OCT и мозг в холодный isopentane/2-метилбутан.
5. Как только OCT затвердевает (30-40 s), удалите криомолд с мозгом и поместите его в сухой лед. Не оставляйте плесень, содержащую мозг в 2-метилбутан прошлом 2 мин, как это может привести к трещинам в твердом OCT. Оберните криомольд с мозгом в алюминиевой фольге и хранить его при -80 градусов по Цельсию.

4. Секция замороженных тканей опухоли мозга

1. Этикетка 2 мкм полиэтилен нафталат (PEN) слайды с образцом информации. Ткань разделы будут размещены непосредственно на этих слайдов после секции.
2. Установите температуру криостатной камеры от -20 до -24 градусов по Цельсию. Перед разделом поместите образец блока в криостатную камеру и дайте ему уравновеситься до температуры в камере в течение 30-60 мин.
3. Очистите камеру криостата и держатель ножа с 100% этанолом и распылите щетки, которые будут использоваться с помощью чистящего раствора RNase. Работая внутри криостаткамеры, удалите плесень и прикрепите блок OCT, содержащий мозг, к диску образца криостата с OCT. Поместите блок в держатель диска и выровнять блок с лезвием ножа.
4. Установите одноразовый лезвие в держатель секции.
5. Раздел мозга на 10 мкм толщины. Убедитесь, что в тканях нет полос или линий царапин. Используя кисть, осторожно сгладить и раскрутить ткани на поверхность резки.
6. Тщательно смонтируйте ткани, содержащие секции мозга, на свободные пенсовские стеклянные слайды. Переверните положительное заряженное стекло скользит пальцами в направлении ткани и плавно нажмите стекло скользить вниз к ткани разделе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура рук поможет ткани прикрепиться к стеклу.
7. После установки секций мозга на слайды, держать слайды в коробке внутри криостат камеры, а затем хранить их при -80 градусов по Цельсию. Никогда не держите слайды при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Складные ткани, и разрыв являются общими. Для точного заднего анализа важно свести к минимуму эти артефакты.

5. Фиксация и окрашивание криоконсервированных секций тканей мозга

1. Чтобы сохранить целостность РНК, очистите все инструменты, которые будут использоваться с rNase очистки решения. Продолжить с фиксацией и окрашивания протокола внутри дыма капот.
2. Подготовьте описанные фиксаторные растворы в чистых трубках RNase free 50 мл. Сделайте все решения с RNase свободной водой в день окрашивания.
3. В тот же день будет выполнена лазерная микродиссекция, подготовьте 100%, 95%, 70% и 50% растворы этанола. Храните растворы в плотно закрытых трубках при комнатной температуре.
4. Подготовка 4% Кресил фиолетовый и 0,5% эозин Y в 75% этанола раствора. Vortex раствор энергично в течение 1 мин и фильтровать их через 0,45 мкм нейлоновый фильтр для устранения следов нерастворенного порошка.
5. Поместите ткань слайды в контейнер с 95% этанола на 30 с. Передача слайдов в трубку, содержащую 75% этанола; оставить слайды там на 30 с.
6. Перенесите слайды на 50% этанола и оставьте их там на 25 с. На этом этапе ОКТ будет распущен. Перенесите слайд на 4% кресиловый фиолетовый раствор на 20 с, а затем перенесите на 0,5% эозин Y раствор на 5 с.
7. Возьмите слайд из раствора красителя и пятно слайд сухой с фильтровальной бумагой. Затем поместите горки в 50% этанола на 25 с. Перенесите слайды на 75% этанола на 25 с. Перенесите слайды на 95% этанола на 30 с. Перенесите слайды на 100% этанол за 60 с.
8. Промыть слайд с ксилена. Перенесите их в контейнер с ксиленом и подождите 3 мин.
9. Подготовьте монтажную среду (например, сентовок) в свободной от RNase воде. Чтобы смонтировать секции мозга мыши, разбавьте монтажную среду в свободной от RNase воде в соотношении 1:10.
10. Сухие горки на свободной от RNase поверхности при комнатной температуре в течение 10 с. Перед тем, как ксилен высохнет, приступаем к монтажу слайдов с помощью секций тканей.
11. Аккуратно разогнать монтажный раствор поверх ткани на слайде стерильным и безRизтонкой тонкой кистью. Подождите 10-20 с, а затем сразу же перенесите ткани слайды на микроскоп микроскопии платформы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение монтажа среды и RNase-свободной воды, используемой для монтажа варьируется в зависимости от ткани интереса. Монтаж среднего / водного соотношения сохраняет глиома ткани морфологии для лазерного микрорассечения, не влияя на целостность РНК.

6. Лазерный захват микрорассечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерный захват микродиссекции микроскоп должен быть использован для лазерного микродиссекта конкретных областях, представляющих интерес в опухолевой ткани. Чтобы свести к минимуму время для микрорассечения тканей лазерной, есть LMD микроскоп подготовлен до фиксации и окрашивания.

1. Чтобы запустить систему, сначала включите полосу питания, а затем включите лазер. Затем включите контроллер микроскопа и компьютер. Запустите программное обеспечение LMD.
2. Под управлением микроскопавыберите 10-x увеличение. Под лазерным управлениемустановите лазерные параметры для вскрытия тканей. Установите лазерную частоту 120 Гц для лучших результатов резки. Всегда устанавливайте лазерный ток на 100%.
3. Для точного лазерного микродиссекции установите скорость на уровне 10, а диафрагму - 2,0-10,0 мкм. Установите мощность до 53. Наличие лазерной мощности в более высокой обстановке может привести к офорту стекла.
4. Загрузите коллектор ткани, который будет захватывать ткани после вскрытия. Нажмите вторую кнопку разгрузки. Удалите пустой коллектор и поместите DNase/RNase бесплатно 0,5 мл ПЦР плоские головные трубки, содержащие 30 зл ископ буфера лизиса в коллектор. Поместите коллектор обратно в машину и нажмите Продолжить программное обеспечение для продолжения.
5. Загрузите обработанный (фиксированный и окрашенный) образец на микроскоп. Во-первых, нажмите разгрузить на программное обеспечение LMD. Затем установите образец на держатель слайда и поместите держатель слайда на сцену. Нажмите Продолжить на программное обеспечение, чтобы продолжить.
6. Под окнами Cut Shapes выберите Draw и Cut. Используйте элементы управления микроскопом, чтобы найти интересуемую область. Нарисуйте интересуемый регион (ROI) и выберите коллекторную трубку назначения. Можно нарисовать несколько ROIs для микро вскрыть различные области от одного слайда в то же время.
7. Нажмите Start Cut, чтобы перейти к рассечению тканей. После секции участки интереса удалите коллекторские трубки с держателя и поместите трубки на сухой лед. Передача образцов ткани РНК, собранных до -80 градусов по Цельсию для длительного хранения.

7. РНК изоляция микро-расчлененных тканей глиомы

1. Для извлечения РНК из LMD используйте комплект изоляции РНК, оптимизированный для небольших образцов и низкой урожайности РНК (см. Таблицу Материалов). Следуйте инструкциям по изготовлению. Выполняй все изоляционные шаги при комнатной температуре (25 градусов по Цельсию). Для поддержания качества РНК, работать быстро. Подготовьте все решения, указанные производителем.
2. Отрегулируйте объем выборки до 350 qL с помощью буфера лизиса с 1% й-меркаптоэтанолом. Vortex образец для 40 s для того чтобы уменьшить вязкость образца и увеличить эффективность закрутки закрутки RNA elution.
3. Перенесите весь образец в колонку спина gDNA, помещенную в трубку коллекции 2 мл. Центрифуга трубки для 30 с на 8000 х г. Сохраните поток через и убедитесь, что жидкость не остается на столбце после центрифугирования.
4. Добавьте 350 л 70% этанола в протоим и хорошо перемешайте, прокладывая трубку вверх и вниз. Передача образца, в РНК элуцион спина спина колонке помещены в 2 мл трубки сбора. Закройте крышку осторожно, и центрифуга для 15 с на 8000 х г. Откажитесь от потока через, сохраняя столбец.
5. Добавьте 700 кЛ моющих буфера РНК 1 (20% этанола, 900 мМ GITC, 10 мМ Tris-HCl pH 7.5) в колонку спинового вращения РНК. Закройте крышку осторожно, и центрифуга на 15 с на 8000 х г, чтобы мыть мембрану спин-колонки. Откажитесь от потока через.
6. После центрифугирования тщательно удалите колонку вращения РНК из трубки сбора, чтобы столбец не контактировал с потоком через.
7. Добавьте 500 кЛ второго буфера промывки РНК (этанол 80%, NaCl 100 мМ, Tris-HCl 10 мМ pH 7.5) в колонку спина. Закройте крышку колонны и закрутите 8000 х г на 20 с, чтобы промыть мембрану колонны. Утилизировать поток через.
8. Для мытья колонки РНК элуцион, добавить 500 зл 80% этанола, закрыть крышку колонны и центрифуги на 8000 х г в течение 2 мин. Выбросить трубки с раствором elution.
9. Используйте новую трубку сбора, откройте крышку спин-колонки и центрифугу при 8000 х г в течение 5 минут, чтобы высушить колонку. Откажитесь от трубки elution.
10. Поместите колонку спина Elution RNA в новую трубку коллекции 1,5 мл. Добавьте 12 qL воды без RNase, разогретой при 37 градусах Цельсия прямо к центру мембраны спин-колонки. Подождите 4 мин и центрифугу в течение 1 мин на полной скорости, чтобы elute РНК.

8. Контроль качества РНК, подготовка библиотеки и анализ РНК-Сек

1. После извлечения РНК и очистки, усилить РНК и создать библиотеку кДНК с помощью специального комплекта подходит для изоляции РНК в пико-молярной концентрации в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблица материалов). Следуйте инструкциям производителя. Чистая рабочая станция во избежание загрязнения другими продуктами ПЦР и нуклеаза деградации образцов.
2. Если РНК имеет значение RIN больше 4, то есть РНК хорошего качества или только частично деградировали, приступить к фрагментации шаг. Подготовьте все предметы на льду.
3. Создайте мастер-микс в указании(таблица 1). Создайте реакционную смесь в тонкой стенке 0,2 мл ПЦР трубки. Инкубировать трубки при 94 градусах По Цельсию в тепловом цикле горячей крышкой. Время инкубации фрагментации зависит от качества РНК. Рин No 7: 4 мин, RIN 5-6: 3 мин, RIN 4-5: 2 мин.
4. После инкубации поместите трубки на стойку охладителя ПЦР, которая ранее охлаждалась при -20 градусов по Цельсию, и дайте ему посидеть 2 мин.
5. Для каждой трубки образца РНК, подготовить первую нить синтеза реакции мастер смеси (Таблица 2). Инкубировать трубки в тепловом цикле с горячей крышкой в условиях, описанных в таблице 3. продукты cDNA могут быть заморожены при -20 градусах Цельсия до тех пор, пока в течение двух недель, прежде чем перейти к следующему шагу.
6. Создайте мастер-микс ПЦР, как указано в таблице 4. Поместите трубки в горячую крышку теплового велосипеда и запустить реакцию ПЦР под настройками, указанными в таблице 5.
7. Разрешить бисер, который будет использоваться для очистки ДНК, чтобы согреться до комнатной температуры. После разогрева, добавить 40 л бусин к каждому образцу. Vortex трубки смешивать и вращаться вниз кратко собирать жидкость в нижней части трубки. Пусть трубки инкубировать при комнатной температуре в течение 8 минут, чтобы ДНК, чтобы связаться с бисером.
8. Поместите трубки на магнитное устройство разделения и пусть сидеть около 5 минут, или пока решение становится полностью ясным. Сохраняя трубки на устройстве разделения, используйте пипетку, чтобы удалить супернатант тщательно, не нарушая бисер.
9. Сохраняя трубки на устройстве разделения, добавьте 200 л свежеприготовленного 80% этанола в бисер, чтобы вымыть, не нарушая шарики. Подождите 30 с, прежде чем удалить 80% этанола. Повторите этот шаг.
10. Кратко спина вниз трубки и поместить трубки обратно на устройство разделения. Удалите остатки 80% этанола, не нарушая бисера.
11. Пусть трубы воздуха сухой с крышками открыты в течение 5 минут. Не позволяйте ему сидеть дольше, как бисер будет более сухой.
12. Сохраняя трубки на устройстве разделения, добавьте 52 qL безнужной воды, чтобы покрыть бисер. Удалите трубки из устройства разделения и пипетка вверх и вниз, пока все шарики повторно. Инкубировать при температуре 5 мин при комнатной температуре.
13. Поместите трубки обратно на устройство разделения, пока раствор не станет ясным, около 1 мин. Передача 50 qL в результате супернатант в скважины 8-хорошая полоса. Добавьте в каждый образец 40 л новых бусинок. Вихрь тщательно перемешать. Разрешить бисер, чтобы связаться с ДНК путем инкубации при комнатной температуре в течение 8 мин.
14. В течение этого инкубационного периода, начать оттаивание компонентов, которые будут использоваться для любого rRNA присутствует в образцах. После того, как оттаяли, поместите их на лед. Кроме того, предварительно разогреть тепловой циклдора до 72 градусов по Цельсию.
15. Поместите образцы на магнитное устройство разделения до тех пор, пока раствор не расчистит (около 5 мин). Aliquot 1,5 л зондов на образец в охлажденной трубке ПЦР. Поместите трубку в разогретый тепловой цикл под настройками 72 градусов по Цельсию в течение 2 мин и 4 градусов по Цельсию.
16. Сохраняя образцы трубок в магнитном устройстве разделения, удалите супернатант с помощью трубки, не нарушая шарики. Затем добавьте 200 л свежеприготовленного 80% этанола в бисер, чтобы вымыть, не нарушая шарики. Подождите 30 с, прежде чем удалить 80% этанола. Повторите этот шаг.
17. Кратко спина вниз трубки и поместить трубки обратно на устройство разделения. Удалите остатки 80% этанола, не нарушая бисера. Пусть трубы воздуха сухой с крышками открыты в течение 2 мин. Не позволяйте сидеть дольше, как бисер будет более сухой.
18. Подготовка мастер-микс для всех образцов путем объединения следующих компонентов в порядке представлены (Таблица 6).
19. Смешайте мастер смесь путем вихря и добавить 22 злицы в сушеные бусы каждого образца и тщательно перемешать, чтобы повторно. Пусть он инкубирует при комнатной температуре в течение 5 мин.
20. Спин вниз трубки и поместить их на магнитное устройство разделения в течение 1 минуты или до тех пор, пока образцы становятся ясными. Передача 20 Зл супернатанта, не нарушая шарики для новых трубОк ПЦР. Поместите трубки в предварительно нагретый тепловой цикл под настройками в таблице 7.
21. Подготовьте мастер-микс ПЦР для реакции для каждого образца. Добавьте следующие компоненты в мастер-микс в указанной таблице 8. Добавьте 80 зЛ мастерской смеси ПЦР к каждой из пробных трубок со ступени 8.20 и поместите в тепловой циклв в следующих настройках(таблица 9).
22. Разрешить бисер, который будет использоваться для очистки ДНК, чтобы согреться до комнатной температуры. После разогрева, добавить 100 л бусин к каждому образцу. Пусть трубки инкубировать при комнатной температуре в течение 8 минут, чтобы ДНК, чтобы связаться с бисером.
23. Поместите трубки на магнитное устройство разделения и пусть сидеть около 5 минут, или пока решение становится полностью ясным.
24. Сохраняя трубки на устройстве разделения, используйте пипетку, чтобы удалить супернатант тщательно, не нарушая бисер.
25. Сохраняя трубки на устройстве разделения, добавьте 200 л свежеприготовленного 80% этанола в бисер, чтобы вымыть, не нарушая шарики. Подождите 30 с, прежде чем удалить 80% этанола. Повторите этот шаг.
26. Кратко, спина вниз трубки и поместить трубки обратно на устройство разделения. Удалите остатки 80% этанола, не нарушая бисера.
27. Пусть трубы воздуха сухой с крышками открыты в течение 5 минут. Не позволяйте сидеть дольше, как бисер будет переутомиться. Пипетка 20 зл ИТ Tris Buffer к сушеным гранулы. Снимите трубку с разделительного устройства и тщательно перемешайте с пипетом, чтобы повторно приостановить работу бисера. Пусть он инкубирует при комнатной температуре в течение 5 мин.
28. Поместите трубки на устройство разделения в течение 2 минут, или до тех пор, пока решение становится ясным. Приобретите супернатант и перенесите его на новые трубки. Затем храните собранный раствор при -20 градусов по Цельсию.
29. Проверьте конечные библиотеки, необходимые для контроля качества и количества. Объедините образцы, сгруппированные и последовательности, как парный конец 50 nt читает, в соответствии с рекомендуемыми протоколами производителя.

Результаты

Наша лаборатория создала генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) с использованием спящей системы транспозазии красоты(рисунок 1A). Эта система включает в себя конкретные генетические изменения в геном нервных клеток-прародителей у нео?...

Обсуждение

Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе неоднородности глиомы и вторжения имеют решающее значение для выявления новых терапевтических целей¹³. В этой рукописи мы описываем подробный и оптимизированный метод анализа молекулярного ландшафта неоднородности гл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Buffer RLT	Qiagen	79216
Corning PCR Tubes	Sigma Aldrich	CLS6530
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Gibco	11330057
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
HiSeq 4000	Illumina	N/A
Laser Microdissection (LMD) System	Leica	LMD7000
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
Normocin - Antimicrobial Reagent	Invivogen	ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds	Electron Microscopy Sciences	70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm)	Lieca	1150518
Pinpoint Solution	Zymo Research	D3001-1
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B-1MG
Research Cryostat	Leica	CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian	Takara Bio	634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571