JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлена многофотонная микроскопическая платформа для визуализации глазной поверхности живой мыши. Флуоресцентная трансгенная мышь обеспечивает визуализацию ядер клеток, клеточных мембран, нервных волокон и капилляров в глазной поверхности. Нелинейные сигналы второго гармонического поколения, полученные из коллагеновых структур, обеспечивают безымянные изображения для стромальных архитектур.

Аннотация

Обычный гистологический анализ и системы клеточной культуры недостаточны для полного моделирования физиологической и патологической динамики in vivo. Мультифотонная микроскопия (MPM) стала одним из самых популярных методов визуализации биомедицинских исследований на клеточном уровне in vivo, преимущества включают высокое разрешение, глубокое проникновение тканей и минимальную фототоксичность. Мы разработали платформу MPM изображений с индивидуальным держателем глаз мыши и стереотаксис этап для изображения глазной поверхности in vivo. Двойной флуоресцентный белок репортер мыши позволяет визуализировать ядра клеток, клеточные мембраны, нервные волокна и капилляры в глазной поверхности. В дополнение к многофотонным сигналам флуоресценции, приобретение второго гармонического поколения (SHG) одновременно позволяет характеристику коллагеновой стромальной архитектуры. Эта платформа может быть использована для интравитальной визуализации с точным позиционированием по всей глазной поверхности, включая роговицу и конъюнктиву.

Введение

Структуры глазной поверхности, включая роговицу и конъюнктиву, защищают другие более глубокие глазные ткани от внешних нарушений. Роговица, прозрачная передняя часть глаза, функционирует как рефракционная линза для направления света в глаз, так и в качестве защитного барьера. Эпителий роговицы является внешним слоем роговицы и состоит из различных слоев поверхностных клеток, клеток крыла и базальных клеток. Корнеальная строма состоит из сложно упакованных коллагеновых ламелл, встроенных в кератоциты. Корнеловый эндотелий, один слой плоских шестиугольных клеток, играет важную роль в поддержании прозрачности роговицы, сохраняя строму роговицы в относительно обезвоженном состоянии через свои насосныефункции 1. Лимбус образует границу между роговицей и конъюнктивой, и является резервуаром эпителиальных стволовых клеток роговицы2. Высоко васкуляризованная конъюнктива помогает смазыть глаза, производя слизь и слезы3.

Клеточная динамика структур поверхности роговицы традиционно изучается либо гистологическим анализом, либо культурой клеток в пробирке, которые не могут адекватно имитировать динамику клеток in vivo. Таким образом, неинвазивный подход к живой визуализации может преодолеть такой разрыв. Благодаря своим преимуществам, которые включают высокое разрешение, минимальный фотопамаж и более глубокую глубину изображения, MPM стал мощным условием в различных областяхбиологических исследований 4,,5,,6,,7,,8. Для визуализации роговицы, MPM предоставляет клеточную информацию из внутренней аутофторесценции, полученной из внутриклеточного NAD (P)H. Сигналы второго гармонического поколения (SHG), полученные из не-центросимметрических волокон I коллагена под фемтосекундным лазерным сканированием, обеспечивают коллагеновые стромальные структуры без дополнительных процедурокрашивания 9. Ранее мы и другие группы использовали MPM для визуализации роговицы животных и человека9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.

Трансгенные линии мыши, экспонирующие флуоресцентные белки в конкретных популяциях клеток, широко используются для различных исследований в клеточной биологии, включая развитие, гомеостаз тканей, регенерацию тканей и канцерогенез. Мы использовали трансгенные штаммы мыши помечены флуоресцентными белками для in vivoизображения роговицы 9,10, волосяныефолликулы 10 и эпидермис10 по MPM. Двойной флуоресцентный штамм мыши с клеточной мембраной, помеченной tdTomato и ядром клетки с тегами EGFP, выведен из двух штаммов мыши: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J,#021847)16 и mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR трансгенная линия мыши содержит двойной флуоресцентный белок репортер конструкций, в том числе гена синтеза H2B-EGFP и mCherry-GPI якорный ген синтеза сигнала, вставленный в gt (ROSA)26Sor локус. Трансгенный штамм mT-mG является клеточной мембраной tdTomato и EGFP флуоресцентных мышей Cre-репортер. До рекомбинации Cre белок клеточной мембраны с экспрессией флуоресценции tdTomato широко присутствует в различных клетках. Этот трансгенный штамм мыши позволяет нам визуализировать ядра-EGFP и мембраны с tdTomato без возбуждения Cre. Две самки (R26R-GR)и один самец (mT-mG) трансгеннаямышь были выведены вместе, чтобы произвести достаточно мышей для экспериментов. Их потомство с R26R-GRq/-;mT-mGq/- генотип, двойной флуоресцентный штамм мышей, были использованы в этом исследовании. По сравнению с одной флуоресцентной линиимыши репортера, как описано ранее 9,10, это двойное флуоресцентное напряжение мыши репортер дает нам 50% сокращение приобретения изображений времени.

В этой работе мы описываем подробный технический протокол для виво-изображения глазной поверхности шаг за шагом с помощью нашей платформы визуализации и двойных флуоресцентных трансгенных мышей.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Национального университета Тайваня и Мемориальной больницы Чан Гун.

1. Установка мультифотонной микроскопии

  1. Создайте систему, основанную на вертикальном микроскопе с погружением в воду 20x 1.00 NA цели(рисунок 1A).
  2. Используйте Ti: Сапфировый лазер (с настраиваемой длиной волны) в качестве источника возбуждения. Установите длину волны лазерного выхода на уровне 880 нм для EGFP и 940 нм для tdTomato(рисунок 1A).
  3. Включите два дихроических зеркала (495 нм и 580 нм) для разделения SHG/EGFP и EGFP/tdTomato(рисунок 1A). Спектрально отделить сигналы SHG, EGFP и tdTomato фильтрами полосы 434/17nm, 510/84nm и 585/40nm (Рисунок 1A).
  4. Для того, чтобы оптимизировать качество изображения и избежать фотоотравливания и повреждения тканей, установите мощность лазера около 35 мВт для визуализации роговицы и 50 мВт для лимбуса. Измерьте мощность лазера до того, как лазер пройдет оптическую систему. Точная мощность лазера на образцах составляет около 8-9 мВт. Полная микроскопическая конструкция показана на рисунке 1A.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Верхний предел мощности лазера установлен до 70 мВт, чтобы избежать фото-отбеливания и повреждения тканей.

2. Подготовка животных к живой визуализации

  1. Для эксперимента используйте 8-12-недельных мышей. Внутримышечно вводят 50-80 мг/кг плитки HCl и zolazepam HCl для общей анестезии. Проверьте на отсутствие реакции на вывод рефлекс, щипать ноготь. Достаточная анестезия важна для обеспечения стабильного мониторинга скорости дыхания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши в возрасте 8 недель или выше рекомендуется, потому что их глазные яблоки созрели.
  2. Поместите мышь под наркозом на нагретой стадии и вставьте зонд мониторинга температуры в анус.
    ВНИМАНИЕ: Зонд должен быть полностью вставлен в аниаляционную полость без воздействия воздуха, чтобы избежать перегрева нагревателя и индукции теплового удара.

3. Глаз проведение для живого изображения глазной поверхности

  1. Для живого изображения глазной поверхности используйте специально разработанный стереотаксис держателя мыши, состоящий из двух частей: держатель головы для стабилизации головы и держатель для глаз, чтобы втянуть веки и разоблачить всю глазную поверхность(рисунок 1B-D).
  2. Вставьте ушные батончики во внешний слуховой мясо и поддерживайте трехозорную фиксацию держателя головы(рисунок 1B,D).
  3. Актуально нанесите раствор 0,4% оксибупрокаина гидрохлорида в солевой раствор и оставьте его на 3 мин для обезболить глазную поверхность.
  4. Убедитесь, что глазное яблоко выступает надлежащего ручного опрокидывания век. В противном случае может возникнуть ишемия и кровотечение глазного яблока.
  5. Аккуратно поместите петлю полиэтиленовой трубки подводки для глаз вдоль края век, чтобы разоблачить глазную поверхность. Стабилизировать глазное яблоко с держателем глаза состоит из No 5 Дюмон типсы с его кончиками покрыты петлей полиэтиленовой трубки (Рисунок 1C, D).
  6. Винт force с помощью ручки в дистальных типсов глазного держателя, чтобы сохранить глазное яблоко стабильной (Рисунок 1D).
  7. Нанесите гель для глаз с рефракционным индексом 1.338 на поверхность роговицы в качестве среды погружения для поддержания влажности глазной поверхности каждый час. Кроме того, регулярное применение геля для глаз каждый час позволяет избежать затуманивания роговицы во время визуализации.
  8. Поверните глазное яблоко с держателем, который заблокирован на степпер-моторизованной сцене для визуализации по всей поверхности роговицы от центральной роговицы до периферическойобласти (рисунок 1C,D).
    ВНИМАНИЕ: Как избыточное, так и недостаточное количество геля для глаз может повлиять на качество изображений во время визуализации. Таким образом, дополняя гель для глаз каждый час, чтобы сохранить поверхность влажной регулярно имеет важное значение для визуализации.

4. Приобретение изображений с серийным изображением

ПРИМЕЧАНИЕ: Установите первый и последний слайд в каждом стеке, чтобы уменьшить падение артефактов движения.

  1. Перед тем, как сделать снимки, изображение целевого поля с источником ртутного света.
  2. Нажмите на символ программного обеспечения микроскопа, чтобы включить программное обеспечение.
  3. Выберите правильный прирост PMT и цифровой выигрыш, чтобы визуализировать клеточную структуру на глазной поверхности.
  4. Установите первый слайд и последний слайд, чтобы приобрести стек.
  5. Введите числовые значения для разрешения изображения и z-шага, например, 512 x 512 и 1 мкм в качестве z-шага.
  6. Нажмите на кнопку "Пуск", чтобы собрать z-серийные изображения.
  7. Приобретайте живые изображения дважды в одной и той же области, во-первых, при возбуждении 880 нм для сбора сигналов SHG/EGFP, а во-вторых, при возбуждении 940 нм для сбора сигналов EGFP/tdTomato.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сочетание двух стеков обеспечивает 3 канала изображения. Разрешение изображения и размер формата сканирования были 512 х 512 пикселей и 157 мкм x157 мкм, соответственно.

5. Обработка изображений и 3D реконструкция

  1. Загрузите z-серийные изображения в программное обеспечениеФиджи 18.
  2. Выберите плагин Медианный 3D-фильтр на Фиджи, чтобы уменьшить фоновый шум.
  3. Выберите фильтр «Нерезка» пакета на Фиджи, чтобы отточить изображения.
  4. Нажмите" Auto" в яркости / контрастности, чтобы автоматически оптимизировать качество изображений.
  5. Сохраните изображения в качестве последовательности изображений, чтобы иметь возможность экспортировать z-серийные изображения.
  6. Загрузите z-серийные изображения в коммерческое программное обеспечение (например, Avizo lite) для 3D-реконструкции с использованием рендеринга громкости.
  7. На всех изображениях MPM присутствуют сигналы EGFP, tdTomato и SHG в псевдозеленом, красном и циановом цвете соответственно.
  8. Захват 3D-структуры изображения на снимок.

Результаты

Используя эту живую платформу визуализации, мышь глазной поверхности могут быть визуализированы на клеточном уровне. Для визуализации отдельных одиночных клеток на глазной поверхности мы использовали двойных флуоресцентных трансгенных мышей с EGFP, выраженными в ядре и tdTomato, выраженн?...

Обсуждение

Эта специально построенная платформа MPM изображений с программным обеспечением управления была использована для интравитальной визуализации эпителиальных органов мыши, включаякожу 10,волосяной фолликул 10 иглазную поверхность 9,10...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Благодарим Министерство науки и технологий Тайваня (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), Национальная университетская больница Тайваня (NTUH108-T17) и Мемориальный госпиталь Чан Гун, Тайвань (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AVIZO Lite softwareThermo Fisher ScientificVersion: 2019.3.0
Bandpass filtersSemrockFF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrorsSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIO control softwareSouthPort CorporationJade BIO
Oxybuprocaine hydrochlorideSigmaO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
Polyesthylene TubeBECTON DICKINSON427401
Stereotaxic mouse holderStep Technology Co.,Ltd000111
Ti: Sapphire laserSpectra-PhysicsMai-Tai DeepSee
Upright microscopyOlympusBX51WI
Vidisic GelDr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
ZoletilVirbacVR-2831

Ссылки

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159MPM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены