Оптимизация почечной органоидной и органотипической культуры для васкуляризации, расширенного развития и улучшенной микроскопии

Резюме

Эта работа описывает два метода для изучения развития органов, улучшенная установка ксенотрансплантации на хориоаллантоической мембране (CAM) из птичьих эмбрионов, что позволяет васкуляризировать культивированные эмбриональные органы и органоиды и новый фиксированный z-направление метод культуры органов с измененными экспериментальными условиями, который позволяет с высоким разрешением замедленной конфокальной визуализации.

Аннотация

Эмбриональные почечные органотипические культуры, и особенно плюрипотентные органоиды почек, полученные из стволовых клеток, являются отличными инструментами для следующих процессов развития и моделирования заболеваний почек. Однако модели ограничены отсутствием васкуляризации и функциональности. Для решения этой проблемы был разработан усовершенствованный протокол для метода ксенотрансплантации клеток и тканей к хориоаллантоической мембране (CAM) птичьего эмбриона для получения васкуляризации и восстановления кровотока. Прививки накладываются на заказ мини-водохранилища, которые фиксируют образцы CAM и поставляют их с культурой среды, которая защищает трансплантаты от сушки. Улучшенный метод культуры позволяет ксенотрансвтатам расти до 9 дней. В рукописи также описывается, как обеспечить оптимальные условия для долгосрочной конфокальной визуализации почечных органоидов и органотипических культур с использованием ранее опубликованного метода Fixed -Direction (ФИЗД). Этот метод мягко сжимает эмбриональный орган или органоид между стеклянным крышкой и мембраной в большом количестве среды и обеспечивает отличные условия для визуализации на срок до 12 дней. Вместе эти методы позволяют васкуляризации и приток крови к почечной органоидов и органотипических культур почек с улучшенной конфокальной визуализации. Описанные здесь методы очень полезны для изучения фундаментальных и прикладных функций почек ex vivo. Оба метода применимы к различным типам тканей и органоидов.

Введение

Органотипическая культура эмбриональных почек стала важной моделью для изучения нефрогенеза десятилетия назад^1,,2,,3. Почечные органоиды представляют собой передовую модельсистему для изучения развития здоровых и больных почек^4. Основным недостатком обоих методов, однако, является то, что ни один метод не переоценивает основную функцию почек: фильтрацию крови. Нефроны и почечные сосуды развиваются в почечных органоидах и органотипических культурах подобно ранней стадии развития виво; однако, glomeruli формируется в пробирке остаются сосудистые⁵. Васкуляризация эмбриональных почек ex vivo и почечных органоидов ранее была продемонстрирована в экспериментах по трансплантации только в условиях in vivo. Например, трансплантация плюрипотентных стволовых клеток человека полученных почечных органоидов под капсулой мышиной почки позволяет развитие нефронов в органоидов к функциональной стадии⁶.

Промежуточный подход между чисто культурами in vitro и методами трансплантации in vivo – это ксенотрансплантация к CAM птичьих эмбрионов. Васкуляризация нетронутой мышиной почки примордии была продемонстрирована ранее с помощью этой системы^7,,8. Тем не менее, было также показано, что почечные сосуды в ксенотрансплантации морин почки был получен из принимающей эндотелия, а не трансплантат⁹. Это наблюдение значительно снизило потенциал химерных (авиано-млекопитающих) моделей эмбриональных почек для изучения развития почечной сосуды, поскольку экспериментальные условия были недопустимыми для выживания эндотелиальных клеток, полученных донорами.

В первой части этого протокола представлен усовершенствованный метод выращивания эмбриональных почек мыши на CAM из птичьих яиц, сочетающий микроэкологические условия орханотипической культуры и ксенотрансплантации. Основное улучшение по сравнению с предыдущими методами заключается в том, что вместо размещения мыши эмбриональных почек и почечных органоидов непосредственно на CAM, область имплантации накладывается проницаемыми минивоилидами, заполненными культурой среды, которые поставляют пересаженную ткань с питательными веществами и защитить его от высыхания. Успешность экспериментов значительно возрастает, а условия для развития сосуд, полученных донорами, улучшаются. Применение этого метода ксенотрансплантационным культурам приводит к развитию гломерулярной сосуды, состоящей из эндогенных эндотелиальных клеток донорских почек.

Детальный анализ клеточного морфогенеза является еще одним важным применением моделей культуры почек. Ранее сообщенные методы замедленного получения изображений культур почек достаточны только для анализа общей морфологии и узорства эмбриональных почек, но не для отслеживания отдельных клеток^10. Недавно был^описанновый метод Fixed-Direction (ФИЗД), направленный на высокое разрешение конфокальной 3D-замедленной визуализации почечных органоидов и органотипических культур. В этом методе органоиды и эмбриональные органы аккуратно сжимаются между стеклянным покрытием и проницаемой мембраной вставки трансвелл в специально разработанной пластине до тех пор, пока толщина образца не достигнет 70 мкм, обеспечивая оптимальные оптические условия для визуализации. Во второй части методов описан подробный протокол для изготовления специально разработанной пластины и настройки экспериментов по физподготовке для долгосрочного органоидного изображения.

протокол

Уход за животными и процедуры соответствовали финскому национальному законодательству об использовании лабораторных животных, Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (ETS 123), и Директивы ЕС 86/609/EEC.

1. Изготовление минивоилидляций для выращивания эмбриональных почек мыши и почечных органоидов на курином CAM и создание экспериментов по ксенотрансплантации

1. Используйте вставки культуры клеток Transwell, предназначенные для 6 скважин или 12 колодцев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от конкретного эксперимента можно использовать большие или малые минивоили. Лучше всего использовать небольшие минивомеры для ксенотрансплантации до восьми эмбриональных почек или когда несколько минивоберных будет помещено на тот же куриный эмбрион (например, экспериментируйте и контролируют образцы на том же курином CAM).
2. Урежьте стороны вставок с помощью роторного мультиинструмента с круговым лезвием пилы или ручной пилой, чтобы создать пластиковое кольцо высотой 2 мм с прилагаемой к нему проницаемой мембраной.
3. Польский края этих минивоили скальпелем или острым ножом.
4. Стерилизовать минивоидоки в 70% этанола, по крайней мере 1 ч.
5. Вымойте минивоили в автоклавированной двойной дистиллированной воде и дайте им высохнуть в ламинарном капюшоне.
6. Промыть минивоили в PBS и культуры среды (высокоглюкозный DMEM/10% FBS/1% пенициллин-стрептомицин).
7. Поместите резервуар в чашку Петри, на вершине капли (600 л/400 л) культуры среды с мембраной вверх.
8. Равномерно расположите всхождные эмбриональные почки ex vivo или почечные органоиды на мембране с помощью пипетки или стеклянной капиллярной трубки. Не оставляйте много жидкости вокруг почек.
9. Пусть образцы прикрепляются к мембране для 2-24 ч в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% CO_2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: До восьми E11.5 эмбриональных почек мыши или почек органоидов могут быть расположены на небольшой вставке. Большая вставка рекомендуется, если либо большие куски эмбриональной ткани будут использоваться для ксенотрансплантации или клеточной гидрогеля смеси на большей площади CAM.
10. Возьмите 8-дневный ex ovo культивированных эмбриональных кур, подготовленных в соответствии с ранее опубликованными методами из инкубатора клеточной культуры^12,13.
11. Передача минивоиликов в CAM так, что трансплантаты сталкиваются CAM, и мембрана накладывает их. Поместите минивоили на периферию CAM, чтобы они не покрывали куриный эмбрион.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании небольших минивоиливодов, изготовленных из вставок Transwell для 12 скважин ных пластин, до трех минивоберных вод можно разместить на одном CAM.
12. Добавьте 500 кЛ (6 хорошо вставить) или 300 кЛ (12 хорошо вставить) культуры среды для мини-водохранилища.
13. Культивировать образцы на куриный CAM в течение максимум 9 дней. Заменить среду культуры в минивоили ежедневно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Васкуляризация образцов может наблюдаться, как только 24-48 ч после трансплантации.

2. Изготовление специально разработанных пластин и создание культур ФИЗД

1. Просверлите отверстия диаметром 20 мм в нижней части 6 скважины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с ФИЗД используйте 6 пластин скважин с глубиной 16 мм (указано в таблице материалов).
2. Польский ободки отверстий (особенно на верхней стороне) с помощью электрического сверла с контрсверлом бит, скальпель, или острый нож.
3. Стерилизовать пластины в 70% этанола, по крайней мере 1 ч.
4. Вымойте пластины в автоматической двойной дистиллированной воды и дайте им высохнуть в стерильных условиях.
5. Тщательно мыть 22 мм х 22 мм стекла охватывает с 70% этанола или очистить их в соответствии с опубликованным протоколом Saarela et al.¹¹.
6. Клей крышкискользит к верхней стороне отверстия в 6 хорошо пластин с помощью нетоксичные ткани клея. Нанесите клей вокруг отверстия и аккуратно поместите крышку, чтобы покрыть его. Дайте клею высохнуть.
7. Осмотрите пластины под стереомикроскопом и удалите избыток сушеного клея с поверхности покрывал, если это необходимо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что нет никакого клея над крышкой, чтобы обеспечить даже сжатие образцов.
8. Смешайте полистирол-бусин (размер частиц 70 мкм) с равным объемом гидрогеля. Достаточно объема 50-100 л на скважину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите смесь гидрогеля и полистирола шарики на льду.
9. Поместите трансвелл вставить под рассекающий микроскоп с мембраной вверх.
10. Равномерно расположите образцы (например, эмбриональные почки ex vivo или почечные органоиды) равномерно.
11. Добавить смесь гидрогеля / полистирола рядом с образцами тщательно, чтобы избежать повреждения хрупких тканей.
12. Переверните вставку Transwell так, чтобы мембрана с собранными на ней образцами оказалась вниз.
13. Аккуратно поместите вставку в колодец из модифицированной 6 хорошо пластины и аккуратно нажмите его вниз, чтобы образцы сжаты до уровня бисера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за ходом сжатия с помощью микроскопа.
14. Держите вставку слегка прижатой к колодцу одной рукой и зафиксировать ее к пластине, плавя пластик с паяльником в трех точках на периферии вставки.
15. Когда вставка крепится к пластине, добавьте 2 мл культуры среды (DMEM/10% FBS/1% пенициллин-стрептомицин) в колодец и продолжить сборку оставшихся скважин в пластине таким же образом.
16. Перенос готовой пластины в инкубатор на сцене перевернутого микроскопа для визуализации замедленного действия.
17. Выполняйте замедленное изображение образцов с использованием соответствующих экспериментальных настроек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение культуры среды в колодцах пластины во время замедленного экспериментов не требуется, но может быть легко сделано через отверстия по бокам вставки.

Результаты

Представленный здесь протокол культуры CAM позволил высокоэффективной васкуляризации почечных органоидов и эмбриональных почек в результате ксенотрансплантации на курином CAM(рисунок 1, Фильм 1). Минивоили, содержащие культурную среду, поставляли питательные в?...

Обсуждение

Представлены два подробных протокола, которые усовершенствуют классический метод почечной арганотипической культуры и позволяют васкуляризировать, расширенное развитие и оптимальное 4D-изображение и время изображения эмбриональных почек и органоидов. В этом разделе освещаются крит...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610