JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) является высокочувствительным, надежным и простым в выполнении методом обнаружения обратимой липидной модификации остатков цистеина (S-acylation) в различных биологических образцах.

Аннотация

Белок S-ациляция, также называют S-palmitoylation, является обратимой пост-переводной модификации цистеина остатков с длинноцепочечными жирными кислотами через лабильное тиоэфирное крепление. S-ациляция, которая становится широко распространенным регулирующим механизмом, может модулировать почти все аспекты биологической активности белков, от комплексного образования до торговли белками и стабильности белка. Недавний прогресс в понимании биологической функции белка S-acylation был достигнут в значительной степени благодаря разработке новых биохимических инструментов, позволяющих надежно и чувствительное обнаружение белка S-ацилирования в различных биологических образцах. Здесь мы описываем ацил-ресинуажный захват (Acyl-RAC), недавно разработанный метод, основанный на селективном улавливании эндогенно S-ацилатированных белков тиол-реактивными бусинами сефарозы. По сравнению с существующими подходами, Acyl-RAC требует меньше шагов и может дать более надежные результаты в сочетании с масс-спектрометрией для идентификации новых целей S-acylation. Основным ограничением в этой технике является отсутствие способности различать виды жирных кислот, прикрепленных к цистеинам через ту же связь тиостера.

Введение

S-ациляция является обратимой пост-трансляционной модификации с участием добавления жировой цепи ацила к внутренним остаткам цистеина на целевой белок через лабильный тиоэфир облигации1. Впервые сообщалось, как модификация белков с palmitate, насыщенных 16-углеродной жирной кислоты2, и поэтому эта модификация часто называют S-palmitoylation. В дополнение к пальмитату, белки могут быть обратимы различными более длинными и короткими насыщенными (миристейстом и стеатом), мононенасыщенными (олеатом) и полиненасыщенными (арачидонаинат и эйкозапентановат) жирными кислотами3,,4,5,,6,,7. В эукариотических клетках, S-ацилирование является катализатором семьи ферментов, известных как DHHC белка ацилтрансферазы и обратная реакция цистеина деакилиации является катализируется белка thioesterases, большинство из которых до сих пор остаются загадочными8.

Lability связи тиоэстера делает эту липидную модификацию обратимой, позволяя ей динамически регулировать кластеризацию белков, локализацию плазменной мембраны, внутриклеточный оборот, белково-белковые взаимодействия и стабильность белка9,10. Следовательно, S-акилирование было связано с несколькими расстройствами, включая болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера и несколько видов рака (простата, желудок, мочевой пузырь, легкие, колоректальные), что требует разработки надежных методов для обнаружения этого пост-переводного белка модификации11.

Метаболическая маркировка с радиоактивным (No3H,14C) или125Я) palmitate был одним из первых подходов, разработанных для проверки белка S-ацилинг12,13,14. Тем не менее, радиомаркировка на основе методов настоящее здоровье проблем, не очень чувствительны, отнимает много времени, и только обнаружить липидацию очень обильные белки15. Быстрее и нерадиоактивной альтернативой радиомаркировке является метаболическая маркировка биоортогональными жирными кислотными зондами, которые регулярно используются для проверки динамики белка S-acylation16. В этом методе, жирные кислоты с химическим репортером (алкин или азид группы) включена в S-ацилатированный белок белка ацилтрансферазы. Азидея-алкин huisgen циклоaddition реакции (нажмите химии) может быть использован для присоединения функционализованной группы, такие как фторофор или биотин, к интегрированной жирной кислоты, что позволяет для обнаружения S-ацилатированный белок17,18,19.

Ацил-биотин обмен (ABE) является одним из широко используемых биохимических методов для захвата и идентификации S-ацилатных белков, что обходит некоторые недостатки метаболической маркировки, такие как непригодность для образцов тканей15. Этот метод может быть применен для анализа S-ациляции в различных биологических образцов, в том числе тканей и замороженных образцов клеток20,21. Этот метод основан на селективном расщеплении тиоэстерной связи между ациловой группой и остатками цистеина нейтральным гидроксиламином. Освобожденные группы тиола затем захватываются с тиол-реактивной производной биотина. Генерируемые биоинтинилапотированные белки затем сродство очищается с помощью стрептавидина агарозы и анализируются с помощью иммуноблоттинга.

Альтернативный подход называется acyl-resin помощь захвата (Acyl-RAC) был позже введен, чтобы заменить биотинилационный шаг с прямым спряжением свободных цистеинов тиол-реактивного ресина22,23. Этот метод имеет меньше шагов по сравнению с ABE и аналогичным образом может быть использован для обнаружения белка S-ациляции в широком диапазоне образцов1.

Acyl-RAC состоит из 4 основных ступеней(рисунок 1),
1. Блокирование свободных групп тиола;
2. Селективное расщепление цистеино-ациловый тиоэстер связи с нейтральным гидроксиламином (HAM) для разоблачения цистеина тиол групп;
3. Захват липидных цистеинов с тиол-реактивным ресином;
4. Избирательное обогащение S-ацилатированных белков после elution с уменьшением буфера.

Захваченные белки могут быть проанализированы с помощью иммуноблоттинга или подвергнуты массовой спектрометрии (MS) на основе протеомики для оценки S-ацилата протеома в различных видов и тканей22,24,25. Индивидуальные s-ацилирования сайты также могут быть определены путем трипсина переваривания захваченных белков и анализа в результате пептиды LC-MS/MS22. Здесь мы демонстрируем, как ацил-РАК может быть использован для одновременного обнаружения S-ацилирования нескольких белков как в клеточной линии, так и в образце ткани.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Мыши, используемые в этом протоколе, были усыплены в соответствии с руководящими принципами NIH. Комитет по защите животных в Научном центре здравоохранения Техасского университета в Хьюстоне одобрил все работы с животными.

1. Подготовка клеточных лисатов

  1. Подготовка буфера лиза, описанного в таблице 1. До 10 мл PBS, добавить 0,1 г n-dodecyl й-D-maltoside моющего средства (DDM) и повернуть, чтобы растворить. Добавьте 100 л ингибитора фосфатазы коктейль 2, ML211 (10 мкм), PMSF (10 мМ) и коктейль-ингибитор протеазы (1x) и охладите буфер на льду перед использованием.
  2. Передача необходимых носителей, содержащих клетки из инкубатора в 15 мл или 50 мл конических труб и спиновых клеток на 350 х г в течение 5 минут и аспират, чтобы избавиться от любого мусора клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали 1 х 107 клеток для каждой реакции acyl-RAC, которая будет выполнена.
  3. Вымойте гранулы, отостановив его в 5 мл PBS и спиннинг на 350 х г в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 1.3 быстро, чтобы избежать лиза клетки из-за расширенной инкубации в PBS.
  4. Добавьте 600 кЛ буфера лисиса, подготовленного в шаге 1.1 к грануле, и лисите его, встряхнув при 1500 об/мин в термальной шейкере в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
  5. Очистить лисаты центрифугированием при 20 000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин до гранулы нерастворимых материалов. Соберите очищенный лизат в предварительно охлажденных 1,5 мл микрофуга труб и держать их на льду.
  6. Выполните анализ Брэдфорда/BCA для оценки концентрации белка. Очень важно обеспечить одинаковое количество белка в различных образцах до проведения эксперимента. Мы рекомендуем использовать не менее 500 мкг белка в реакции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В описанных экспериментах мы использовали культивированные (джуркатские) клетки и первичные спленоциты из тканей мышей. Метод лиза, описанный выше, может быть принят и на другие типы клеток. Средняя концентрация белка, полученная для вышеупомянутых типов клеток, составляет примерно 500 мкг на 1 х 107 клеток. Клетки Jurkat были сохранены в RPMI-1640 средних модифицированных содержать 2 мМ L-глютамин, 10 мМ HEPES, 1 мМ натрия пируват, 4500 мг/л глюкозы, и 1500 мг/л бикарбоната натрия дополнены 10% FBS при 37 С с 5% CO2. Мы использовали 1 х 107 Юркат клеток в реакции. Первичные спленоциты были выделены из ткани селезенки мыши, как описано26. Кратко, селезенки ткани были macerated на льду, последовано за lysis эритроцитов в hypotonic растворе и разъединение от лимфоцитов центрифугированием. Мы использовали 1 х 107 первичных клеток в реакции.

2. Acyl-RAC: Блокирование бесплатных групп тиола

ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги могут быть выполнены при комнатной температуре (RT).

  1. Передача лизата в свежий 1,5 мл микрофуговой трубки и выполнить хлороформ-метанол (СМ) осадков, как описано ниже.
    1. Добавьте метанол (MeOH) и хлороформ (CHCl3) в лизат в окончательном соотношении лизата: MeOH: CHCl3 2:2:1 и энергично встряхните, чтобы создать однородную подвеску.
    2. Спин при 10 000 х г в течение 5 мин, чтобы сформировать гранулы ("блин") на межфазах между водной и органической фазами.
    3. Наклон трубки и аспирировать столько растворителя, как это возможно с помощью иглы или гель загрузки отзыв.
    4. Воздух высушить протеиновые гранулы в течение нескольких минут и осторожно промыть его, добавив 600 л МЕОи и аккуратно перемешивая, чтобы избежать разрушения гранул
    5. Аккуратно удалите оставшиеся MeOH и высушите белковые гранулы на скамейке примерно в течение 5 минут.
    6. (Необязательно) Выполните дополнительный шаг центрифугации, чтобы спина вниз любой сломанной гранулы после мытья MeOH, чтобы избежать потери образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть остановлен после шага осадков СМ. Как только гранулы получены, он может храниться в 500 Л МЕОв в -20 градусов по Цельсию до недели.
      1. Растворите белковые гранулы в 200 qL буфера 2SHB путем вихря при 42 Градусах/1500 об/мин в термальной шейкере до растворения гранул.
    7. (Необязательно) Инкубировать в течение еще 5-10 минут в звуковой водяной бане, чтобы растворить гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина звуковой варьируется в зависимости от растворимости материала. Однако длительное соникирование может привести к деградации белка.
  2. Приготовьте 0,2% метилметанесульфонат (MMTS) (v/v) в 2SHB, добавив 2 ЗлмЭ ММТС до 998 Л буфера 2SHB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежеприготовленные 0,2% MMTS для каждого эксперимента.
  3. Добавьте 200 л 0,2% MMTS в 2SHB к каждой трубке до конечной концентрации 0,1% MMTS. Инкубировать в течение 15 мин при 42 градусах Цельсия при встряхивании при 1500 об/мин в термальной шейкере.

3. Acyl-RAC: Гидроксиламин (HAM) расщепление и захват S-ацилатированных белков

  1. Повторите 3-4x CM осадков, как описано выше, чтобы удалить MMTS. Удаление MMTS можно оценить по отсутствию четкого запаха MMTS. После каждого осадка растворите гранулы в 100 л буфера 2SHB путем вихря при температуре 42 градусов по Цельсию/1500 об/мин в термальной шейкере до растворения гранулы, а затем разбавьте 300 л буфера А.
  2. После окончательного выпадения осадков, растворить образцы в 200 qL 2SHB буфера, как описано выше, и разбавить с 240 зл буфера А.
  3. В случае сравнения изменений в S-ациляции в ответ на несколько условий лечения, измерять концентрацию белка снова и приступить с равным количеством белка для каждого условия.
  4. Сохранить 40 qL от каждого образца в качестве входному элемента управления.
  5. Разделите образцы на две равные части по 200 qL и отметьте трубки как «я ХАМ» и «- HAM». Добавьте 50 qL свежеприготовленных нейтральных 2 M HAM (pH 7.0-7.5) к конечной концентрации 400 мМ к одной из труб (я. HAM) и 50 зл нейтрального 2 M NaCl ко второй трубке (- HAM), которая будет использоваться в качестве отрицательного контроля. Приступайте к добавлению бисера тиопропил-сефароз (TS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть остановлен после любого из шагов выпадения CM. Как только гранулы получены, он может храниться в 500 Л МЕОв в -20 градусов по Цельсию до недели. Нейтральный рН 2 М HAM обеспечивает его избирательность для ацил-цистеина тиоэстера связи и должны быть тщательно скорректированы. Следует внимательно позаботиться при обработке образцов в буфере 2SHB, чтобы избежать потери образца из-за чрезмерного пенообразующего. Все следующие шаги идентичны для - образцы HAM и HAM.
  6. Добавьте 30 зЛ бисообразной суспензии tS к каждой трубке и поверните трубки на 1-2 ч на РТ.
  7. Вымойте TS бисер 4x с 1% SDS в буфере А, чтобы удалить остаточный HAM.
    1. Аккуратно раскрутите все образцы бисера с помощью микрофуга в течение 1 мин и тщательно аспирируйте супернатант.
    2. Приостановить действие бисера в 500 л 1% SDS в буфере А.
    3. Повторите шаг 3.7.1-3.7.2 трижды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активированный тиопропил-сефароз (TS) поставляется лиофилизированным в присутствии добавок, которые необходимо смыть при нейтральном рН перед свалкой. Дистиллированная вода рекомендуется для отеков и мытья. Взвесьте 0,1 г бисера и resuspend в 1 мл дистиллированной воды и дайте ему набухать при повороте в течение 30 мин-1 ч на RT. Мыть ебес 1x с буфером А и подготовить суспензию с буфером А, в соотношении 50% поселились среднего до 50% буфера. Опухшие ТС могут храниться при нейтральном рН при наличии 20% этанола при 4 градусах Цельсия до недели. Не используйте азид натрия в качестве бактериостатического агента, так как ионы азида реагируют с 2-пиридил дисульфидных групп. Для повышения эффективности приготовьте свежие бусы. При обработке бисера, кончик p200 пипетка отзыв может быть сокращен немного, с тем чтобы предотвратить любые повреждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть остановлен на любом этапе после выпадения см. Гранулы могут храниться в 500 мэох в -20 градусов по Цельсию до недели.

4. Улавливание и обнаружение S-ацилатированных белков

  1. После последней стирки, осторожно спина вниз бисер, как описано выше, и аспирить столько супернатант насколько это возможно, не нарушая бисер.
  2. Восстановление белков из бисера с 4x SDS образец буфера с DTT.
    1. Добавьте 50 qL 4x sDS образец буфера к бисеру и инкубировать при 80 градусах Цельсия, 1500 об/мин в течение 15 минут в термальной шейкере. Дайте трубкам остыть.
    2. Centrifuge бисер на 5000 х г в течение 3 мин, чтобы полностью гранулы бусы и передачи элетированных белков в свежие 1,5 мл трубки с помощью гель загрузки отзыв.
  3. Выполнить SDS-PAGE и проанализировать S-ацилирование белка (ы) интерес западной blotting.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Следуя описанному выше протоколу, мы впервые использовали ацил-РАК для одновременного обнаружения S-ацилирования нескольких белков в клетках Jurkat, увековеченной линии Т-клеток, первоначально полученной из периферической крови пациента с лейкемией Т-клеток27. Регуляторные ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы успешно использовали ацил-RAC анализ для обнаружения S-ацилирования отдельных белков как в культивированных человеческих клеток и первичных клеток, полученных из ткани мыши. Этот метод прост, чувствителен и может быть легко выполнен с минимальными требованиями к оборудованию с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Конфликта интересов не было заявлено.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения грантов 5R01GM115446 и 1R01GM130840.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tabletsSigma11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424Eppendorf22620444
Hydroxylamine (HAM)Sigma159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS)Sigma64306
Mini tube rotatorLabForce
ML211Cayman17630
Multi-Therm Cool-Heat-ShakeBenchmark ScientificH5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM)SigmaD641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2SigmaP5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)SigmaT8387
Ultrasonics Quantrex SonicatorL & R

Ссылки

  1. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
  2. Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
  3. Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
  4. DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
  5. Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
  6. Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
  7. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
  8. Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206(2008).
  9. Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
  10. Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
  11. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).
  12. O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
  13. Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
  14. Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
  15. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
  16. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
  17. Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
  18. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
  19. Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
  20. Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
  21. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
  22. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  23. Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  24. Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
  25. Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  26. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
  27. Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
  28. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
  29. Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
  30. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
  31. Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
  32. Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
  33. Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
  34. Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
  35. Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
  36. Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
  37. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
  38. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

158SAcyl RAC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены