Использование капиллярного генератора аэрозолей в непрерывном производстве контролируемого аэрозоля для доклинических исследований

Резюме

Протокол описывает настройки и использование капиллярного генератора аэрозолей для непрерывного производства контролируемого аэрозоля из многовидового жидкого раствора, подходящего для устойчивой доставки аэрозолей большого объема (например, исследования in vivo in vivo inhalation).

Аннотация

Капиллярный генератор аэрозолей (CAG) работает с принципом теплового испарения жидкости путем нагрева электронной жидкости в начальной фазе с последующим нуклеацией и конденсацией, регулируемыми через смесь воздушного потока для образования аэрозолей, таких как в электронной сигарете (EC). ЦАГ особенно полезен при непрерывном образовании аэрозолей больших объемов, например, в таких случаях, как ингаляционные токсикологические исследования in vivo , где использование ЭК нецелесообразно. Тепловые эффекты образования аэрозоля из ЦАГ аналогичны с точки зрения температуры, применяемой в ЕС, что позволяет исследователям оценивать пары электронных жидкостей в масштабе и воспроизводимости. Поскольку работа CAG позволяет пользователям контролировать критические параметры, такие как скорость потока электронной жидкости, температуры нагрева и потоки разрежающего воздуха, это позволяет исследователям тестировать различные составы электронной жидкости в хорошо контролируемом устройстве. Показано, что свойства, такие как размер частиц аэрозоля, регулируются скоростью потока воздуха по отношению к потоку электронной жидкости и составу электронной жидкости. CAG, однако, ограничен в оценке общих проблем, связанных с ЕС, таких как перегрев его элементов. Мы стремимся продемонстрировать, что CAG может генерировать аэрозоль, который является воспроизводимым и непрерывным, путем оценки химических и физических характеристик аэрозоля с выбранным составом электронной жидкости. Протокол описывает рабочие параметры расхода жидкости, скорости потока разрежающего воздуха и рабочие процедуры, требующие оптимизации концентрации аэрозолей и размера частиц, необходимых для токсикологического исследования in vivo . Представляя репрезентативные результаты протокола и обсуждая проблемы и приложения работы с CAG, мы демонстрируем, что CAG можно использовать воспроизводимым образом. Технология и протокол, которые были разработаны на основе предыдущих работ, служат основой для будущих инноваций в исследованиях генерации аэрозолей с лабораторным контролем.

Введение

Обычные электронные жидкости содержат смесь пропиленгликоля, глицерина, воды, никотина и отдельных ароматизаторов. Состав аэрозоля, образующегося из устройства ЕС, зависит не только от жидкой композиции, но и от материала, конструкции и характеристик устройства. Следовательно, многие устройства ЕС могут вносить большую вариабельность в выход аэрозоля¹, включая производство для конкретного устройства повышенных уровней нежелательных компонентов, изменение объема затяжки, изменение воздушного потока из-за заблокированных вентиляционных отверстий и «сухое пыхтение» (когда контейнер для жидкости почти пуст, вызывая перегрев устройства, поскольку часть доставляемой энергии не используется для испарения жидкости)² . Кроме того, зарядка, заправка и очистка устройств EC во время долгосрочных ингаляционных исследований станет огромным дополнительным ограничением с точки зрения логистики³. По этим причинам следует рассмотреть другие генераторы аэрозолей для крупномасштабного производства аэрозолей и надлежащей оценки жидких составов, избегая при этом связанных с устройством изменений в составе аэрозолей и уменьшая рабочую нагрузку ^4,5. Тем не менее аэрозоли, генерируемые устройствами, должны оставаться частью стратегий оценки риска, поскольку уровни некоторых компонентов в устройствах ЕС могут быть более высокими, чем в стандартизированных генераторах аэрозолей с лабораторным управлением, в силу особенностей нагрева/охлаждения устройств ^6,7,8.

Из-за ограниченности имеющейся в настоящее время информации о нормативных требованиях методы оценки потенциальной токсичности аэрозолей, образующихся электронными сигаретами (ЕС), все еще развиваются ^9,10,11. Однако точная оценка in vitro и in vivo требует генерации хорошо охарактеризованных и воспроизводимых объемов аэрозоля с течением времени. Производство аэрозоля из устройства ЕС с контролируемым режимом пыхтения, безусловно, было бы наиболее репрезентативным процессом с точки зрения потребления пользователем. Для нормативных исследований токсичности, учитывая разнообразие возможных жидких составов, которые пользователи часто могут готовить самостоятельно, и в то же время изменяя некоторые характеристики устройства (например, доставляемую энергию), использование устройств ЕС для проведения долгосрочных токсикологических исследований с повторным воздействием является не только сложным, но и потенциально неадекватным.

Капиллярный генератор аэрозолей (CAG), разработанный Philip Morris^12,13 и доработанный Университетом Содружества Вирджинии¹⁴, работает по принципу создания струи потока горячего пара из электрически нагретого капилляра, который впоследствии охлаждается окружающим воздухом, вызывая образование ядра частиц и последующую конденсацию, что приводит к образованию аэрозолей. Поскольку одни и те же физические процессы приводят к образованию аэрозолей в ЭК (помимо доставки жидкости в капилляр насосом в ЦАГ, который в ЭК обычно заменяется капиллярными силами, действующими на впитывающий материал, вытягивающий жидкость из резервуара в ЕС), характеристики аэрозолей, генерируемых ЦАГ, очень похожи на характеристики аэрозолей ЕС¹⁴ (рисунок 14). ). CAG позволяет производить большие объемы аэрозоля с небольшими требованиями к обращению; поэтому он особенно подходит для ингаляционных исследований in vivo.

CAG представляет собой лабораторное устройство, состоящее из нагретой капиллярной трубки, просто соединенной с регулятором температуры и резервуаром для жидкости через перистальтический насос (рисунок 2A). Капилляр (160 мм, 21 G, нержавеющая сталь) нагревается четырьмя нагревательными элементами, встроенными в алюминиевый блок (рисунок 2B). Температура обычно устанавливается на уровне 250-275 °C, чтобы имитировать условия нагрева катушки устройства^{EC 15}. Жидкость, прокачиваемая через капилляр, нагревается и превращается в горячий пар, выходящий из кончика капилляра. Сборка CAG (рисунок 2C) требует дополнительных элементов для смешивания образующегося пара с холодным воздухом и формирования аэрозоля. Резкое перемешивание горячего перенасыщенного пара с потоком холодного воздуха приводит к зарождению и последующей конденсации, что приводит к образованию аэрозолей (рисунок 2C). В нашей конструкции CAG (рисунок 3) дополнительный нагретый воздушный поток сначала охлаждает внешний корпус, а затем циркулирует вдоль нагревательных блоков, чтобы нагреть воздушный поток, предотвращая в то же время конденсацию обратного потока жидкости на кончике капилляра и стабилизируя взрыв струи пара. Кроме того, он создает нежелательное экранирование горячих паров, тем самым влияя на процесс нуклеации. По этой причине расход, применяемый для этого воздушного потока, должен быть минимальным и соответствовать цели приложения. Этот воздушный поток будет называться «нагретым воздушным потоком» на протяжении всей этой рукописи, хотя следует понимать, что этот поток нагревается пассивно нагревательными блоками, а не намеренно пользователем.

Скорость потока охлаждающего воздуха оказывает сильное влияние на размер образующихся аэрозольных частиц. При производстве аэрозолей для ингаляционных исследований in vivo поток разрежающего воздуха будет определять дозу воздействия и, возможно, его придется дополнительно разбавлять до достижения экспозиционной камеры. Помимо химического состава аэрозолей, важно охарактеризовать распределение частиц аэрозоля по размерам (PSD) для обеспечения того, чтобы образующийся аэрозоль был аналогичен образующемуся ЭК и находился в пределах диапазона размеров ингаляционных частиц, рекомендованного руководящими принципами ОЭСР (часто параметризуемого предположением о логарифмической нормальности PSD со средним аэродинамическим диаметром массы [MMAD] и геометрическим стандартным отклонением [GSD]).

MMAD образующихся аэрозолей может широко варьироваться в зависимости от конструкции устройства, физико-химических свойств жидкости состава (например, плотности, вязкости и поверхностного натяжения), скорости воздушного потока и температуры, диктующей термодинамические условия 14,16,17. Для экспериментов по воздействию in vivo воздушный поток обычно состоит из кондиционированного, отфильтрованного воздуха при 22 ± 2 °C и 60% ± 5% относительной влажности. Полученный аэрозоль затем может быть дополнительно разбавлен в зависимости от требований исследования для достижения целевых концентраций в испытательной атмосфере. Затем он подается по стеклянному трубопроводу в экспозиционную камеру, чтобы уменьшить потери фильтрации. В результатах, представленных здесь, установлены настройки температуры и воздушного потока, чтобы продемонстрировать, что CAG может быть использован для непрерывного производства контролируемого аэрозоля с последовательным и ингаляционным PSD и определенными концентрациями для ингаляционных исследований in vivo.

В протоколе мы опишем, как: 1) собрать CAG, 2) определить параметры, необходимые для генерации аэрозоля из CAG, 3) выполнить генерацию аэрозоля и 4) проанализировать физические и химические составляющие, представляющие интерес в аэрозоле. Для этих предварительных прогонов мы рассматриваем жидкий раствор на основе смеси аэрозоль-образующих компонентов: пропиленгликоля (PG), глицерина (VG), воды и никотина на заданных массовых долях. Наконец, мы поделимся примерными данными для оценки сложной многовидовой смеси, полученной в наших экспериментах (с участием вышеупомянутых компонентов, смешанных с дополнительными вкусовыми составляющими). Мы обсудим общие результаты и проблемы, а также применимость этого экспериментального подхода к оценке таких смесей.

протокол

1. Сборка системы CAG

1. Сборка ЦАГ
   1. Поместите капилляр в капиллярную канавку алюминиевых нагревательных блоков, с выходным концом, выступающим примерно на 5 мм.
   2. Слегка затяните винты двух половинок алюминиевых нагревательных блоков.
   3. Соберите нагревательные элементы (a) и термопару (b) в алюминиевые нагревательные блоки (c), с проводами, выступающими через алюминиевую заднюю крышку (d) (рисунок 4A).
   4. Убедитесь, что провода нагревательных элементов подключены к адаптеру и убедитесь, что они прямые.
   5. Соберите внутреннюю трубку PEEK (g) с наружной трубкой SS (e). Убедитесь, что вставные фитинги (f) размером 2 x 4 мм плотно закреплены на наружной трубке SS (e) (рисунок 4B).
   6. Поместите уплотнительные кольца (3 x 30 мм) на две канавки внутренней трубки PEEK (g) и вставьте внутреннюю трубку PEEK (g) во внешнюю трубку SS (e) с передней части.
   7. Поместите собранные алюминиевые нагревательные элементы на заднюю подложку SS (i) с алюминиевой задней крышкой, обращенной к задней подложке SS, и сдвиньте внутреннюю сборку трубы PEEK /внешней SS над алюминиевыми нагревательными элементами, чтобы плотно прилегать к задней подложке SS (i) (рисунок 4C).
   8. Поместите алюминиевый передний колпачок (h) поверх алюминиевого нагревательного элемента, внутри внутренней трубки PEEK. Убедитесь, что капилляр слегка выступает из алюминиевой передней крышки. Установите три свинцовых винта SS (j) вокруг задней подложки SS и плотно затяните.
   9. Поместите адаптер PEEK (k) над внутренней передней частью трубки PEEK. Убедитесь, что адаптер PEEK помещается на передней канавке внутренней трубки PEEK. Поместите планировщик 25 мм (l) поверх адаптера PEEK и через три свинцовых винта SS. Вручную затяните гайки над планировщиком так, чтобы адаптер PEEK был плотным (рисунок 4D).
   10. Подключите нагревательные элементы к регулятору температуры, а капилляр к перистальтическому насосу и исследуемому жидкому раствору.
   11. Подключите сжатый воздух для потока нагретого воздуха к CAG с помощью вставных фитингов размером 2 x 4 мм (рисунок 4B, [f]).
   12. Соберите CAG к стеклянной части и подключите охлаждение CAG и первые потоки разрежающего воздуха (обработанный воздух; Рисунок 3). При необходимости добавить вторую запись о расходе разрежения, а также отверстия для отбора проб аэрозолей и нормативный Т-образный переход (рис. 5).
2. Процедура CAG-очистки
   1. Извлеките CAG из установки для сборки стекла CAG и очистите стекло сухими салфетками до тех пор, пока стекло не станет заметно сухим.
   2. Наблюдайте за капиллярным выходом из ЦАГ для обструкции. Если осаждение частиц можно наблюдать на выходе капилляра, измените капилляр. Аналогичным образом, заметив снижение доставки аэрозоля, замените капилляр новым.
   3. Разберите CAG, выполнив шаги 1.1.9-1.1.1.
   4. Повторно соберите CAG после выполнения шагов 1.1.1-1.1.9 после изменения капилляра.

2. Расчет концентрации и разбавления аэрозоля CAG

1. Теоретический расчет TDF
   1. Рассчитайте TDF на основе концентрации жидкого состава (здесь называемого стоковым раствором / концентрацией) и LFR:
      
      TDF: общий расход разрежающего воздуха (л/мин)
      C_Запас: концентрация запасов 2%, мас./мас.)
      LFR: расход жидкости (г/мин)
      C_{Целевой показатель}: целевая концентрация (мкг/л)
   2. Используя раствор с 2% (мас./мас.) никотином, с целевой концентрацией никотинового аэрозоля в 15 мкг/л и ЛФР 0,35 г/мин, предположим, что 100% выход будет следующим:
      
      
2. Теоретический расчет LFR
   1. Рассчитайте LFR на основе концентрации жидкого раствора и TDF:
      
      LFR: расход жидкости (г/мин)
      C_{Целевой показатель}: целевая концентрация (мкг/л)
      TDF: общий расход разрежающего воздуха (л/мин)
      C_Запас: концентрация запасов (%, мас./ мас.)
   2. Используя раствор с 2% (мас./мас.) никотином, с целевой концентрацией никотинового аэрозоля в 15 мкг/л и TDF 300 л/мин, предположим, что 100% выход будет следующим:
      
      
3. Расчет фактической урожайности (%) на основе экспериментальных данных
   1. Основываясь на приведенных выше теоретических расчетах, выполните первоначальные инженерные прогоны для количественной оценки _{фактической} концентрации компонентов аэрозоля (C Actual) и получения фактического выхода (AY) аэрозоля CAG. Выполните дальнейшую тонкую настройку концентрации аэрозоля, используя те же расчеты для регулировки TDF или LFR.
      
      AY: фактическая доходность (%)
      C_{Фактическая}: фактическая концентрация компонентов аэрозоля (мкг/л)
      TDF: общий расход разрежающего воздуха (л/мин)
      C_Запас: концентрация запасов (%, мас./ мас.)
      LFR: расход жидкости (г/мин)
   2. Использование раствора, содержащего 2% (мас./мас.) никотина, с измеренной концентрацией никотинового аэрозоля 15 мкг/л, TDF 320 л/мин и LFR 0,35 г/мин приведет к следующему никотиновому AY:
      
      

3. Образование аэрозолей CAG

1. Начало генерации аэрозолей
   1. Взвесьте и запишите значение исследуемой жидкости, магнитной мешалки и бутылки до ближайших 0,01 г. Жидкие составы готовятся с компонентами, описанными в таблице 1.
   2. Подайте соответствующие настройки воздушного потока (±5%) (рисунок 5):
      Сжатый воздух для нагреваемого потока: 2 л/мин
      Расход охлаждения: 10 л/мин
      Первый расход разрежения: 150 л/мин
      Второй расход разрежения: 160 л/мин
      Расход отходов: 172 л/мин
   3. Установите заданное значение контроля температуры на цифровом регуляторе температуры на 250 °C и начните нагрев ЦАГ.
   4. Поместите жидкий раствор с магнитным перемешивателем на магнитную мешалку. Поместите впускную трубку из перистальтического насоса в исследуемый раствор.
   5. Включите перистальтический насос и установите расход на LFR ±5% (г/мин).
   6. Когда температура CAG достигнет 250 ± 1 °C, начните генерацию аэрозоля, запустив перистальтический насос для подачи испытательной жидкости в CAG.
   7. Проверьте, образуется ли аэрозоль вблизи кончика капилляра, и запишите время, необходимое для расчета массового расхода. Если аэрозоль не генерируется, проверьте все оборудование и настройки еще раз. Если аэрозоль все еще не образуется, весьма вероятно, что капилляр заблокирован и нуждается в замене.
2. При образовании аэрозолей
   1. Сливайте жидкость, которая конденсируется в стеклянной установке каждые 60 минут, чтобы обеспечить постоянное и стабильное образование аэрозолей.
3. Прекращение образования аэрозолей
   1. Извлеките трубку из бутылки с испытательным раствором и переключите испытуемую жидкость в деионизированную воду и запишите время расчета массового расхода.
   2. Подождите, пока водяной пар выйдет из капилляра, выключите регулятор температуры и держите перистальтический насос включенным не менее 10 минут, чтобы промыть и очистить капилляр.
   3. Взвесьте и запишите значение испытуемой жидкости и бутылки до ближайших 0,01 г и рассчитайте массовый расход, используя следующее уравнение:
      
   4. Выключите сжатый воздух, используемый в качестве нагретого потока.
   5. При необходимости снимите CAG из монтажной установки и очистите стеклянную трубку сухими салфетками и снова соберите CAG.

4. Аналитическое определение составляющих

ПРИМЕЧАНИЕ: Отбор проб аэрозолей осуществляется в двух положениях: а) на неразбавленном аэрозоле (как первый разрежающий воздух, так и второй расход разрежения отключаются во время неразбавленного отбора проб) и b) на разреженном аэрозоле со всеми предусмотренными разрежениями (рис. 5). В каждом из мест отбора проб, a и b, имеется до трех отверстий для отбора проб, что позволяет одновременно собирать ACM и другое оборудование/зонды для анализа характеристик аэрозолей. Линия отбора проб устанавливается перпендикулярно направлению аэрозольного потока и подключается к вакуумному насосу, что позволяет вытягивать определенный объем аэрозоля (в зависимости от скорости потока насоса и длительности пробы).

1. Определение собранной массы аэрозоля (ACM)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза твердых частиц аэрозоля задерживается на стекловолоконной фильтрующей прокладке (диаметр: 44 мм, удержание размера частиц: 1,6 мкм). Вес ACM до и после отбора проб измеряется с помощью фильтродержателей для минимизации потерь при взвешивании из-за испарения летучих компонентов.
   1. Поместите фильтр в фильтродержатель и поместите крышки фильтров.
   2. Взвесьте держатель фильтра до ближайших 0,0001 г с фильтром перед сбором образца и задокументируйте вес.
   3. Подключите фильтродержатель, содержащий фильтр, к аэрозольному потоку и начните сбор проб.
   4. После сбора образца взвесьте фильтр с фильтродержателем и колпачками и задокументируйте конечный вес.
   5. Вычислите ACM, используя следующую формулу:
      
      ACM: концентрация ACM (мкг/л)
      Wb: вес фильтра и фильтродержателя перед отбором проб (g) до ближайшего 0,0001 г
      Wa: вес фильтра и фильтродержателя после отбора проб (g) до ближайшего 0,0001 г
      V_{аэрозоль}: Объем аэрозоля (L), проходящий через фильтр, рассчитанный с использованием:
      Время отбора проб (мин) x поток отбора проб (л/мин)
   6. Снимите фильтрующую прокладку с фильтродержателя и поместите ее в стеклянный флакон объемом 25 мл, содержащий 5 мл этанола. Извлеките ACM, встряхнув фильтрующую прокладку на лабораторном шейкере в течение 30 мин при 400 об/мин.
   7. Центрифугируйте стеклянный флакон объемом 25 мл в течение 5 мин при 290 х г и соберите супернатант для количественной оценки PG/VG и фазы твердых частиц никотина.
2. Определение концентрации никотина (или ароматизатора)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аэрозоль улавливается на колонке образца, содержащей специально обработанную широкопористую трепел, химически инертную матрицу для использования в диапазоне рН от 1 до 13 (рис. 6).
   1. Подготовьте колонку образца в течение 15 минут перед началом сбора аэрозольного образца.
      1. Для определения концентрации никотина добавляют 2 мл 0,5 М серной кислоты. Для определения вкуса добавьте 2 мл изопропанола.
   2. Проверьте поток отбора проб.
      1. Включите вакуумный насос и, используя калиброванное проточное оборудование, обеспечивающее точность до 1 куб. м/мин, проверьте расход с помощью колонки образца, подключенной к линии отбора проб. Отрегулируйте расход с помощью игольчатого клапана в диапазоне 700 куб.м/мин ± 5%.
      2. Выключите вакуумный насос.
   3. Сбор образцов
      1. Добавьте два адаптера в колонку образца в соответствии с ее входной и выходной сторонами (рисунок 6). Подключите трубку к вакуумной линии отбора проб через выходной адаптер.
      2. Подключите образец колонны в сборе к порту выборки через входной адаптер.
      3. Начните сбор проб, включив вакуумный насос.
      4. Запишите время начала выборки.
      5. После заданного времени отбора проб, 10 мин в неразбавленной точке отбора проб А и 30 мин в разреженной точке отбора проб В, выключите вакуумный насос и запишите время.
      6. Удалите столбец образца из порта выборки.
      7. Извлеките адаптеры из колонки для образцов и запечатайте колонну образца пленочной мембраной, чтобы предотвратить потери из-за испарения или загрязнения. Пометьте образец столбца в соответствии с соответствующим именем образца.
      8. Храните герметичную колонку для образцов в холодильнике (2-8 °C) до анализа.
   4. Определение карбонильных концентраций
      ПРИМЕЧАНИЕ: Карбонилы улавливаются на стеклянной фильтрующей прокладке, последовательно соединенной с микроимпингером, заполненным 2,4-динитрофенилгидразином (DNPH), растворенным в ацетонитриле.
3. Подготовка к отлову
   1. Заполните микроимпингер 10 мл 15 мМ DNPH в ацетонитриле.
      1. Подготовьте фильтровальную панель (см. пункт 4.1).
      2. Проверка потока отбора проб
   2. Включите вакуумный насос и проверьте скорость потока линии отбора проб с помощью калиброванного проточного оборудования, которое обеспечивает точность 1 кубометр / мин. Отрегулируйте расход с помощью игольчатого клапана в диапазоне 700 куб.м/мин ± 5%.
      1. Выключите вакуумный насос.
   3. Сбор проб
      1. Подключите держатель фильтра, соединенный с микроударом, к порту отбора проб.
      2. Подключите вакуумную линию отбора проб к выходному отверстию микроимпингера.
      3. Начните сбор проб, включив вакуумный насос.
      4. Запишите время начала выборки.
      5. После заданного времени отбора проб, 10 мин в неразбавленной точке отбора проб a и 30 мин в разреженной точке отбора проб b, выключите вакуумный насос и запишите время.
      6. Отсоедините ловушку отбора проб от порта отбора проб.
      7. Опустошите импинджер в стеклянный флакон. Долить раствор DNPH до 10 мл ацетонитрилом.
      8. Определите вес фильтрующей прокладки и извлеките ее в раствор DNPH-ацетонитрила путем встряхивания. Отбросьте фильтрующую прокладку после извлечения.
      9. Возьмите 1 мл аликвоты раствора карбонил-ДНПФ и добавьте 50 мкл пиридина для стабилизации раствора.
      10. Храните аликвоты в морозильной камере при ≤-12 °C до анализа.

Результаты

Воспроизводимость аэрозолей CAG
Чтобы продемонстрировать воспроизводимость аэрозоля, генерируемого CAG, базовый жидкий раствор, содержащий PG, VG, никотин, воду и этанол (71,72%, 17,93%, 2%, 5,85% и 2,5% соответственно) использовали в течение 10 отдельных запусков генерации аэрозолей. Параметры аэрозолизации и отбора проб приведены в таблице 2. Химическая характеристика аэрозолей, генерируемых CAG, подтвердила высокую степень воспроизводимости результатов, полученных с использованием системы. При одинаковых потоках нагрева, охлаждения и разрежающего воздуха, а также при одинаковых условиях отбора проб концентрации ACM, никотина, VG и PG были стабильными в течение аэрозольных циклов с относительным стандартным отклонением 2,48%, 3,28%, 3,43% и 3,34% ACM, Nicotine, VG и PG соответственно (рисунок 7).

Концентрации восьми карбонилов, а именно ацетальдегида, ацетона, акролеина, бутиральдегида, кротональдегида, формальдегида, метилэтилкетона и пропиольдегида, были измерены в течение трех последовательных запусков генерации CAG-аэрозолей. Как и ожидалось в случае с аэрозолями, образующимися в постоянных контролируемых условиях, выход всех карбонильных аналитов оставался низким (таблица 3), не достигая пределов количественной оценки (LOQ) аналитического метода для большинства соединений. Только ацетальдегид и формальдегид имели выход выше LOQ. Концентрации формальдегида в разбавленной аэрозольной пробе показали высокую изменчивость (±32%) из-за летучести этого анализируемого вещества, а также выходов, близких к LOQ. Данные подтвердили отсутствие жидких продуктов термической деградации в аэрозолях, генерируемых ЦАГ. Добавление смеси ароматизаторов оказывало влияние на карбонильный состав аэрозоля. В настоящем случае выходы ацетальдегида и бутиральдегида были резко увеличены со значений, близких к LOQ, до 2,06 и 1,56 мкг/л, соответственно, в разбавленном аэрозоле, предназначенном для попадания в экспозиционную камеру. Эти данные подчеркивают влияние состава ароматической смеси на аэрозольный состав и подчеркивают необходимость изучения потенциальной токсичности определенных вкусовых веществ в составе электронной жидкости на ранней стадии до окончательной оценки в исследованиях долгосрочного воздействия in vivo .

PSD аэрозолей, генерируемых CAG
PSD аэрозолей, генерируемых CAG, измеряли при различных потоках охлаждения и первого разбавления для оценки влияния этих условий на физические характеристики аэрозоля, образующегося из базового жидкого раствора, содержащего только PG, VG, воду и никотин. Эта процедура имеет важное значение для определения надлежащих условий для получения аэрозолей с размерами частиц в вдыхаемом диапазоне.

В настоящем исследовании потоки охлаждения и первого разрежения модифицировали с шагом 10 л/мин для поддержания того же общего объема аэрозольного потока (таблица 4). Поток жидкости (0,5 мл/мин), нагретый поток (2 л/мин) и второй расход разрежения (150 л/мин) оставались постоянными. Образцы аэрозолей были взяты из разбавленной точки отбора проб b (рисунок 5). PSD определяли с помощью аэродинамического дозатора частиц, который измерял размеры частиц от 0,5 до 20 мкм при расходе пробы 5 л/мин и разбавлял соответствующим образом для использования с оборудованием. MMAD и GSD были сообщены аэродинамическим дозатором частиц для каждого запуска генерации аэрозолей.

Увеличение потока охлаждения и одновременное уменьшение первого потока разрежения оказали влияние на размер частиц аэрозоля (таблица 4). Наибольшее влияние на размер частиц наблюдалось при изменении потока охлаждения от 10 до 20 л/мин и первого потока разрежения от 160 до 150 л/мин. MMAD более чем удвоился в этих условиях с 1,47 до 4,03 мкм. Средний размер частиц аэрозоля продолжал расти с увеличением скорости потока охлаждения, хотя и в более низких соотношениях, чем те, которые наблюдаются между 10 и 20 л/мин. Распределение аэродинамического диаметра аэрозольных частиц было явно смещено в сторону больших диаметров при сравнении аэрозолей, образующихся при потоке охлаждения 10 л/мин, с аэрозолями, образующимися при 20-50 л/мин (рисунок 8).

Эффективность улавливания ароматизаторов электронных жидкостей
Как обсуждалось ранее, из-за своей летучести различные жидкие составляющие постоянно подвержены газожидкостному массопереносу в зависимости от локальных термодинамических условий. Кроме того, аналитические методы обладают определенной способностью улавливать такие составляющие. Фактические измерения выхода позволяют измерить способность химических методов к точному обнаружению и количественной оценке выбранных компонентов (например, из-за их потенциала конденсации или реакций некоторые компоненты могут не достигать места назначения, т.е. экспозиционной камеры в случае ингаляционных исследований). Таким образом, при оценке различных ароматизированных составов электронных жидкостей важно иметь возможность определить наиболее эффективный метод улавливания для химической оценки аэрозоля. Впоследствии это позволяет измерить скорость переноса для каждого компонента, которая продиктована часто присутствующими потерями из-за переноса аэрозоля из места генерации в экспозиционную камеру. В настоящем случае дополнительное исследование проводили с жидкостью, содержащей смесь вкусовых веществ. Аэрозоль генерировали с параметрами CAG, перечисленными в таблице 2 , и улавливали после разбавления (положение b, рисунок 5), при этом скорость потока отбора проб устанавливалась на уровне 0,7 л/мин в течение 30 мин. Улавливание производили на колонках отбора проб, предварительно кондиционированных 2 мл изопропанола. Картриджи были элюированы изопропанолом вскоре после завершения периода улавливания, пока не было извлечено 20 мл раствора. Мы обнаружили, что эффективность улавливания, как правило, должна быть исследована и определена для каждого компонента вкуса.

Для 70% исследованных вкусовых компонентов у нас были показатели восстановления >60%, что хорошо коррелировало с температурами кипения (летучестью) ароматизаторов. Этот факт подразумевает, что ингаляционные токсикологические исследования, содержащие сложные смеси, должны проводиться с особым вниманием к переносу и доставке аэрозоля к месту воздействия.

Рисунок 1: Принцип работы капиллярного генератора аэрозолей (ЦАГ). Жидкость закачивается в электрически нагретый капилляр, доставляющий всплески горячих пересыщенных паров, которые охлаждаются воздушным потоком, вызывая внезапное зарождение и конденсацию, что приводит к образованию аэрозолей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Типичная экспериментальная установка CAG и ключевые элементы. (A) Общий вид сборки CAG, показывающий перистальтический насос, связывающий жидкий раствор с CAG, каналом разрежающего воздуха и процессом образования аэрозолей. (B) Детальный обзор CAG с капиллярными и нагревательными элементами. С) Поперечное сечение установки для генерации аэрозолей в сборе ЦАГ. Детали потоков охлаждающего и разрежающего воздуха. Стеклянная трубка имеет два отдельных отсека. Охлаждающий поток подталкивается к CAG и вступает в контакт с жидким паром для получения аэрозоля. Поток разрежения подталкивается к образующемуся аэрозолю для разбавления последнего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Сведения об устройстве CAG: вид в поперечном сечении. Нагревательный поток вводится вокруг нагревательных элементов для охлаждения внешнего ЦАГ-корпуса, предотвращения конденсации обратного потока жидкости на кончике капилляра, а также для стабилизации разрыва струи пара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Сборка CAG. Капилляр и нагревательный элемент (A) вставляются во внутреннюю трубку PEEK, и этот узел скользит во внешнюю трубу из нержавеющей стали (B). Узел укупоривается и плотно фиксируется на опоре с помощью свинцовых винтов из нержавеющей стали (C,D). Капилляр, выступающий из заднего конца, связан через трубку с перистальтическим насосом и жидким составом. Сокращения: SS, нержавеющая сталь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Настройки генерации аэрозолей CAG для экспериментов по воздействию in vivo . Отбор проб аэрозолей для анализа осуществляется в двух положениях: а) неразбавленный аэрозоль - первая стадия разрежения отключается во время отбора проб; b) разбавленный аэрозоль непосредственно перед входом в экспозиционную камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Образец столбца с прикрепленными адаптерами. Перед отбором проб колонка образца предварительно кондиционируется 0,5 М серной кислоты для анализа никотина или изопропанола для анализа вкуса. Входной адаптер подключен к САГ-генерируемому аэрозольным потоком и выходной адаптер к вакуумному насосу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Характеристика и воспроизводимость аэрозолей, генерируемых ЦАГ. Концентрация концентраций ACM, никотина, PG и VG в течение 10 отдельных экспериментальных аэрозольных генераций проходит с одним и тем же жидким базовым раствором. ACM, 1105,45 ± 27,4 мкг/л; Никотин, 20,16 ± 0,7 мкг/л; VG, 227,15 ± 7,8 мкг/л; PG, 656,59 ± 22,0 мкг/л. Полосы ошибок представляют стандартное отклонение. Сокращения: ACM, аэрозоль собранной массы; ПГ, пропиленгликоль; ВГ, глицерин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Изменения в распределении аэрозоля по размерам частиц, образующихся при различных скоростях потока охлаждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

	БАЗА (PG/VG/N)	ВКУС (PG/VG/N/F)
Компонент	PG/VG/N (г/1000г)	PG/VG/N/F (г/1000г)
Бензойная кислота	3.33	3.33
ПГ	240.00	238.91
Вода	150.00	150.00
Молочная кислота	3.33	3.33
Уксусная кислота	3.33	3.33
Смесь вкусов	0.00	1.20
Глицерин	560.01	559.90
Никотин	40.00	40.00
Сумма	1000.00	1000.00

Таблица 1: Компоненты состава запасов Е-жидкости¹⁸

Протокол аэрозолизации			Протокол отбора проб
Параметры	Неразбавленный	Разбавленный	Параметры	Неразбавленное местоположение A	Разбавленное место B
Температура CAG (°C)	250
Расход насоса (мл/мин)	0.5	0.5	Время отбора проб (мин)	10	30
Расход нагретого воздуха (л/мин)	2	2	Поток отбора проб (ACM) (л/мин)	0.7	1.5
Расход охлаждающего воздуха (л/мин)	10	10	Расход отбора проб Extrelut (л/мин)	0.7	0.7
1-е разрежение воздуха (л/мин)	Н.А.	150	Поток отбора проб карбонилов (л/мин)	0.7	0.7
2-е разрежение воздуха (л/мин)	Н.А.	160
Отходы (л/мин)	Н.А.	172

Таблица 2: Параметры образования, разрежения и отбора проб аэрозолей

Карбонилы	Базовая жидкость (PG/VG/Никотин)		Ароматизационный раствор высокой концентрации с никотином (PG/VG/Никотин/Ароматизаторы)
	Неразбавленный образец аэрозоля мкг/л	Разреженный образец аэрозоля мкг/л	Неразбавленный образец аэрозоля мкг/л	Разреженный образец аэрозоля мкг/л
Ацетальдегид	0.834 ± 0.096	0.119*	45.346 ± 1.134	2.058 ± 0.202
Ацетон	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
Акролеин	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
Бутиральдегид	< LOQ	< LOQ	36.475 ± 0.996	1.557 ± 0.179
Кротональдегид	< LOQ	< LOQ	0.052 ± 0.001	< LOQ
Формальдегид	0.731 ± 0.072	0.072 ± 0.023	0,158 ± 0,007	0,026 ± 0,004
Метилэтилкетон	< LOQ	< LOQ	0.570 ± 0.015	< LOQ
Пропионладегид	< LOQ	< LOQ	0,085 ± 0,001	< LOQ

Таблица 3: Определение карбонилов в аэрозоле, генерируемом ЦАГ. Средние значения от трех генерации аэрозолей проходят с одним и тем же раствором на жидкой основе и с ароматической смесью. Только одна выборка за три прогона имела значения, превышающие нижний предел количественной оценки (LOQ) метода.

Настройки (Л/мин)		Диаметр капель аэрозоля
Охлаждающий поток	1-й расход разрежения	ММАД (мкм)	ГСД
10	160	1.47 ± 0.04	2.07 ± 0.01
20	150	4.03 ± 0.18	2.13 ± 0.04
30	140	4.74 ± 0.04	1.89 ± 0.02
40	130	5.35 ± 0.04	1.80 ± 0.01
50	120	5.23 ± 0.03	1.76 ± 0.01

Таблица 4: Определение размера частиц аэрозоля (диаметр капель) при различных условиях воздушного потока. Сокращения: MMAD, массовый средний аэродинамический диаметр; GSD, геометрическое стандартное отклонение.

Обсуждение

Образование аэрозолей с помощью CAG помогает уменьшить изменчивость процессов аэрозоляции для конкретных устройств EC, что позволяет объективно и контролируемо оценивать саму аэрозольную электронную жидкость. Было показано, что аэрозоли, генерируемые CAG, являются репрезентативными для аэрозолей, образующихся в ЕС⁷. Они могут быть воспроизводимо получены с одинаковым составом и характеристиками и, следовательно, особенно пригодны для исследований долгосрочного воздействия in vivo , требующих больших объемов аэрозоля в течение длительного периода времени⁸.

Установка CAG относительно проста в сборке и обслуживании. Однако рабочие параметры, такие как расход жидкости и соответствующие скорости потока воздуха, остаются критическими для производства контролируемого аэрозоля, что требует оптимизации метода в соответствии с целью применения аэрозоля, генерируемого CAG.

Результаты, представленные в текущем исследовании, показывают, что скорость потока охлаждающего воздуха оказывает явное влияние на распределение частиц аэрозоля по размерам. Поток охлаждающего воздуха оказывает непосредственное влияние не только на зарождение образующихся паров, но и на конденсацию, из-за охлаждения внутренней трубки, в которой протекает образующийся аэрозоль. Кроме того, плотный аэрозоль подвержен существенным коагуляционным эффектам. В совокупности эти процессы сложны, и их взаимодействие и влияние на образование аэрозолей довольно трудно обобщить для конкретных электронных жидкостей, температур и потоков. Состав дополнительного воздушного потока (сухой или увлажненный с фиксированным процентом относительной влажности), в частности, содержание воды, будет влиять на тепло- и массообмен, приводя не только к модулированному росту конденсации аэрозольных частиц, но и к конденсации стенок. Таким образом, модификации параметров этого метода считаются предназначенными для использования с точки зрения контроля PSD^17,19.

Присутствие химических веществ с низкой растворимостью или высокими температурами кипения может ограничить эффективность аэрозоля, генерируемого CAG, из-за осаждения в капилляре и засорения капилляра с течением времени. В зависимости от химических веществ, присутствующих в аэрозоле, температура для работы CAG должна быть отрегулирована для образования пара. Кроме того, следует регулярно оценивать стабильность жидкого состава. Добавление компонентов, включая ароматизаторы, с различными температурами кипения будет оказывать влияние на конечную аэрозольную композицию¹⁴ и газожидкостное разделение. Возможно, потребуется адаптировать температуру капилляра и поток нагрева воздуха для предотвращения обратного потока и осаждения жидкости вблизи горячего капилляра, что может привести к образованию неконтролируемых продуктов термической деградации (таких как карбонилы) из-за длительной продолжительности удержания жидкости при высокой температуре. Кроме того, контроль температуры, используемой для генерации пара в капилляре, влияет на то, где пар начинает образовываться в капилляре - чем выше температура, тем раньше образуется пар. При более высокой капиллярной температуре пару, выходящему из капилляра, потребуется больше времени для охлаждения потоком охлаждающего воздуха и, следовательно, он начнет нуклеаться и конденсироваться в аэрозоль дальше от кончика капилляра, помогая избежать эффекта обратного потока¹⁹.

Текущие токсикологические исследования электронных жидкостей in vivo ограничены в воспроизведении аэрозолей электронных сигарет из-за логистической сложности для удовлетворения требуемого масштаба аэрозоля, как, например, в исследовании ОЭСР TG 413²⁰. Протокол, представленный в этом исследовании, дает обзор сборки и настроек CAG, используемых в Philip Morris International для получения аэрозолей in vivo в исследованиях долгосрочного воздействия¹⁸. Эти данные могут служить хорошей отправной точкой для дальнейшей тонкой настройки в другой лабораторной среде (например, системы доставки лекарственного средства²¹) или для адаптации к конкретным требованиям конкретного исследования.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminium front cap	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland	Custom Built	Purpose built, 1 x
Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm	Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA	B-505432	2 x
Aluminium rear cap	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland	Custom Built	1 x
Cambridge glass filter pads	GE Healthcare UK Limited	9703-9654	44 mm diameter
Capillary 21 G SS, 160 mm	Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA	304H21RW	1 x
Dry wipes	Contec Inc. , SC, USA	Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol	cleaning material
Flowmeter	TSI, Shoreview, MI, USA	4100 Series, 0-20 L/min	or equivalent
Gilibrator-2 calibrator	Sensidyne, St-Petersburg FL, USA	Gilian Gilibrator-2	Air flow calibrator
Glass Couplings	Labo Service, Kontich, Belgium	QVF
Glass piping	Labo Service, Kontich, Belgium	QVF	Pipe 25 and 40 mm
Heating elements	Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA	LDC01864	4 x
High heat grease	Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA	High temperature multipurpose grease	CAG maintenance
Inner PEEK tube	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland	Custom Built	1 x
Magnetic stirrer	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany	C-MAG HS 4	or equivalent
Micro impingers	Labo Service, Kontich, Belgium	Custom Built
Outer SS tube	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland	Custom Built	1 x
PEEK adaptor	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland	Custom Built	Purpose built, 1 x
Peristaltic pump	Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK	Watson-Marlow 530 U	or equivalent
Push-in fitting	Festo Pte Ltd	NPQM-DK-M5-Q4-P10	1 x
Sample Column Extrelut NT3 cartridge	Merk Sigma-Aldrich	115095
SS 25 mm assembly cap	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland	Custom Built	Purpose built, 1 x
SS M8 lead screw	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland	Custom Built	3 x
SS M8 nut	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland	Custom Built	3 x
SS rear backing	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland	Custom Built	Purpose built, 1 x
Temperature controller	Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany	Digi-Sense TC 9600	or equivalent
Thermocouple type K	RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland	814-0147	1 x