JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем протокол для трехмерной модели совместной культуры инфицированных дыхательных путей, с использованием CFBE41o- клеток, макрофагов THP-1 и Pseudomonas aeruginosa, установленной на воздушно-жидком интерфейсе. Эта модель предоставляет новую платформу для одновременного тестирования эффективности антибиотиков, функции эпителиального барьера и воспалительных маркеров.

Аннотация

FDrug исследования для лечения легочных инфекций прогрессирует в направлении прогностических в пробирке модели высокой сложности. Многогранное присутствие бактерий в моделях легких может пере адаптировать эпителиальное расположение, в то время как иммунные клетки координируют воспалительный ответ против бактерий в микросреде. В то время как in vivo модели были выбор для тестирования новых анти-инфекционных в контексте муковисцидоза, они до сих пор не точно имитировать in vivo условия таких заболеваний у людей и результаты лечения. Сложные в пробирке модели инфицированных дыхательных путей на основе клеток человека (бронхиальные эпителиальные и макрофаги) и соответствующие патогенные микроорганизмы могли бы преодолеть этот разрыв и облегчить перевод новых противоинфекционных средств в клинику. Для этих целей была создана модель совместной культуры человеческого муковисцидоза бронхиальной эпителиальной клеточной линии CFBE41o- и макрофагов THP-1, полученных из моноцитов, имитирующих инфекцию человеческой бронхиальной слизистой P. aeruginosa в условиях воздушно-жидкого интерфейса (АЛИ). Эта модель настроена в течение семи дней, и одновременно оцениваются следующие параметры: целостность эпителиального барьера, трансмиграция макрофага, выживание бактерий и воспаление. Настоящий протокол описывает надежную и воспроизводимую систему оценки эффективности лекарств и реакции хозяев, которая может иметь отношение к обнаружению новых противоинфекционных препаратов и оптимизации их доставки аэрозолей в легкие.

Введение

Pseudomonas aeruginosa является соответствующим патогеном в муковисцидоз (CF), который способствует нарушению легочной ткани1. Производство полисахаридов, таких как альгинат и другие слизистые экзополисахариды, координирует прогресс заболевания, что приводит к цепкой бактериальной приверженности, ограничивает доставку антибиотиков бактериям и защищает бактерии от иммунной системы хозяина2. Переход P. aeruginosa от планктонной стадии к образованию биопленки является критическим вопросом в этом контексте, также способствуя возникновению толерантности к антибиотикам.

В контексте CF мышь в основном используется в качестве модели. Мыши, однако, не спонтанно развивать это заболевание с введением мутаций CF3. Большинство исследований бактериальной биопленки и восприимчивости к лекарственным препаратам проводились на абиотических поверхностях, таких как петри. Однако этот подход не представляет сложности in vivo. Например, отсутствуют важные биологические барьеры, включая иммунные клетки, а также мукозальный эпителий. Хотя P. aeruginosa довольно токсичен для эпителиальных клеток, некоторым группам удалось совместно культивировать более раннюю биопленку P. aeruginosa с человеческими бронхиальными клетками. Эти клетки возникли из муковисцидоза пациентов с мутацией CFTR (CFBE41o- клетки)4 и позволило оценить эффективность антибиотиков5 или оценить коррекцию белка CFTR во время инфекции6. Такая модель была показана для улучшения предсказуемости эффективности препарата, в дополнение к характеристике проблем с препаратами, которые не в более поздних стадиях разработки препарата7.

Однако в легких слизистый эпителий подвергается воздействию воздуха. Кроме того, иммунные клетки, присутствующие в дыхательных путях, как и макрофаги тканей, играют важную роль против вдыханных патогенов или частиц8. Макрофаги мигрируют через различные слои клеток, чтобы достичь бронхового просвета и бороться с инфекцией. Кроме того, вдыхаемые препараты также должны справиться с наличием слизи в качестве дополнительного неклеточного элемента легочного воздушно-кровавого барьера9. Действительно, было разработано несколько сложных трехмерных (3D) моделей in vitro, направленных на повышение релевантности in vivo. Системы совместного культуры не только повышают сложность систем in vitro для обнаружения лекарств, но и позволяют изучать взаимодействие клеток и клеток. Такая сложность была решена в исследованиях о миграции макрофагов10,высвобождении антимикробных пептидов нейтрофилами11,роли слизи в инфекции9,и эпителиальной клеточной реакции на чрезмерное повреждение12. Тем не менее, надежная CF-инфицированная модель in vitro, которая имеет генетическую мутацию в CF, которая подвергается воздействию воздуха (увеличенное физиологическое состояние), и интегрирует иммунные клетки, все еще отсутствует.

Чтобы преодолеть этот разрыв, мы описываем протокол стабильной 3D-культуры инфицированных дыхательных путей. Модель состоит из бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов человека, инфицированных P. aeruginosa и способных представлять как диффузный, так и иммунологический барьер. С целью тестирования противоинфекционных при достаточно высокой пропускной способности, эта со-культура была установлена на проницаемой мембране фильтра хорошо пластины вставки, используя две линии клеток человека: CFBE41o- и THP-1 моноцитов производных макрофагов. Кроме того, чтобы в конечном итоге изучить осаждение аэрозолизированных противоинфекционных13, модель была создана на воздухе жидкости интерфейс (ALI), а не жидкости покрытые условия (LCC).

Как мы сообщаем здесь, эта модель позволяет оценить не только выживаемость бактерий при лечении антибиотиками, но и цитотоксичность клеток, целостность эпителиального барьера, трансмиграцию макрофагов и воспалительные реакции, которые являются существенными параметрами для разработки лекарств.

Этот протокол сочетает в себе два соответствующих типа клеток для ингаляционной терапии легочных дыхательных путей: макрофаги и CF бронхиальный эпителий. Эти клетки посеяны на противоположных сторонах проницаемых опорных вставок, что позволяет клеточному воздействию воздуха (так называемые условия воздушно-жидкого интерфейса (ALI). Эта со-культура клеток-хозяев впоследствии заражена P. aeruginosa. Обе линии клеток-хозяев имеют человеческое происхождение: эпителиальные клетки представляют муковисцидоз бронхиального эпителия, с мутацией на канале CF (CFBE41o-), и THP-114 клетки хорошо характеризуется макрофагом, как клеточная линия. Слияние эпителиального слоя сначала допускается для формирования на верхней стороне хорошо пластины вставки до макрофагов, как клетки добавляются в противоположном отсеке. После того, как совместно культуры устанавливается в АЛИ, система прививается с P. aeruginosa на апсиа. Эта зараженная система совместной культуры затем используется для оценки эффективности антибиотика, например, тобрамицина. Анализируются следующие конечные точки: эпителиальная целостность барьера с точки зрения трансэпителиальной электрической резистентности (TEER), визуализация клеточно-клеточных и клеточно-бактериальных взаимодействий confocal лазерной сканирующей микроскопией (CLSM), бактериальное выживание путем подсчета колониообразующих единиц (CFU), выживаемость клеток-хозяев (цитотоксичность) и высвобождение цитокинов.

протокол

1. Рост и дифференциация клеток в проницаемых опорных вставках

  1. Культивировать CFBE41o- в колбе T75 с 13 м Л минимальной необходимой среды (MEM), содержащей 10% фетальной сыворотки икры (FCS), 1% несущественных аминокислот и 600 мг/л глюкозы при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 атмосферы. Добавляйте свежую среду в клетки каждые 2-3 дня.
    1. Отсоедините клетки после достижения 70% слияния в колбе с 3 мл трипсина- этилендиаминистетраацетической кислоты (ЭДТА) при 37 градусов по Цельсию в течение 15 мин. Добавьте 7 мл свежего MEM и центрифугу в клетки при температуре 300 х г в течение 4 минут при комнатной температуре (RT). Отбросьте супернатант и добавьте новые 10 мл MEM, нарушая при этом комки, мягко трубя вверх и вниз.
    2. Подсчитайте клетки с помощью автоматизированного счетчика ячейки или гемоцитометра. Семенные клетки с плотностью 2 х 105 клеток/хорошо в 12-хорошо пластин с проницаемыми опорами (размер поры 3 мкм, см. Таблицу Материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный счетчик ячейки определяет номер ячейки, распределение размера и жизнеспособность ячеек (см. Таблицу Материалов). Здесь можно использовать проницаемые опоры с размером поры 0,4 мкм; однако, макрофаги, в этом состоянии, должны быть добавлены непосредственно к аполической стороне, и их трансклеточной миграции не будет оцениваться в этом случае.
    3. Семенные клетки в жидком жидком состоянии (LLC) путем добавления 500 мл клеточной суспензии на апикаловой стороне проницаемой опоры и 1,5 мл свежей среды в басотераальной стороне. Затем инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию под 5% CO2, для 72 ч.
    4. Чтобы перейти к воздушно-жидкой интерфейс (ALI) культуры, на третий день после посева, удалить среду из басотеральная сторона, а затем с аической стороны. К басолатеральной стороне добавьте 500 МЛ свежего MEM и меняйте среду каждый второй день, пока клетки не образуют слияние монослой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для условий, используемых в этом протоколе, CFBE41o- клетки обычно смешиваются после 3-7 дней в культуре.
    5. Оцените свойства эпителиального барьера на 7-й день путем инкубации CFBE41o- клеток с 500 хЛ клеточной средой в аписальной стороне и 1,5 мл в басотераальной стороне на 1 ч, при 37 градусов по Цельсию под 5% CO2.
    6. Измерьте свойства барьера с помощью трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), с электродом stX2 палочки и эпителиальным вольт-охметром; после 7 дней это выше, чем 300 Ω'cm2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конце концов, в некоторых мембранных вставок, клетки имеют низкий TEER. Поэтому проницаемые вставки с TEER lt; 300 Ω-cm2 не используются.
  2. Чтобы культивировать клетки THP-1, выращивать их в колбе T75 с помощью 13 мл Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 средних дополнены 10% FCS, и инкубировать на 37 градусов по Цельсию под 5% CO2. Разделение клеток каждый второй день, посев 2 х 106 клеток / мЛ клетки в новой колбе T75.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Недифференцированные клетки THP-1 выращиваются как моноциты в суспензии.
    1. Дифференцировать клетки THP-1 следующим образом. Содержимое центрифуги T75 при 300 х г в течение 4 мин. Откажитесь от супернатанта, перезахоите гранулы в свежей среде и положите в новый T75. Добавьте 10 нг/мЛ Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) инкупати клетки в RPMI для 48 ч при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 атмосфера15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После дифференциации с PMA, клетки не размножаются больше и прикрепляются к колбе.
    2. Чтобы отсоединить THP-1 макрофагоподобные клетки, мыть один раз с фосфат-буферным солевым раствором (PBS) при температуре 37 градусов по Цельсию и инкубировать 3 мЛ раствора отслоения клеток (например, accutase), содержащего 0,5 мМ EDTA на 10 мин при комнатной температуре.
    3. Осмотрите клетки под перевернутым микроскопом, чтобы найти клеточный отсо отряда. Добавьте 7 мл свежей средней и центрифуги при 300 х г в течение 4 минут в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Макрофаги также могут быть отделены с трипсин-ЭДТА, 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Тем не менее, трипсин жестче к макрофагам, чем выбранное решение отсоединение клеток (см. Таблицу Материалов).
    4. После удаления супернатанта, повторно приостановить макрофаг клеток в 3 мЛ THP-1 среды в 15 мЛ конической трубки, подсчитать клетки, как описано в 1.1.2. и инкубировать на максимум 1 ч при 37 градусов по Цельсию под 5% CO2 до создания совместной культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: THP-1 клетки в подвеске могут быть окрашены с жизнеспособностью красителей для изображения со-культуры дальше. На этом этапе используйте процедуру ниже (шаг 1.2.5).
    5. Пятно макрофагов с 10 мл красителя жизнеспособности клетки (на основе преобразования ацетат moieties внутриклеточной эстерас, см. Таблица Материалов), в котором 3 МЛ жизнеспособность клетки красителя применяется к суспензии клетки. Инкубировать клетки в течение 20 мин при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2, затем мыть 1x с PBS 37'C, чтобы удалить краситель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифуга клетки для удаления красителя на 300 х г в течение 4 минут при комнатной температуре (RT).

2. Создание эпителиальной макрофаговой со-культуры на проницаемых опорах

  1. Используйте CFBE41o- монослой в ALI с TEER 300 Ω см2 (шаг 1.1.6.). Снимите среду с нижней камеры, тщательно инвертировать опору внутри стерильного стекла Петри блюдо (50 мм х 200 мм), и удалить клетки, заросшие через мембранные поры на нижней стороне мембраны с помощью скребка клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за поры размер 3 мкм, эпителиальные клетки, как правило, растут через поры к басотераальной стороне. Поэтому, нужно удалить их, прежде чем добавлять макрофаги на этой стороне. CFBE41o- эпителиальные клетки легких могут быть окрашены на этом этапе. Процедура в шаге 1.2.5 может быть использована; однако вместо клеточной подвески на проницаемой опоре применяется раствор красителя в MEM (только 500 МЛ) на прилипаемых клетках.
  2. Используйте 2 х 105 ячеек/хорошо (в 200 мл RPMI) из клеточной суспензии макрофагов PMA-дифференцированного THP-1 и поместите клетки на басонатеральной стороне перевернутых вставок.
  3. Закройте чашки Петри тщательно и инкубировать на 2 ч при 37 градусов по Цельсию под 5% CO2.
  4. Поместите вставки обратно в 12-хорошо микропласты и добавить 500 МЛ MEM среды в basolateral стороны проницаемой вставки для поддержания условий ALI. Клетки теперь готовы к инфекции.

3. Инфекция P. aeruginosa

ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги отсюда должны быть сделаны в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL2).

  1. Прививка 15 мл бульона лизогении (LB) дополнена 300 мкг/мл ампициллина в колбе Эрленмейера (50 мл) с одной колонией P. aeruginosa PAO1-GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие штаммы P. aeruginosa также могут быть использованы здесь, например, PAO1 дикий тип, PA14, или клинических штаммов, следуя своим собственным протоколам культивирования.
  2. Инкубировать бактерии в течение 18 ч при 37 градусов по Цельсию, встряхивая при 180 об/мин.
  3. Перенесите содержимое после 18 ч в коническую трубку 50 мЛ и центрифугу при 3850 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и добавьте 10 мл стерильных PBS при 37 градусов по Цельсию.
  4. Измерьте оптическую плотность на спектрофотометре на длине волны 600 нм и отрегулируйте концентрацию бактерий с помощью клеточной культуры среды до конечной концентрации 2 х 105 CFU/mL. Это соответствует множественности инфекции (МВД) одной бактерии на эпителиальную клетку.
  5. Добавьте 100 мл бактериальной суспензии к аписальной стороне проницаемой поддержки (шаг 2.4.) и инкубировать при 37 градусах по Цельсию под 5% CO2 на 1 ч, чтобы бактерии привязанности к клеткам. Затем, удалить апической жидкости тщательно с пипеткой для восстановления условий ALI. Держите некоторые образцы неинфицированы в качестве контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе, бактерии прилагается должны быть покрыты в LB агар (см. шаги 5.4/5.5), чтобы определить первоначальные бактерии inoculum.
  6. Инкубировать препарат, представляющий интерес после бактериальной адгезии в клетках. Для лечебных экспериментов добавьте 500 мл лекарственного раствора, разбавленного в клеточной среде (в этом протоколе использовался тобрамицин 6 мкг/мл) в аическую сторону. Добавьте 1500 мл клеточной среды без препарата на басотераальной стороне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо того, чтобы прививать лекарства в качестве решения, модель также может быть адаптирована к осаждению аэрозолей. Для этих целей клетки в ALI питаются с базалатеральной стороны 500 мл клеточной среды. Препарат затем сначала распылиется и разрешен к отложению в аписном отсеке соответствующим устройством (не описано здесь). Зараженный и обработанный образец может быть проверен на конечные точки, изложенные в разделах 4-7. С этого шага, проницаемые опоры могут быть использованы для создания либо изображений (раздел 4) или получить результаты роста бактерий и жизнеспособности клеток млекопитающих, среди других (разделы 5-7).

4. Пример подготовки к конфокальной лазерной микроскопии (CLSM)

  1. После установления совместного культуры, инфекции и лечения наркомании, удалить все средства массовой информации с апкической и базалатеральной стороны. Вымойте 1x с PBS при 37 градусов по Цельсию, а затем исправить клетки с 3% параформальдегида (PFA) на 1 ч на RT (300 мл на аписальных / 600 мл на басотеральная). Ядра клеток окрашены 5 мкг/мл DAPI-PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: PFA является опасным.
  2. Вырезать мембраны с помощью скальпеля и поместить их между двумя 12 мм микроскопии крышки слайдов с помощью монтажа среды (см. Таблицу материалов). Дайте ему высохнуть внутри потока скамейке в течение 30 минут до хранения при 4 градусов по Цельсию. Визуализируйте с помощью конфокальной сканирующей микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После со-культуры и до монтажа, жесткие соединения иммуносхеи могут быть выполнены. Для этого клетки фиксируются параформальдегидом 3% в течение 30 мин, снова промывают с помощью PBS и пермяки с сапонином 0,05%/BSA 1% в PBS. В этом протоколе, zonula окклюденов белка (ЗО-1) был обнаружен с помощью мыши анти-человека ЗО-1 антитела (1:400, инкубация при 4 градусов по Цельсию в одночасье). Образцы были затем инкубированы на 2 ч на RT с козой анти-мым мыши IgG антитела Alexa Fluor 633 (1:2000 в красном). Ядра были окрашены DAPI (1 мкг/мл) и установлены с монтажной средой на крышках.
  3. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации сохраненных мембран. Выберите 25x или 63x цели погружения воды и лазеры на 405, 488, 505 или 633 нм для обнаружения. Изображения должны иметь разрешение 1024 x 1024 пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лазеры выбираются в соответствии с пятном используется.
  4. Приобретайте апкические и поперечные представления и используйте режим zeta-stack (10-15 стеков) для построения трехмерной модели с использованием программного обеспечения для визуализации.

5. Измерение распространения бактерий через колонии-формирующие единицы (CFU)

  1. Соберите апикалическую и базалатерскую среду (содержащую бактерии) для оценки CFU не прикрепленных бактерий. Соберите 500 мл с апкической и базалатеральной сторон и с бассете их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эту подвеску непосредственно для подсчета бактерий (шаг 5.4) или центрифуги на 21,250 х г в течение 10 минут для оценки лактата дегидрогеназы (LDH) от супернатанта (раздел 6) и / или повторно приостановлено в PBS для подсчета внеклеточных бактерий (шаг 5.4).
  2. Оцените выживаемость бактерий, прикрепленных и/или интернализированных в клетках, добавив 500 мл стерильной деионизированной холодной воды в каждом отсеке проницаемой опоры. Инкубировать клетки в течение 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть покрыты на LB агар (см. шаг 5.4) или замороженные (как и весь вставки пластины) при -20 градусов по Цельсию для покрытия позже.
  3. Для оценки CFU адептов / интернализированных бактерий, оттаивания образцов при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин (если заморожены). Используя пипетки советы для каждого колодца, царапать мембранную поверхность и пипетки вверх и вниз, чтобы удалить все придерживались содержания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, все эпителиальные клетки lysed и адептов / интернализированных бактерий доступны в качестве подвески, чтобы быть покрыты.
  4. С бактериальной подвеской от обеих фракций, выполните 1/10 серийное разбавление с использованием Tween-80 0.05% в PBS и пластины бактерий на пластинах LB агар.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется разбавить от 1 до 10. Бактерии должны быть подсчитаны в наибольшей разбавления, где одиночные колонии впервые определены.
  5. Инкубировать агар пластин при 30 градусов по Цельсию на 16-72 ч для подсчета колоний, и рассчитать CFU соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура 30 градусов в момент инкубации пластины имеет важное значение для обработанных образцов и наблюдать отсроченный рост колоний.

6. Оценка цитотоксичности клеток с помощью анализа лактата дегидрогеназы

  1. Используйте супернатант инфицированных клеток, содержащих бактерии (от шага 5.1) для оценки жизнеспособности клеток для анализа LDH16. Центрифуга супернатанта на 21,250 х г в течение 10 минут, чтобы гранулировать бактерии и в конечном итоге остальные клетки. Используйте супернатант без бактерий для измерения выброса LDH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант не должен быть заморожен до измерения LDH по этому анализу.
  2. Перенесите 100 мл супернатанта на 96-хорошую пластину и добавьте 100 мл решения анализа LDH (см. таблицу материалов). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут в темноте, затем читать абсорбции при 492 нм.

7. Оценка высвобождения цитокинов человека

  1. Для количественной оценки цитокинов используйте либо ELISA, либо цитометрический бусиновой массив иммуноанализ17 (см. Таблицу материалов). Для этого центрифуг супернатант от шага 5.1 на 21,250 х г в течение 10 мин и измерять либо немедленно, либо хранить -80 градусов по Цельсию до 15 дней до анализа.
  2. Оцените супернац с помощью коммерчески доступного комплекта ELISA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура следует инструкциям по производству, которые включают покрытие пластин с антителом захвата, добавление образцов (100 мл) и стандартов цитокинов, инкубации, стирки и добавления антитела обнаружения для обеспечения колоритического измерения присутствия цитокинов. Кроме того, цитометрия потока может быть использована для измерения цитокинов с помощью коммерчески доступных комплектов (см. Таблицу материалов).

Результаты

На рисунке 1A показана морфология результирующей сокультуры бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов человека после роста на 24 ч на апкической и басотераальной стороне проницаемых опор, соответственно. Целостность эпителиального барьера показана более высоким ...

Обсуждение

В настоящем документе описывается протокол для 3D-культуры инфицированных дыхательных путей, образованной человеческой муковисцидоз бронхиальной эпителиальной клеточной линии CFBE41o- и человека моноцитов производных макрофаг клеточной линии THP-1. Протокол позволяет оценить целостност?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа получила финансирование из Программы Европейского союза «ГОРИЗОНТ 2020» по исследованиям, технологическим разработкам и демонстрации в соответствии с грантовым соглашением No 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - проектированием и разработкой передовых наномедицин для преодоления биологических барьеров и лечения тяжелых заболеваний. Мы благодарим д-ра Ана Коста и д-ра Дженни Juntke за большую поддержку в развитии совместно-культуры, Ольга Хартвиг, для научной иллюстрации, Аня Хонеккер, для анализа ELISA, Петра Кёниг, Яна Westhues и д-р Кьяра Де Росси за поддержку в области клеточной культуры, аналитики и микроскопии. Мы также благодарим Челси Торн за то, что она корректив нашу рукопись.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseAccutaseAT104
AmpicillinCarl Roth, GermanyHP62.1
CASY TT Cell Counter and AnalyzerOLS Omni Life Sciences-
CellTrace Far RedThermo FischerC34564
Centrifuge Universal 320RHettich, Germany1406
CFBE41o- cells1. Gruenert Cell Line Distribution Program
2. Sigma-Aldrich		1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert
2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mmWorld Precision Instruments, Sarasota, USASTX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSMLeica, Mannheim, GermanyTCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kitsAffymetrix eBioscience, USA15541037
Cytokines Panel I and IILEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)Roche11644793001
D-(+) GlucoseMerck47829
Dako Fluorescence Mounting MediumDAKOS3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo FischerD1306
Epithelial voltohmmeterWorld Precision Instruments, Sarasota, USAEVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, SterileCorning, Amsterdam, Netherlands353181
Fetal calf serumLonza, Basel, SwitzerlandDE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633InvitrogenA-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscleRoche, Mannheim, Germany10127230001
LB brothSigma-Aldrich, GermanyL2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.11140050
P. aeruginosa strain PAO1American Type Culture Collection47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFPAmerican Type Culture Collection10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%EMS DIASUM15710-S
Phosphate buffer solution bufferThermo Fischer10010023
Petri dishesGreiner664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma, GermanyP8139-1MG
Precision Cover GlassesThorLabsCG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibodyBD Transduction Laboratories610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumGibco by Lifetechnologies, Paisley, UK11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)Normax, Portugal5058561
SaponinSigma-Aldrich, GermanyS4521
T75 culture flasksThermo Fischer156499
THP-1 cellsDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)No. ACC-16
Tobramycin sulfate saltSigmaT1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fischer25300054
Tween80Sigma-Aldrich, GermanyP1754

Ссылки

  1. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
  2. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  3. Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  4. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
  5. Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
  6. Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
  7. Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
  8. Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
  9. Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
  10. Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
  11. Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  12. Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
  13. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
  14. Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
  15. Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
  16. Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
  17. Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
  18. Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
  19. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
  20. Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
  21. Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  22. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
  23. Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  24. Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
  25. Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
  26. Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
  27. Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
  28. Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
  29. Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
  30. Ho, D. -. K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE160TEER

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены