В Vivo Ориентация Ксенотрансплантированных раковых клеток человека с функциональными флуоресцентными наночастицами кремнезема в Зебрафиш

Резюме

Описанный здесь метод использования эмбрионов зебры для изучения способности функциональных наночастиц для целевой человеческих раковых клеток in vivo. Этот метод позволяет проводить оценку и отбор оптимальных наночастиц для будущих испытаний на крупных животных и в клинических испытаниях.

Аннотация

Разработка наночастиц, способных обнаруживать, нацеливать и уничтожать раковые клетки, представляет большой интерес в области наномедицины. Модели животных In vivo необходимы для приведения нанотехнологий к его биомедицинскому применению. Мышь представляет собой традиционную модель животных для доклинкического тестирования; однако, мыши относительно дороги для того чтобы держать и имеют длинные экспериментальные циклы из-за лимитированного потомства от каждой матери. Зебрафиш стала мощной модельной системой для развития и биомедицинских исследований, включая исследования рака. В частности, благодаря оптической прозрачности и быстрому развитию эмбрионы зебры хорошо подходят для мониторинга поведения раковых клеток и их взаимодействия с микроокнироникой в режиме реального времени. Этот метод был разработан для последовательного введения раковых клеток человека и функционализированных наночастиц в прозрачных эмбрионах Каспер зебры и мониторинга распознавания in vivo и ориентации раковых клеток наночастицами в режиме реального времени. Этот оптимизированный протокол показывает, что флуоресцентно помеченные наночастицы, которые функционируют с группами фолиевой кислоты, могут конкретно распознавать и таргетировать метастатические клетки рака шейки матки человека, помеченные другим флуорохромом. Процесс распознавания и таргетинга может произойти уже через 30 минут после вятия проверенных наночастиц. Весь эксперимент требует только разведения нескольких пар взрослых рыб и занимает менее 4 дней. Кроме того, эмбрионы зебры не имеют функциональной адаптивной иммунной системы, что позволяет присвещать широкий спектр раковых клеток человека. Таким образом, полезность описанного здесь протокола позволяет тестировать наночастицы на различных типах раковых клеток человека, облегчая отбор оптимальных наночастиц в каждом конкретном контексте рака для будущего тестирования у млекопитающих и клиники.

Введение

Разработка наночастиц, способных обнаруживать, нацеливать и уничтожать раковые клетки, представляет большой интерес как для физиков, так и для биомедицинских исследователей. Появление наномедицины привело к разработке нескольких наночастиц, таких как те, которые спрягаются с таргетингом лигандов и/или химиотерапевтических^{препаратов 1,,2,,3.} Добавленные свойства наночастиц позволяют их взаимодействие с биологической системой, зондирование и мониторинг биологических событий с высокой эффективностью и точностью наряду с терапевтическим применением. Наночастицы оксида золота и железа в основном используются в компьютерной томографии и магнитно-резонансной томографии, соответственно. В то время как энзиматическая деятельность наночастиц золота и оксида железа позволяет обнаруживать раковые клетки с помощью колоритных анализов, флуоресцентные наночастицы хорошо подходят для применения изображений in vivo^4. Среди них, ультрабелые флуоресцентные наночастицы особенно полезны, из-за их способности обнаруживать рак на ранних стадиях с меньшим количеством частиц и снижение^{токсичности 5}.

Несмотря на эти преимущества, наночастицы требуют экспериментов с использованием моделей животных in vivo для выбора подходящих наноматериалов и оптимизации процесса синтеза. Кроме того, как и наркотики, наночастицы полагаются на модели животных для доклинического тестирования, чтобы определить их эффективность и токсичность. Наиболее широко используемой доклинической моделью является мышь, которая является млекопитающим, содержание которого стоит относительно дорого. Для исследований рака, либо генетически модифицированных мышей или ксенотрансплантированных мышей, как правило,^{используются 6,7}. Продолжительность этих экспериментов часто охватывает от нескольких недель до нескольких месяцев. В частности, для исследований метастазирования рака раковые клетки непосредственно вводятся в кровеносную систему мышей в таких местах, как вены^{хвоста и селезенки 8,,9,,10.} Эти модели представляют собой только конечные стадии метастазирования, когда опухолевые клетки экстравазают и колонизируют отдаленные органы. Кроме того, из-за проблем с видимостью, это особенно сложно контролировать миграцию опухолевых клеток и наночастиц ориентации опухолевых клеток у мышей.

Зебрафиш(Danio rerio) стала мощной позвоночной системой для исследований рака из-за его высокой плодовитости, низкой стоимости, быстрого развития, оптической прозрачности и^{генетических консерваций 11,,12}. Еще одним преимуществом зебры над моделью мыши является оплодотворение рыбьих яиц ex utero, что позволяет контролировать эмбрионы на протяжении всего их развития. Эмбриональное развитие быстро у зебры, и в течение 24 часов послеферетия (hpf), позвоночных плоскости тела уже^{сформировано 13}. К 72 л.с. яйца вылупляются из хориона, переходя от эмбриональной к стадии жарки. Прозрачность зебры, штамм Каспер, в частности ¹⁴, предоставляет уникальную возможность визуализировать миграцию раковых клеток и их распознавания и ориентации наночастиц в живом животном. Наконец, зебрафиш развивать свою врожденную иммунную систему на 48 л.с., с адаптивной иммунной системы отстает и только становится функциональным на 28 дней^{послеференции 15}. Этот разрыв во времени идеально подходит для трансплантации различных типов раковых клеток человека в эмбрионы зебры, не испытывая иммунного отторжения.

Описанный здесь метод, который использует прозрачность и быстрое развитие зебры, чтобы продемонстрировать признание и ориентацию раковых клеток человека флуоресцентными наночастицами in vivo. В этом анализе, раковые клетки шейки матки человека (клетки HeLa) генетически модифицированные, чтобы выразить красный флуоресцентный белок были введены в васкуляризованной области в перивителлинной полости 48 л.с. эмбрионов. После 20-24 ч, heLa клетки уже распространились по всей эмбрионов через систему кровообращения рыб. Эмбрионы с явными метастазами были микроинъектированы с 0,5 нл раствора наночастиц прямо за глазом, где находится богатая капиллярная кровать. Используя этот метод, ультрабрайт флуоресцентные наночастицы кремнезема могут ориентироваться на клетки HeLa так быстро, как 20-30 мин постинъекции. Благодаря своей простоте и эффективности, зебрафиш представляет собой надежную модель in vivo для тестирования различных наночастиц на их способность ориентироваться на конкретные раковые клетки.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Медицинской школе Бостонского университета в соответствии с протоколом No: PROTO201800543.

1. Поколение эмбрионов Каспер зебры

1. Выберите взрослых рыб Каспер, которые по крайней мере 3 месяцев для естественного разведения для создания прозрачных эмбрионов Каспер зебры.
2. Заполните двухкамерные брачные резервуары рыбной водой вечером, разделите верхние резервуары с помощью разделителей, поместите одну самку рыбы в одну сторону камеры и одну или две самки рыбы на другую сторону камеры и оставьте рыбу, отделенную на ночь разделителями.
3. Вытащите разделители на следующее утро в 8:00 утра, когда свет на. Добавьте искусственные обогатительный завод и слегка наклоните верхнюю камеру, чтобы создать неглубокую площадь воды. Разрешить рыбе размножаться в течение 3-4 ч.
4. Поднимите верхние камеры брачных резервуаров, которые содержат рыбу и вернуть их в свои оригинальные резервуары.
5. Собирайте яйца, расположенные в нижних камерах, заливая воду через сетчатую сетку. Перенесите яйца в стерильную чашку Петри с плотностью не более 200 яиц на тарелку. Удалите мертвые или неутверейтеные яйца и заполните блюдо 2/3, наполненное пресной рыбной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оплодотворенные и здоровые яйца должны быть полупрозрачными и круглыми. Любые яйца, которые облачно, белый, или изуродованы должны быть удалены. Рыбная вода получается из аквариумов на рыбном объекте.
6. Инкубация эмбрионов в инкубаторе при 28,5 градусов по Цельсию за ночь.
7. Отбелить эмбрионы на следующее утро с помощью стандартного протокола, как описано в Зебрафиш Книга¹⁶, и положить эмбрионы обратно в инкубатор (необязательный шаг).
8. Возьмите 24 л.с. эмбрионов из инкубатора во второй половине дня и dechorionate эмбрионов с помощью проназ.
   1. Удалите как можно больше рыбной воды из эмбрионов в чашке Петри и добавьте в блюдо несколько капель проназового раствора (1 мг/мл в рыбной воде). Аккуратно закружить чашку Петри. После того, как хорионы проявляют признаки распада, пипетки эмбрионов вверх и вниз несколько раз, чтобы сломать хорионов, чтобы освободить эмбрионы.
   2. Добавить свежую рыбную воду сразу же в чашку Петри, чтобы прекратить процесс, как только большинство эмбрионов из хорионов. Промыть эмбрионы 3x больше с помощью рыбной воды, чтобы удалить плавающие хорионы. Верните эмбрионы в инкубатор.

2. Подготовка раковых клеток человека к трансплантации

1. Установите температуру инкубатора ровно до 35,5 градусов по Цельсию. Мониторинг инкубатора для обеспечения стабильной и стабильной температуры с помощью термометра внутри инкубатора.
2. Автоклав 1 л рыбной воды в стеклянной бутылке. Сделайте 3% раствор агарозы, добавив 3 г агарозы электрофорезного сорта в 100 мл автоматической рыбной воды и микроволновой воды до полного растворения агарозы.
   1. Налейте горячий раствор агарозы в чашку Петри, пока она не будет заполнена на 3/4. Поместите микроинъекцию плесени на агарозу. Убедитесь, что плесень не находится в контакте с нижней части чашки Петри и не пузырьки форме под.
   2. Разрешить решение затвердеть и тщательно удалить плесень из тарелки. Заполните тарелку с автоклавной рыбной водой и храните тарелку при 4 градусах Цельсия. Довоенной агарозной тарелки и рыбной воды в инкубаторе 35,5 градусов по Цельсию перед сбором клеток HeLa.
3. Потяните 1,0 мм O.D. x 0,78 мм борозиликатные стеклянные капилляры на пипетке с использованием следующих настроек: давление на 500, тепло на 560, тянуть на 100, скорость на 100, и время / задержка в 200. Храните иглы на путте в большой чашке Петри, которая была вытерта этанол полотенцем.
   ВНИМАНИЕ: Вытащил иглы очень острые и хрупкие. Используйте осторожность при обработке.
4. Приготовьте стоковый раствор трикаина метансульфоната (MS222, 4 мг/мл) путем растворения MS222 в автоклавную рыбью воду. Вихрь задолго до использования. Разбавить раствор бульона MS222 1:100 в рыбной воде (т.е. добавить 200 МКЛ раствора бульона MS222 до 20 мл рыбной воды до конечной концентрации 40 мкг/мл) для обезболивать эмбрионы для следующих процедур.
5. Культура hLabel HeLa клетки путем PLenti6.2_miRFP670 с лентивирусом с помощью протокола описано¹⁷. Урожай RFP' HeLa клетки 30 мин-1 ч до трансплантации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческие клетки HeLa были выучены в инкубаторе культуры тканей до 70% стечения в полной среде роста (DMEM средний с 10% FBS) на 37 C дополнено 5% CO₂.
   1. Удалите среду клетки HeLa путем устремления в капюшоне культуры ткани. Кратко промойте слой клетки с стерильным PBS для того чтобы извлечь все следы сыворотки.
   2. Добавьте 3,0 мл стерильного раствора трипсина-ЭДТА в колбу Т-75 и поместите клетки обратно в инкубатор культуры тканей 37 градусов по Цельсию в течение 3-5 минут для облегчения энзиматического пищеварения. Наблюдайте за колбой под микроскопом до тех пор, пока 80% клеток не станут подвешенны.
   3. Добавьте в колбу 6-8 мл среды полного роста. Соберите клетки в стерильную трубку 15 мл, аккуратно трубя. Центрифуга при 135 x g в течение 5 мин.
   4. Аспирировать сверхнатантные и повторное течение HeLa клеток в 3 мл полной среды роста. Повторите выше стиральный шаг 2x. Повторное использование клеток в 1 мл полной среды роста и подсчитать клетки под микроскопом с помощью гемоцитометра.
   5. Спин клетки вниз снова, удалить супернатант, и повторного перерасхода клеток в 1,5 мл микроцентрифуг трубки в концентрации 5 х 10^{7 клеток} / мл. Держите клетки в тепле, держа трубку в одной руке при транспортировке на рыбный объект.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите клетки в тепле, сохраняя клетки внутри инкубатора 35,5 градусов по Цельсию до или во время инъекций эмбрионов.

3. Трансплантация раковых клеток человека

1. Очистите рабочую зону с помощью этанола полотенца перед трансплантацией (например, ножницы, пинцет, пластиковые пипетки, лезвия бритвы).
2. Выровнять эмбрионы в канавках агарозной пластины с помощью пластиковой пипетки. Положите эмбрионы на бок с передней облицовкой вперед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рыбья вода покрывает эмбрионы. Установите некоторые эмбрионы в сторону, чтобы не вводить раковые клетки и использовать в качестве контроля.
3. Включите источник воздуха и микроинъектор. Возьмите HeLa клетки из инкубатора и пипетки клетки вверх и вниз 20-30x с помощью P200 отзыв. Загрузите 3 МКЛ клеточной смеси сразу в иглу с помощью наконечника загрузки геля с разрезанной концом. Аккуратно вставьте наконечник к резкому нижнему концу иглы. При необходимости встряхните иглу, чтобы клеточная смесь движется вниз по игле, чтобы заполнить острый конец.
   1. Вставьте иглу в держатель иглы. Используйте пару пинцетов, чтобы тщательно открыть кончик иглы. Отрегулируйте давление и продолжительность времени на микроинъекторе, чтобы вытолкнуть все пузырьки воздуха внутри кончика иглы. Уменьшите время давления и продолжительности инъекций до тех пор, пока размер капель инъекции не будет 1 нл.
   2. Поместите инъекционной пластины под микроскопом в соответствующем положении, чтобы желток стороне эмбрионов, стоящих перед иглой. Обезболивать эмбрионы, добавляя пять капель разбавленного раствора MS222 (40 мкг/мл).
   3. Распоистите инжектор и позвольте игле коснуться перивителиновой полости каждого эмбриона.
4. Введите клеточную смесь в эмбрионы в васкуляризированной области под полостью перивителина, нажав на педаль стопы.
5. Используйте недоминантную руку, чтобы переместить инъекционной пластины к следующему эмбриону. Используйте доминирующую руку, чтобы расширить и втянуть инжектор при нажатии на педаль ноги одновременно, чтобы продолжить инъекцию. Pipette несколько капель стерильной воды рыбы на эмбрионы, которые были введены. Как только инъекция всех эмбрионов на тарелку будет завершена, смойте эмбрионы стерильной рыбной водой, положите их на стерильную чашку Петри и немедленно переместите их в инкубатор 35,5 градусов по Цельсию.
6. После 3 часов, изучить вводили эмбрионы и удалить мертвые.
7. Верните живые эмбрионы в инкубатор 35,5 градусов по Цельсию и инкубировать их на 20-24 ч, чтобы клетки HeLa распространились от места инъекции к другим частям тела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы хранятся в инкубаторе 35,5 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить выживание и миграцию раковых клеток человека, потому что клетки не очень хорошо себя делают при температуре 28,5 градусов по Цельсию, температура эмбрионов рыб, как правило, инкубируется.

4. Инъекция наночастиц или транспортного средства

1. Обезболить пересаженые эмбрионы на следующее утро пятью каплями разбавленного раствора MS222. Не добавляйте слишком много MS222, потому что это убьет эмбрионы. Под флуоресцентным микроскопом тщательно подбирайте эмбрионы с метастазами хвоста клеток RFP' HeLa и помойте их в новую чашку Петри со стерильной рыбной водой.
2. Сделайте иглы впрыска как ранее описано в разделе 2 используя следующие установки: давление на 500, жара на 645, вытяните на 60, скорость на 50, и время/задержка на 100.
3. Следуйте процедурам шагами 3.1-3.3, чтобы выровнять эмбрионы и загрузить транспортное средство (например, H₂O) или раствор наночастиц в иглу.
4. Ввись 0,5 нл раствора 1 мг/мл наночастиц за глазом и продолжайте инъекцию, как описано в шагах 3,5-3,6(рисунок 1B). Это расположение за глазами обогащается капиллярами, что позволяет наночастицы, чтобы войти в циркуляцию.
5. После аналогичной процедуры, вводить транспортное средство (например, H₂O), который был использован для приостановки наночастиц в эмбрионы с Клетками HeLa пересажены и те, без (т.е. элементы управления) (Рисунок 1A, C).
6. Инкубировать все инъекционные эмбрионы при 35,5 градусов по Цельсию.

5. Визуализация и отслеживание наночастиц и раковых клеток

1. Изучите инъекционные эмбрионы под флуоресцентным микроскопом в 0, 30, 60, 90, 120, 180 и 210 мин после введения наночастиц для мониторинга их распределения в циркуляции и степени ориентации раковых клеток. Ориентация раковых клеток наночастицами может наблюдаться уже через 30 минут после влечения в зависимости от типа наночастиц испытания.
2. Pipette 2-3 эмбрионов в чашку Петри и обездвижить их, добавив пять капель разбавленного раствора MS222 (40 мкг/мл). Как только эмбрионы перестанут плавать, удалите большую часть воды, чтобы позволить эмбрионам лежать на боку.
3. Используйте пипетку с тонкой, мягкой кистью, прикрепленной к ее концу, чтобы выровнять эмбрионы, чтобы они лежали по бокам с передней облицовкой вперед и только один глаз виден.
4. Изображение эмбрионов в красных, синих и ярких каналах при низком увеличении (2x), чтобы захватить весь эмбрион и повторить при более высоком увеличении (6,4x), чтобы захватить область хвоста. Сосредоточьте эмбрион под красным каналом, чтобы избежать кровотечения наночастиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы не должны двигаться во время визуализации. Любое движение приведет к размытым изображениям и невозможности перекрытия изображений из разных каналов.
5. Добавьте пресную рыбную воду эмбрионам сразу после визуализации и верните их в инкубатор. Повторите шаги 5.2-5.4, чтобы изображение эмбрионов в разных точках времени.

Результаты

Схема протокола на рисунке 1 иллюстрирует общие процедуры этого исследования. Прозрачные Каспер мужской и женской взрослых рыб были выведены для создания эмбрионов (раздел 1). Клетки РППЗ HeLa вводились в васкуляризованную область под перивителинов...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь использует зебры в качестве системы in vivo для проверки способности наночастиц распознавать и целевых метастатических раковых клеток человека. На успешное выполнение экспериментов может повлиять несколько факторов. Во-первых, эмбрионы должны быть полностью р?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	KSE scientific	BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sold by Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Fish incubator	VWR	35960-056
Hemocytometer	Fishersci brand	02-671-51B
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Microloader tip	Eppendorf	E5242956003	sold by Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Needle Puller	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope	Olympus	MVX-10
P200 tip	Fishersci brand	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sold by Fisher
Petri dish	Corning	SB93102	sold by Fisher
Plastic pipette	Fishersci brand	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade	Fishersci brand	12-640
SZ51 dissection microscope	Olympus	SZ51
Tricaine methanesulfonate	Western Chemicals	NC0872873	sold by Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sold by Fisher
Tweezer	Fishersci brand	12-000-122