Оценка клеточного окисления с помощью подклеточного сулярного редокса-чувствительного зеленого флуоресцентного белка

Резюме

Этот протокол описывает оценку субклеточного отсека-специфического редокса статуса в клетке. Красный флуоресцентный зонд, чувствительный к редоксу, позволяет проводить удобный коэффициентометрический анализ в нетронутых клетках.

Аннотация

Измерение внутриклеточного окисления/снижения баланса обеспечивает обзор физиологического и/или патофизиологического редокса состояние организма. Тиолы особенно важны для освещения состояния редокса клеток через их снижение дитиола и окислимых коэффициентов дисульфида. Инженерные цистеин-содержащие флуоресцентные белки открывают новую эру для редокс чувствительных биосенсоров. Один из них, редокс чувствительных зеленый флуоресцентный белок (roGFP), может быть легко введен в клетки с аденовирусной трансдукции, что позволяет редокс статус субклеточных отсеков, которые будут оцениваться без нарушения клеточных процессов. Снижение цистеин и окислившиеся цистины roGFP имеют экзцинацию максимум на 488 нм и 405 нм, соответственно, с выбросом на 525 нм. Оценка соотношения этих уменьшенных и окислимых форм позволяет удобное расчет баланса редокса внутри клетки. В этой статье метода, увековеченные человека тройной отрицательный раковых клеток молочной железы (MDA-MB-231) были использованы для оценки состояния redox в живой клетке. Протокол шаги включают MDA-MB-231 клеточной линии трансдукции с аденовирусом, чтобы выразить цитозолик roGFP, лечение H₂O₂, и оценка цистеина и цистина соотношение как с потоком цитометрии и флуоресценции микроскопии.

Введение

Окислительный стресс был определен в 1985 году Гельмут Сис как "нарушение в прооксидант-антиоксидантный баланс в пользу^{первого" 1}, и множество исследований было проведено для получения болезни, питания, и старения конкретных редокс статус организмов^1,2,3. С тех пор понимание окислительного стресса стало шире. Тестирование гипотез использования антиоксидантов против болезней и/или старения показало, что окислительный стресс не только причиняет вред, но и имеет другие роли в клетках. Кроме того, ученые показали, что свободные радикалы играют важную роль для переноса сигнала². Все эти исследования усиливают важность определения изменений в соотношении макромолекулов. Активность ферментов, антиоксиданты и/или окислители, а также продукты окисления могут быть оценены различными методами. Среди них, методы, которые определяют окисление тиола, возможно, наиболее часто используются, потому что они сообщают о балансе между антиоксидантами и прооксидантами в клетках, а также организмов⁴. В частности, в качестве биомаркеров для мониторинга состояния редокса организмов²используются соотношения между глутатионе (GSH)/глутатион дисульфид (ГСГ) и/или цистеином (CySS).

Методы, используемые для анализа баланса между прооксидантами и антиоксидантами, полагаются главным образом на уровни пониженных/окислимых белков или мелких молекул в клетках. Западные помарки и масс-спектрометрия используются для широкой оценки соотношения уменьшенных/окислимых макромолекул (белков, липидов и т.д.), а коэффициенты GSH/GSSG можно оценить с помощью спектрофотометрии⁵. Общей чертой этих методов является физическое возмущение системы клеточным лизисом и/или гомогенизацией тканей. Эти анализы также становятся сложными, когда необходимо измерить состояние окисления различных клеточных отсеков. Все эти возмущения вызывают артефакты в среде анализа.

Редокс чувствительных флуоресцентных белков открыл выгодную эру для оценки баланса redox, не вызывая нарушения в клетках⁶. Они могут быть нацелены на различные внутриклеточные отсеки, что позволяет количественно определить отдельные действия (например, анализ состояния редокса митохондрий и цитозола) для исследования перекрестного разговора между клеточными органеллами. желтый флуоресцентный белок (YFP), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и белки HyPeR рассматриваются Мейером и коллегами⁶. Среди этих белков, редокс чувствительных GFP (roGFP) является уникальным из-за различных флуоресцентных считываний его CyS (например, 488 нм/em. 525 нм) и CySS (например, 405 нм/525 нм) остатки, что позволяет коэффициентический анализ, в отличие от других редокс чувствительных белков, таких как YFP^7,8. Коэффициентометрический выход ценен тем, что уравновешивает различия между уровнями выражения, чувствительностью обнаружения и фотосъемки^8. Подклеточные отсеки клеток (цитозол, митохондрии, ядра) или различных организмов (бактерий, а также клеток млекопитающих) могут быть направлены путем изменения roGFP^7,9,10.

анализы roGFP проводятся с использованием методов флуоресцентной визуализации, особенно для экспериментов по визуализации в режиме реального времени. Цитометрический анализ цитометрических факторов roGFP также возможен для экспериментов с заранее определенными временными точками. Текущая статья описывает как использование флуоресцентной микроскопии и цитометрии потока для выполнения коэффициентной оценки состояния редокса в клетках млекопитающих, переэкспрессионных roGFP (направленных на цитосол) с помощью аденовирусной трансдукции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован для 70%-80% слияния MDA-MB-231 ячеек. Для других клеточных линий, количество клеток и множественность инфекции (MOI) должны быть reoptimized.

1. Подготовка клеток (день 1)

1. Поддержание MDA-MB-231 клеточной линии в 75 см² фляги с 10 мЛ модифицированной среды Орла Dulbecco (DMEM) дополнено 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) при 37 градусов по Цельсию в 5% CO₂ увлажненной атмосфере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DMEM дополняется 10% FBS, 37 градусов по Цельсию, и 5% CO₂ увлажненной атмосфере используются для всех вложения и обработки инкубаций на протяжении всего протокола.
2. Подготовьте клетки MDA-MB-231 к эксперименту.
   1. Отвлите среду в колбе, отсоедините клетки 2 мЛ 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в течение 2 мин, и инактивировать активность трипсина с 6 мЛ полной среды (DMEM с 10% FBS). Центрифуга клетки на 150 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и приостановить клетки в 5 мл полной среды.
   2. Смешайте равный объем суспензии ячейки и 0,4% трипан синий. Возьмите 10 мл этой смеси и подсчитайте клетки с автоматизированным счетчиком ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Счетчик Coulter или гемостометр также может быть использован для подсчета клеток.
   3. Семя клетки в 6 хорошо пластины для анализа цитометрии потока и семян 150000 клеток в 1 мл среднего на хорошо. Подождите 16 ч для вложения ячейки.
   4. Семя клетки в 4 хорошо камеры слайд для флуоресцентной визуализации и семян 25000 клеток в 0,5 мл среднего на хорошо. Подождите 16 ч для вложения ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины контроля семян в дополнение к очистным колодцам. Используйте один из контрольных скважин для определения числа клеток (необязательно: если период крепления клеток короче, чем время удвоения, число клеток можно считать таким же, как плотность посева), а другое для неинфицированного контроля (0 MOI).

2. Аденовирусная трансдукции ROGFP (день 2 и 3)

ВНИМАНИЕ: Аденовирусы могут вызывать заболевания. При перепрофилировании клеток используйте фильтрованные наконечники и обеззараживают наконечники, пастерные пипетки и микроцентрифуги с 10% отбеливателем.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был продемонстрирован с цитосол-специфических roGFP, но другие клеточные отсеки (например, митохондрии или митохондриального межмембранное пространство) могут быть направлены с этим же протоколом.

1. Создание кривой дозы-ответа для МВД для получения наивысшей эффективности трансдукции путем расчета объема аденовируса (мЛ), необходимого для каждого значения МВД для клеточной линии MDA-MB-231(Таблица 1):
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональный титр каждой партии аденовирусных запасов, который выражается как единица формирования бляшек (PFU) на мЛ, предоставляется компанией. Оптимальный МВД для трансдукции отличается между типами клеток. Для большинства клеток млекопитающих оптимальный диапазон МВД составляет от 10 до 300. Согласно клеточному ответу, значения МВД должны быть пересчитаны (например, диапазон МВД должен быть уменьшен, если клетки имеют цитотоксическую реакцию, или диапазон должен быть увеличен, если клетки имеют низкую эффективность трансдукции).
2. Сделать 1:100 разбавления 6 х 10¹⁰ PFU/ mL аденовирал роГФП раствор с клеточной культуры среды (DMEM с 10% FBS) для надежного pipetting.
3. Пипет и добавить 0,0125 мл (12,5 мл), 0,025 мл (25 мл), 0,05 мл (50 мл) аденовирального редогея в каждую скважину из 6-й пластины скважины для того, чтобы провести 150 000 клеток с 50, 100 и 200 МВД соответственно для анализа цитометрии потока(Таблица 1).
4. Pipette и добавить 0,0042 мл (4,2 л) аденовирусного редуляции roGFP в 4-камерных слайд скважин для проток 25000 клеток с 100 MOI для флуоресценции изображений (Таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное количество среды должно быть использовано в скважинах для обеспечения наивысшего взаимодействия между аденовирусной конструкцией roGFP и ячейками. Содержание сыворотки в среде культуры, возможно, потребуется сократить для различных клеточных линий, потому что высокий уровень сыворотки может негативно повлиять на эффективность трансдукции в некоторых типах клеток.
5. Инкубировать клетки на 16-24 ч в условиях содержания клеток. На следующий день (день 3), изменить среды к клетке культуры (DMEM с 10% FBS), чтобы позволить восстановление клеток для дополнительных 24 ч. Визуалируйте клетки под микроскопом для оценки их морфологии; клетки могут выражать roGFP, даже если у них есть морфологические изменения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В третий день ячейки должны начать выражать roGFP; поэтому эффективность трансдукции можно контролировать с помощью флуоресценции микроскопии (фильтры с ex. 488/em. 525). Чтобы получить последовательные результаты анализа, быть в курсе и документировать морфологические изменения под фазовой контрастной микроскоп и наблюдать морфологию при оценке эффективности трансдукции.
6. Построить кривую реакции дозы с помощью 50, 100 и 200 образцов МВД, подготовленных в шаге 2.3, и результатов их эффективности трансдукции, полученных в результате анализа цитометрии потока (шаги 3.1 и 4.1). Оцените оптимальную эффективность трансдукции с помощью документации морфологических изменений (шаг 2.5) и кривой дозы-реакции МВД.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя более 98% популяции клеток в 100 МВД и 200 МВД экспресс roGFP (см. репрезентативные результаты), 200 ГРУППА МВД показали существенные изменения в морфологии клеток MDA-MB-231. Следовательно, наиболее эффективным МВД для MDA-MB-231 клетки было установлено, 100 МВД.
7. После оптимального МВД (здесь было выбрано 100 МВД) для линии Клеток MDA-MB-231, проведение эксперимента с испытательными материалами (10 м H₂O₂ и ее транспортным средством 0,1% деионированной водой).
   1. Подготовка и семя клетки в соответствии с разделом 1. Используя аденовирусный объем трансдукции для 100 МВД, рассчитанный в шаге 2.1, повторите шаги 2.2-2.4 для 100 аденовирусных трансдукции клеток МВД. Затем инкубировать пластины и камерные слайды в соответствии с шагом 2.5.

3. Приобретение баланса CyS/CySS

1. Цитометрия потока (день 4)
   1. На 4-й день инкубируют клетки от шага 2.7.1 с 10 мл H₂O₂ на 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: в качестве испытательного вещества было использовано 10 м H₂O_2, а в качестве лечения в этом протоколе использовалась деионизированная вода 0,1%. Другие окислительных агентов могут быть использованы в качестве положительного контроля здесь.
   2. Aspirate средств от 6 пластины скважины, заменить 750 мл 0,25% трипсин-EDTA решение и ждать 2 мин для клеток, чтобы отделить. Инактивировать трипсин с 2 мл полной среды (DMEM с 10% FBS) и собрать объем в 15 мЛ конические трубки.
   3. Центрифуга труб при 150 х г в течение 5 мин при 4oC. Откажитесь от супернатанта и приостановите клетки в 500 мл фосфатско-буферизированного солевого раствора (PBS).
   4. Повторите шаг 3.1.3
   5. Фильтруй клеточное суспензию в трубы, совместимые с цитометрией, с помощью 40-метровой сетки. Держите трубки на льду и вдали от света и следуйте шагу 4.1 для анализа данных.
2. Микроскопическая визуализация (день 4)
   1. На 4-й день лечите клетки с 10 МЛ H₂O_2,сразу же приобретайте изображения (точка времени 0) и 1 ч после лечения и следуйте шагу 4.2 для анализа данных.

4. Анализ данных

1. Количественная количественная оценка цитометрии потока
   1. Метод цитометрии потока потока для 3 различных анализов с помощью программного обеспечения для приобретения образцов (см. Таблица материалов): передний рассеяние(FCS) на x-оси и боковом рассеянии (SSC) на оси y-оси для оценки размера клеток и сложности клеток (SSC может быть использован для грубой идентификации мертвых и живых клеток); ex. 488 нм/эм. 525 нм (фторсцеин изотиоцианат (FITC) фильтр на оси х и SSC на оси y-оси для оценки CyS-roGFP; ex. 405 нм/эм. 525 нм (Brilliant Violet 510 (BV510) фильтр полос на оси х и SSC на оси y-оси для оценки CySS-roGFP.
   2. Приобретите 0 элементов управления МВД и визуализируйте ячейки с помощью программного обеспечения для приобретения образцов. Повторите этот шаг для оставшихся образцов (50, 100, 200 групп МВД, а затем 10 м H₂O₂ обработанных клеток и обработанных транспортных средств клеток). Сохраните файлы для анализа данных.
   3. Программное обеспечение для анализа открытых данных (см. Таблицу Материалов)и открыть 0 примеров MOI файла. Оцените групповую популяцию, интересующую (Ворота 1). Настройка следующих gatings, чтобы свести к минимуму фоновую флуоресценцию для ex. 488 nm/em. 525 нм (ворота 2) и экс. 405 нм/эм. 525 нм (ворота 3) фильтры полос с неинфицированными (0 MOI) контрольными клетками.
   4. Откройте 50, 100 и 200 файлов образцов МВД в рамках программного обеспечения для анализа данных для оценки кривой дозы-ответа. Анализ среднего интенсивности флуоресценции с гейтсом 2 и 3 для каждого образца. Повторите этот шаг для тестовых образцов (10 м H₂O₂ обработанных клеток и обработанных автомобилями клеток).
   5. Рассчитайте среднее соотношение флуоресцентной интенсивности между окислимыми и уменьшенными формами roGFP со следующим уравнением.

2. Оценка изображения
   1. Используйте микроскоп, содержащий флуоресценции фильтры для CyS-roGFP и CySS-roGFP (например, 488 нм/em. 525 нм и ex. 405 нм/em. 525 нм фильтров, соответственно).
   2. В каждом колодце камерного слайда выберите 4 случайных области для получения изображений, используя 4x цель визуализировать большие области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 20x цель также может быть использована для отображений изображений.
   3. Откройте изображение с помощью программного обеспечения ImageJ¹¹. Применить Анализ (ru) Измерьте команды для каждого изображения и используйте уравнение в шаге 4.1.5 для количественной оценки данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка изображений является коэффициентом; поэтому протокол не включает вычитание фона. Однако, чтобы иметь возможность сравнить изображения, яркость, контрастность и насыщенность должны быть одинаковыми для каждого изображения. Статистическая значимость была оценена с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) и постспеяного теста Туки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Состояние редокса CyS/CySS легко проецируется с помощью трансимированных roGFPs. Флуоресцентный зонд количественно определяет соотношение между уменьшенными и окислимыми формами (длины волн возбуждения 488 нм и 405 нм, соответственно). Данные о флуоресценции могут быть получены как с помощью ц...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Тиол/дисульфидный баланс в организме отражает состояние редокса клеток. В живых организмах есть глутатион, цистеин, белковые тиолы и низкомолекулярные тиолы, все из которых зависят от уровня окисления и повторяют редоксовый статус клеток^4. Инженерные roGFPs позволяют ненару?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	Cell culture
4-well chamber slide	Thermo Scientific	154526	Cell seeding material for fluorescent imaging
5 ml tubes with cell strainer cap	Falcon	352235	Single cell suspension tube for flow cytometry analysis
6-well plate	Corning	353046	Cell seeding material for flow cytometry analysis
15 ml conical tubes	MidSci	C15B	Cell culture
75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks	Corning	4306414	Cell culture
Adenoviral cytosol specific roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker
Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet	Thermo Scientific	1300 Series A2	Cell culture
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Cell counting
Countess cell counter chamber slides	Invitrogen	C10283	Cell counting
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	Cell culture
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 20 µl	Fisherbrand	02-717-161	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl	Fisherbrand	02-717-166	Cell culture
Flow Cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses
Fluorescent Microscope	Advanced Microscopy Group (AMG)	Evos FL	Fluorescent imaging
Hydrogen Peroxide 30%	Fisher Scientific	H325-100	Positive control
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Human epithelial breast cancer cell line
Microcentrifuge tubes, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Cell culture
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Cell culture
Pipet controller	Drummond	Hood Mate Model 360	Cell culture
Serologycal pipet, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Cell culture
Serologycal pipet, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Cell culture
Serologycal pipet, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Cell culture
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 incubator for cell culture
Trypan blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell counting