JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для быстрого и полуквантитативного измерения взаимодействия лиганд-рецепторов в транс в гетерологозной клеточной системе с использованием микроскопии флуоресценции.

Аннотация

Белковые взаимодействия в клеточных интерфейсах диктуют множество биологических исходов, начиная от развития тканей и прогрессирования рака до формирования и поддержания синапса. Многие из этих фундаментальных взаимодействий происходят в транс и, как правило, индуцированных гетерофильных или гомофильных взаимодействий между клетками, выражают мембраны якорь связывающих пар. Выяснение того, как соответствующие мутации болезни нарушают эти фундаментальные белковые взаимодействия, может дать представление о множестве областей клеточной биологии. Многие анализы взаимодействия белка и белка, как правило, не размягываются между cis и транс-взаимодействиями, что потенциально приводит к переоценке степени связывания, которая происходит in vivo и включает в себя трудоемкую очистку белка и/или специализированного оборудования мониторинга. Здесь мы представляем оптимизированный простой протокол, который позволяет осуществлять наблюдение и количественную оценку только транс-взаимодействий без необходимости длительной очистки белка или специализированного оборудования. Анализ агрегации клеток HEK включает в себя смешивание двух независимых популяций клеток HEK, каждая из которых выражает мембранные согнатные лиганды. После короткого инкубационного периода образец изображения и полученные агрегаты количественно.

Введение

Синаптические взаимодействия, облегчаемые молекулами синаптической адгезии, являются основополагающими для развития, организации, спецификации, обслуживания и функции синапсов и генерации нейронных сетей. Идентификация этих транссинаптических молекул адгезии клеток быстро растет; Таким образом, принципиально важно определить связывающих партнеров и понять, как эти новые молекулы адгезии взаимодействуют друг с другом. Кроме того, секвенирование генома выявило мутации во многих из этих молекул адгезии, которые обычно связаны с множеством нейроразвития, нейропсихиатрических и пристрастийрасстройств 1. Мутации в генах, кодящие молекулы синаптической клеточной адгезии, могут пагубно изменять транс-взаимодействия и могут способствовать патофизиологическим изменениям в формировании и обслуживании синапса.

Существует несколько анализов для количественной оценки белково-белковых взаимодействий, таких как изотермальная калорийность, круговой дихроизм, поверхностныйплазмоновый резонанс 2 и, хотя количественный по своему характеру, они имеют несколько ограничений. Во-первых, они требуют рекомбинантного белка, иногда требуя длительных и утомительных шагов по очистке. Во-вторых, они требуют сложного специализированного оборудования и технических знаний. В-третьих, они могут переоценить степень связывания, поскольку они позволяют как cis, так и транс-взаимодействия между белками, которые естественным образом привязаны к мембране in vivo. Здесь мы предлагаем простой и относительно быстрый анализ, который исключительно тестирует транс-взаимодействия.

Чтобы обойти многие из осложнений, связанных с очищенными анализами белка, мы оптимизировали клеточное белковое взаимодействие, которое резюмирует транс-взаимодействия в уменьшенной гетерологио-клеточной системе. Этот анализ ранее использовался в различных формах для изучения трансклеточных взаимодействий. При этом подходе молекулы адгезии клеток-кандидатов трансфицированы в клетки HEK293T. В физиологических условиях клетки HEK293T не проявляют самоагрегации, что делает их образцовыми моделями для этого анализа. Однако, когда отдельные популяции клеток HEK, выражаюющих рецептор и лиганд, объединяются, связывание рецептора и лиганда заставляет агрегацию клеток HEK произойти. Эта агрегация опосредовано исключительно транс-взаимодействиями и обычно наблюдается в десятки минут. В этом методе не требуется никаких шагов по очистке белка, и эффективность метода зависит от парадигмы, что популяции клеток HEK, выражают молекулы адгезии cognate, объединяются, а затем образовываются только через десятки минут. Кроме того, этот метод является относительно недорогим, так как ни антител, ни дорогостоящее оборудование не требуется. Единственным оборудованием, необходимым для получения данных, является стандартный флуоресцентный микроскоп. Дополнительным преимуществом этого клеточного анализа является способность быстро проверять влияние соответствующих точечных мутаций заболевания на транс-взаимодействия. Это может быть выполнено путем трансфектирования клеток HEK с cDNAs мутантных вариантов белка интереса.

В этом протоколе мы представляем пример, в котором мы исследуем, изменяет ли мутация в Neurexin3(Neurexin3'A687T),выявленную у пациента с диагнозом глубокая интеллектуальная инвалидность и эпилепсия, взаимодействия в транс с богатым лейцином ретрансляторным трансмембранным белком 2 (LRRTM2). Neurexin3 является членом эволюционно сохраненного семейство пресинаптических молекул адгезии клеток и в то время как недавняя работа определила несколько ролей в синапсе3,4,5,6,7, наше синаптическое понимание этой молекулы и всех членов семьи неурексинов остается неполным. LRRTM2 является возбуждающей постсинаптической клеточной адгезии белка, который участвует в формировании и обслуживаниисинапса 8,9,10. Важно отметить, что LRRTM2 исключительно взаимодействует с изоформами неурексина, которые не имеют сращивания сайта 4 альтернативный экзон (SS4-), но не с neurexin изоформы, содержащие сращивание сайт 4 альтернативный экзон (SS4 "). Мутация человеческой миссенсе (A687T), выявленная в Neurexin3, находится в неизученной внеклеточной области, которая эволюционно сохраняется и сохраняется между всеми альфа-неврексинами7. Поскольку взаимодействие между этими двумя молекуламибыло установлено 8,9,11, мы поставили вопрос: является ли связывающая способность Neurexin3'SS4- к LRRTM2 изменена мутацией точки A687T? Этот анализ показал, что мутация точки A687T неожиданно усилила агрегацию Neurexin3 до LRRTM2, предполагая, что внеклеточная область, в которой находится точка мутации, играет определенную роль в посредничестве транссинаптических взаимодействий.

протокол

1. Культура клеток и трансфекция

  1. Сделать HEK сотовых средств массовой информации с DMEM, 1x (Dulbecco Модификация среднего орла) дополняется 4,5 г / л глюкозы, L-глутамин и пируват натрия и 10% FBS. Стерильный фильтр.
  2. Предопределить подходящие лиганды и рецепторы для агрегирования анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Neurexin3'SS4/- и один из его известных лигандов, LRRTM2, были использованы в этом исследовании. Лиганды и рецепторы, представляющие интерес, были выражены от cDNAs в pcDNA3.1. Сборка Gibson была использована для вставки Neurexin3 в pcDNA3.112. Neurexin3' F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCGGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTCCCC/
    GAGCGGCCGCCACTGTGGTTATCTGCAGAATTCTTACATAACTCCTTGTCCTTCCTTTT.
  3. Подготовь ячейки HEK293T.
    1. Выращивайте клетки HEK293T до слияния в одной колбе Т-75.
    2. После слияния используйте 2 мл трипсина и поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 2 минут. Добавьте 6 мл средств HEK в колбу, чтобы повторно использовать клетки и перенести все 8 мл в коническую трубку 15 мл.
    3. Пеллет на 500 х г в течение 5 мин и повторно в HEK сотовых средств массовой информации в общей сложности 8 мл.
    4. Подсчитайте клетки и добавьте 735.000 клеток в каждый колодец плиты 6-наилучшим образом. Отрегулируйте конечный объем до 2 мл для каждой системы с использованием сотовых медиа HEK.
    5. Поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию и дайте клеткам расти в одночасье или до тех пор, пока они не достигнут 50-60% слияния.
  4. Трансфект HEK293T клетки с использованием фосфатного метода кальция13.
    1. Трансфект хорошо-1 с 3 мкг белка интереса и со-трансфект с 1 мкг флуоресцентного белка (3 мкг pcDNA3.1-Neurexin3'WT SS4- и 1 мкг mCherry).
    2. Transfect well-2 как в шаге 1.4.1. но с мутировавшим белком интереса (pcDNA3.1-Neurexin3-A687T SS4-).
    3. Трансфект хорошо-3 с 3 мкг лиганда интереса и со-трансфекта с 1 мкг другого флуоресцентного белка (3 мкг ППНА3.1 LRRTM2 и 1 мкг GFP).
    4. Transfect хорошо-4 и хорошо-5, чтобы служить в качестве отрицательного контроля: хорошо-4 с 1 мкг GFP и хорошо-5 с 1 мкг mCherry.
    5. Подготовь еще одну пластину (как в шаге 1.4.1-1.4.4), если требуется дополнительные условия или элементы управления(Neurexin3'WT/A687T SS4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность трансфекции анализируется через 24 ч после трансфекции под микроскопом эпифторесценции и количественно определяется как количество клеток, выражаюющих флуоресцентный белок, с помощью которого они были трансфицированы. Более рационализированный подход будет включать в себя трансфекцию клеток HEK с бицистратронным векторным кодированием флуоресцентного белка и лигандом интереса и настоятельно рекомендуется выше co-transfection. В случае этого исследования, альфа-нейролексины являются 4,3 кб и низкой интенсивности флуоресценции наблюдалось с помощью бицистрановой системы, требующие совместного трансфекции.
  5. Через 48 часов после трансфекции, урожай клеток для агрегации.
    1. Вымойте каждый хорошо дважды с PBS.
    2. Добавьте 1 мл 10 мМ EDTA в PBS в каждый колодец, чтобы мягко разобщить взаимодействия клетки к клетке и инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин не рекомендуется для шага 1.5.2 из-за потенциального протеолитического расщепления молекул адгезии в исследовании. Кроме того, после добавления EDTA протокол не может быть остановлен до завершения, так как клетки теперь будут подвергаться воздействию окружающей среды.
    3. Аккуратно нажмите пластины, чтобы отделить клетки, и урожай каждого хорошо в отдельные 15 мл конических труб.
    4. Центрифуга конические трубки при температуре 500 х г и комнатной температуре в течение 5 мин.
  6. В то время как клетки гранулирования, подготовить 6 инкубациовых трубок, помекая верхней части каждой микроцентрифуг трубки с каждым условием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая перестановка условий GFP и mCherry должна использоваться для охвата всех экспериментальных условий и надлежащего контроля. Например: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3-WT SS4--mCherry, 4. GFP/Neurexin3-A687T SS4 - -mCherry, 5. Neurexin3'WT SS4---mCherry/LRRTM2-GFP, 6. Neurexin3'A687T SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP. Сделайте дополнительные трубки для размещения дальнейших условий и элементов управления.
  7. Удалите сверхнатантные и мизопенсные клетки в 500 МКЛ средств массовой информации HEK с 10 мМ CaCl2 и 10 мМ MgCl2 нагревается до 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление CaCl2 и MgCl2 позволяет молекулам адгезии восстановить связывание и требуется только в том случае, если партнеры по трансклеточному взаимодействию, о котором идет речь, требуют дивалентных катионов для адгезии.
  8. Подсчитайте клетки в каждой конической трубке 15 мл с помощью гемоцитометра и aliquot 200,000 клеток каждого состояния в соответствующую трубку из шага 1.6.1 для смеси 1:1 в общем объеме 500 МКЛ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно занять всего 5 минут на условие, чтобы подсчитать и aliquot суммы.
  9. Инкубационые трубки при комнатной температуре в медленном ротаторе трубки.

2. Приобретение изображений

  1. Оптимизация параметров приобретения микроскопа для конкретных образцов. В этом примере изображения были сделаны на широкое поле микроскопа. Используйте 5x воздушную цель (NA: 0.15; WD: 20000 мкм), чтобы получить достаточно большое поле для анализа.
  2. Оцените базовую агрегацию сразу после смешивания двух условий клеток HEK в шаге 1.8. Теперь это изображения "нулевого времени".
    1. Pipette 40 йл каждой образцовой смеси на заряженный слайд микроскопа и изображение под флуоресценцией в обоих 488 и 561 каналов.
    2. Приобрети три различных поля зрения на одной плоскости фокусировки на каплю выборки.
  3. Приобрети окончательные изображения на 60 мин, как "время 60" изображение.
    1. Чтобы получить изображение смеси «время 60» после инкубации за 60 минут, возьмите еще 40 йл образца каждого состояния из вращающихся трубок и пипетки каждый образец на заряженный слайд. Изображение как в шаге 2.2.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Агрегация клеток должна проверяться каждые 15 минут до тех пор, пока не произойдет насыщение. Сроки агрегации будут зависеть от белков, тестируются.

3. ImageJ/Фиджи Анализ

  1. Для количественной оценки масштабов агрегирования с использованием Фиджи/ImageJ сохраните файлы анализа.
    1. Сохраните предоставленные дополнительные файлы кодирования в папке макросов imageJ на компьютере.
    2. Установите предоставленный макрос агрегации (Plugins, Macros, Install и выберите файл "AggregationAssay.txt" ).
  2. Определите пороговые значения.
    1. Загрузите "нулевой" .tif файл в imageJ и разделите каналы(Image | Цвет | Сплит каналы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение "нулевой времени" используется для определения порогового и малейшего размера puncta для всего эксперимента.
    2. Маска каждого канала (Плагины | Макрос | AggregationAssay_MakeMask). Появится окно Mask From Image. Проверьте коробки рядом, чтобы определить порог для изображения и определить кластерные парамы из гистограммы и нажмите OK.
    3. Определите порог изображения с помощью слайд-бара, завездьте номер справа от слайд-бара и нажмите OK.
    4. Появится гистограмма размера кластера. Выберите размер кластера из гистограммы, которая подходит эксперименту, ввените это число в размере кластера Min: поле и нажмите OK. Кластеры ниже этого размера анализироваться не будут.
  3. Вы запустите анализ.
    1. Откройте изображение "время 60" состояния 1 в imageJ и разделите каналы как шаг 3.2.1.
    2. Маска каждого канала (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Используйте тот же порог и размер, определяемый в шаге 3.2.3 и шаге 3.2.4. Неизбирать коробки рядом с определением порога для изображения и определить кластерные парамы из гистограммы и вручную ввести размер и пороги в соответствующие поля, а затем нажмите OK.
    3. Рассчитайте индекс агрегации(Plugins | Макрос | AggregationAssay_CalculateOverlap). Выберите каналы в масках, которые можно сравнить, и каталог, в котором будут экономить полученные файлы.
    4. Повторите шаги 3.3.1-3.3.3 для каждого изображения 'время 60' в каждом состоянии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс агрегации определяется как общая площадь перекрытия, разделенная на сумму двух областей канала за вычетом области перекрытия, умноженной на 100 (индекс агрегации - область перекрытия/область канала 1 - область канала 2 - область перекрытия х 100). Эта нормализация является операцией «ИЛИ» между двумя каналами в масках, представляющими общие пиксели в любой маске.

Результаты

Мутация A687T увеличивает привязку Neurexin3'SS4 к LRRTM27
Чтобы исследовать, как межклеточное взаимодействие двух известных синаптических белков зависит от введения точечных мутаций, обнаруженных у пациента с умственной неполноценности и эпилепсией, мы использовали выш?...

Обсуждение

Рассечение белково-белковых взаимодействий, которые происходят в транс во время клеточной адгезии, может привести к лучшему пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе основных клеточных процессов, включая образование, функцию и поддержание синапсов во время созревания и рек...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Национального института психического здоровья (R00MH103531 и R01MH116901 до J.A.), додокторского обучения Грант от Национального института общей медицины (T32GM007635 к S.R.), и Лида Хилл Гиллиам стипендий для перспективных исследований (GT11021 в S.R.). Мы благодарим доктора Кевина Вульфри за помощь с микроскопом, доктора К. Ульриха Байера за использование его эпифлуоресцентного микроскопа и Томаса Сюдхофа (Стэнфордский университет) для плазмиды LRRTM2.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL disposable microtubes with snap capsVWR89000-028Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membraneThermo Fisher567-0020Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubesWard’s Science470224-998Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture platesVWR100062-892culturing HEK cells
Calcium ChlorideSigma223506-500GCalcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RTKendro Laboratory Products75004377Harvesting HEK cells
CO2 cell incubatorThermo ScientificHERACELL 150iIncubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvateCorning10-013-CVHEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)Gibco14190-144Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acidSigmaED-500GHarvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth areaCorning9381M26Culturing HEK cells
Fetal Bovine SerumSigma17L184HEK cell maintenance
HEK293T cellsATCCModel system
ImageJNIHV: 2.0.0-rc-69/1.52pImage analysis
Magnesium Chloride hexahydrateSigmaM9272-500GHEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrousFisher BioReagentsBP332-500Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) SolutionGE Healthcare Life SciencesSH30042.01Passaging HEK cells
Tube rotatorIncubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive ChargedDenville Scientific Inc.M1021Image acquisition
Wide-field microscopeZeissAxio Vert 200MImage acquisition

Ссылки

  1. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  2. Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
  3. Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
  4. Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
  5. Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
  6. Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
  7. Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
  8. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
  9. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
  10. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
  11. Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
  12. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  13. Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
  14. Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
  15. Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
  16. Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
  17. Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
  18. Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
  19. Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159HEK293TNeurexinLRRTMCell adhesion

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены