Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo

Резюме

Настоящий протокол генерирует сетчатой формы инженерии сердечных тканей, содержащих сердечно-сосудистые клетки, полученные из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, чтобы исследование клеточной имплантации терапии сердечных заболеваний.

Аннотация

Текущий протокол описывает методы для создания масштабируемых, сетчатой формы инженерии сердечных тканей (ECTs), состоящий из сердечно-сосудистых клеток, полученных из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые разработаны в направлении цели клинического использования. HiPSC полученных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и сосудистых клеток фрески смешиваются с гель матрицы, а затем вылил в полидиметилсилоксана (PDMS) ткани формы с прямоугольными внутренними шахматной должностей. По культуре день 14 ECTs созревают в 1,5 см х 1,5 см сетки структуры с 0,5 мм диаметром миофибер расслоения. Кардиомиоциты выравниваются к длинной оси каждого пучка и спонтанно бьют синхронно. Этот подход может быть увеличен до большего (3,0 см х 3,0 см) сетки ЭСТ при сохранении созревания конструкции и функции. Таким образом, сетчатые ЭКТы, генерируемые из сердечных клеток, полученных из hiPSC, могут быть осуществимы для парадигм регенерации сердца.

Введение

Многочисленные доклинические исследования и клинические испытания подтвердили эффективность клеточной сердечной регенеративной терапии для отказа^{сердца 1,2,3}. Среди различных типов клеток, человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) являются перспективными источниками клеток в силу их пролиферативной способности,^{потенциал для создания различных сердечно-сосудистых линий 4,5}, и алогенности. Кроме того, технологии тканевой инженерии сделали возможным перенос миллионов клеток на поврежденное сердце^5,,6,,7,,8.

Ранее мы сообщали о генерации трехмерных (3D) линейных инженерных сердечных тканей (ЭКТ) из сердечно-сосудистых линий, полученных из hiPSC, с использованием коммерчески доступной системы культуры для 3D биоискусных^{тканей 5,7}. Мы обнаружили, что сосуществование сосудистых эндотелиальных клеток и фресок с кардиомиоцитами в рамках ЭСТ облегчает созревание структурных и электрофизиологических тканей. Кроме того, мы подтвердили терапевтический потенциал имплантированных hiPSC-ECTs в иммунной толерантной модели инфаркта крыс миокарда для улучшения сердечной функции, регенерации миокарда, и повышения ангиогенеза⁵. Тем не менее, линейные ЭКТ, построенные этим методом, были 1 мм на 10 мм цилиндрами и поэтому не подходили для имплантации в доклинических исследованиях с более крупными животными или клиническом использовании.

Основываясь на успешном использовании тканевых форм для генерации пористой инженерии формирования тканей с использованием крыс скелетных^{миобластов и кардиомиоцитов 9}, человека ESC полученных кардиомиоцитов¹⁰ и мыши iPSCs¹¹, мы разработали протокол для создания масштабируемых hiPSC полученных больших имплантируемых тканей с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) формы. Мы оценили ряд геометрий плесени, чтобы определить наиболее эффективные характеристики плесени. Сетчатые ЭКТ с несколькими пучками и соединениями продемонстрировали отличные характеристики в жизнеспособности клеток, функции тканей и масштабируемости по сравнению с простым листом или линейными форматами, в которых отсутствовали поры или соединения. Мы имплантировали СЕТ в форме сетки в модель инфаркта миокарда крысы и подтвердили его терапевтические эффекты, похожие на имплантированные цилиндрические^{ЭКТ 12.} Здесь мы описываем протокол для создания СЕТ в форме сетки, полученной от hiPSC.

протокол

1. Поддержание HIPSCs и сердечно-сосудистой дифференциации

1. Расширить и поддерживать hiPSCs на тонком пальто подвале мембранной матрицы (фактор роста уменьшается, 1:60 разбавления) в кондиционированной среде извлечены из мыши эмбриональных фибробластов (MEF-CM) с основным фактором роста фибробластов человека (hbFGF)⁴.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали hiPSCs (4-фактор (Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc) линия: 201B6). Добавьте hbFGF при соответствующей концентрации для каждой клеточной линии. Фрагмент Laminin-511 также может быть использован для покрытия культуры блюдо вместо мембранной матрицы подвала. Коммерчески доступная среда, предназначенная для культуры HIPSCs, свободной от фидеры, может быть использована в качестве замены MEF-CM.
2. Используйте versene (0.48 mM этилендиаминетачелтетраатетическая кислота (EDTA) раствор), чтобы отделить и разъединить клетки, когда слияние клеток достигает 90-u2012100%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие коммерчески доступные продукты для диссоциации клеток также могут быть использованы.
3. Клетки плиты при плотности 10 000 клеток/мм^{2 на матричных} пластинах клеточной культуры в MEF-CM с hbFGF и культурой в течение двух-трех дней.
4. Когда культура становится полностью слияние, покрыть клетки с матрицей (1:60 разбавления с MEF-CM) в течение одного дня.
5. Замените MEF-CM на RPMI 1640 и B27 среды. Добавьте 100 нг/мл Activin A и 100 нг/мл Wnt3A в среду в течение одного дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это день 0 дифференциации. Для перерегистрации канонической сигнализации Wnt вместо Wnt3A можно также использовать ингибиторы GSK3.
6. На первый день дифференциации измените средний на новый RPMI 1640 и B27 с 10 нг/мл BMP4 и 10 нг/мл hbFGF. Культурные ячейки в течение двух (протокол MC) или четырех (протокол CM-EC) дней без среднего изменения⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол СМЗЕК оптимизирован для одновременного индуцирования кардиомиоцитов (СМ) и сосудистых эндотелиальных клеток (ЭК). Протокол MC оптимизирован, чтобы преимущественно индуцировать сосудистые клетки фрески (MCs).
7. Протокол CM-EC для индукции CMs и ECs(рисунок 1A).
   1. Замените носитель на 5-й день дифференциации с RPMI 1640 и B27, дополненной 50 нг/мл VEGF₁₆₅.
   2. Изменение среды культуры каждые 48 ч до дня 13-u201215 дифференциации.
8. Протокол MC для индукции сосудистых клеток фрески(рисунок 1B)
   1. Замените среду с RPMI1640 и 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в день 3 дифференциации.
   2. Изменение среды культуры каждые 48 ч до дня 13-u201215 дифференциации.

2. Сотовый сбор и анализ линии в день дифференциации 13-u201215

1. Вымойте^{клетки с} Ca^{2 "и Mg 2"} бесплатно фосфат-буферный солевой раствор (PBS).
2. Добавить раствор диссоциации клеток (содержащий протеазы, коллагеназы и ДНК) в блюдо клеточной культуры, чтобы покрыть пластину. Инкубировать тарелку в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию.
3. Соберите и отмежевать клетки с культурой среды с помощью пипетки после инкубации.
4. Выделите 1 x 10^{6 клеток} для анализа линии с цитометрией потока. Для устранения мертвых клеток, пятно клеток с починимой жизнеспособности красителя.
5. Пятно клеток с мембранными маркерами поверхности в PBS с 5% FBS. Используйте следующие разбавления антител в флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) окрашивание буфера: анти-PDGFR (1:100), анти-VE кадерин (1:100), анти-TRA-1-60 (1:20).
6. Для внутриклеточных белков, resuspend и исправить клетки с 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
7. Пятно клеток с анти-сердечной изоформы Troponin T (cTnT) в PBS с 5% FBS и 0,75% Сапонин, а затем этикетки антитела cTnT с 488 мыши IgG1 (разбавление 1:50).
8. Resuspend окрашенных клеток в PBS с 5% FBS и положить их в facS трубки с напряжением клеток.
9. Проанализируйте клеточный состав окрашенных клеток из каждого протокола дифференциации с цитометрией потока, чтобы облегчить генерацию клеточных суспензий с определенными распределениями линий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этой процедуры, оставшаяся подвеска ячейки для ECTs сохраняется в холодильнике 4 градусов по Цельсию.

3. Изготовление формы ткани PDMS

1. Бросьте 0,5 мм толщиной и более 30 мм х 30 мм слой полидиметилсилоксана (PDMS) путем смешивания преполимера и перекрестного связывания раствора в соотношении 10:1, а затем вылечить при 80 градусов по Цельсию в течение 3 ч.
2. Вырезать лист PDMS и склеить его с силиконовым клеем, чтобы изготовить 21 мм х 20,5 мм прямоугольный лоток с 7 мм в длину, 0,5 мм в ширину, и 2,5 мм высотой прямоугольные столбы в шахматном положении. Горизонтальное расстояние между двумя линиями столбов составляет 2,5 мм(рисунок 2B).
3. Автоклав лоток при 120 градусов по Цельсию в течение 20 мин.
4. Пальто лоток с 1% poloxamer 407 в PBS для 1 ч. Промыть poloxamer 407 и промыть плесень с PBS достаточно до использования.

4. Строительство ЭСТ

1. После анализа клеточной линии объедините клетки из протоколов CM-EC и MC так, чтобы окончательная концентрация MCs составила от 10 до 20% в общем количестве клеток в шесть миллионов клеток на^{конструкцию 5.}
2. Приостановить смешанные шесть миллионов клеток в среде культуры ЭСТ (альфа-минимум существенной среды дополняется 10% FBS, 50 ЗМ 2-меркаптоэтанол и 100 U/mL пенициллин-стрептомицин).
3. Подготовка матричного раствора
   1. Смешайте 133 л растворимого кислотой растворимого крысиного хвоста коллагена типа I (2 мг/мл, рН 3) с 17 л 10-х минимальной необходимой среды (MEM). Затем смешайте раствор с 17 ЗЛ щелочного буфера (0,2 М НаХКО_3,0,2 М HEPES и 0,1 М НаОХ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген должен храниться на льду (4 градусов по Цельсию). Проверьте цвет буфера, и если среда не станет розоватой, когда все решения смешиваются, добавьте дополнительный щелочный буфер к среде. Смешивание шаги должны быть смешать коллагена I и 10x MEM, а затем добавить щелочный буфер. НЕ меняй этот порядок. НЕ генерировать пузырьки в смеси.
   2. Добавьте 67 мкл мембранной матрицы подвала в нейтрализованный коллагеновый раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанный раствор должен храниться на льду (4 градусов по Цельсию).
4. Центрифуга подготовленной клеточной суспензии, содержащей шесть миллионов клеток при 1100 об/мин (240 х г)в течение 5 мин и повторного перерасхода клеток с 167 йл высоко глюкозы DMEM 20% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин (100x).
5. Смешайте подвеску клетки и матричное решение. Общий объем клеточной/матричной смеси для одной конструкции составляет 400 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь клетки/матрицы должна быть невязкой и розоватым цветом на этом этапе. Держите его на льду, как гель будет затвердевать при комнатной температуре. Окончательная концентрация коллагена типа I составляет 0,67 мг/мл.
6. Налейте клеточной / матричной смеси равномерно над poloxamer 407 покрытием PDMS ткани плесени, которая помещается в шесть хорошо культуры^{пластины 12}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Налейте смесь тщательно, чтобы избежать генерации пузырьков, с тем чтобы предотвратить заполнение дефектов в налил гель.
7. Инкубировать клеточной/матричной смеси в стандартном инкубаторе CO₂ (37C, 5% CO₂) в течение 60 мин.
8. После того, как ткань формируется, замочите плесень ткани с 4 мл ЭСТ культуры среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что ячейка/матрица пересекается за 60 минут, конструкция все еще очень хрупкая. Добавить средний осторожно, чтобы избежать повреждения его.
9. Культура ткани в течение 14 дней со средним изменением каждый день.
10. Перед имплантацией ЭСТ аккуратно удалите ЭСТ с погрузочных столбов с помощью стерилизованных тонких типсов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные размеры ЭСТ после удаления из формы меньше, чем оригинальная плесень. Форма 2,1 см x 2,05 см генерирует выпущенную ЭСТ примерно 1,5 см х 1,5 см. Больше 3,9 см х 4,05 см плесень генерирует ЭСТ примерно 3 см х 3 см. Разгруженная ЭСТ показывает внутреннее спонтанное избиение в теплой среде культуры. Хотя первоначально он поддерживает структуру сетки, выгруженный ЭСТ сжимается и конденсируется с течением времени. Можно держать ткань мягко с тонкой типсов, а затем использовать 7-0 шелковый шов, чтобы прикрепить ЭСТ к эпикардии.

Результаты

На рисунке 1A,B показаны схемы протокола CM-EC и MC. После индуцирования CMs и ECs из протокола CM-EC и MCs из протокола MC, клетки смешиваются, регулируя окончательные концентрации MC, чтобы представлять от 10 до 20% от общего количества ячеек. Форма ткани шириной 2 см изготовлен...

Обсуждение

После завершения нашего исследования линейного формата, hiPSC производных ЭСТ⁵, мы адаптировали протокол для смешивания hiPSC полученных CMs, ECs, и MCs для облегчения в пробирке расширение сосудистых клеток в РАМКАХ ИТС и последующего в виво сосудистой связи между ECTs и получателя м...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002