Вскрытие, иммуногистохимия и монтирование мозга личинок и взрослых дрозофил для визуализации зрительной доли

Резюме

Этот протокол описывает три этапа подготовки зрительных долей личинки и взрослой дрозофилы к визуализации: 1) вскрытие мозга, 2) иммуногистохимия и 3) монтирование. Акцент сделан на шаге 3, так как для визуализации конкретных структур оптических лепестков требуется четкая ориентация монтажа.

Аннотация

Оптическая доля дрозофилы, состоящая из четырех нейропилей: пластинки, мозгового вещества, дольки и дольчатой пластинки, является отличной модельной системой для изучения механизмов развития, которые генерируют нейронное разнообразие и управляют сборкой цепей. Учитывая ее сложную трехмерную организацию, анализ оптической доли требует понимания того, как ее взрослые нейропилы и личиночные прародители расположены относительно друг друга и центрального мозга. Здесь мы описываем протокол вскрытия, иммуноокрашивания и монтирования мозга личинок и взрослых особей для визуализации оптических долей. Особый акцент сделан на взаимосвязи между ориентацией монтажа и пространственной организацией лепестка зрительного нерва. Мы описываем три стратегии крепления у личинки (переднюю, заднюю и боковую) и три у взрослой особи (переднюю, заднюю и горизонтальную), каждая из которых обеспечивает идеальный угол обзора для определенной структуры оптической доли.

Введение

Зрительная система дрозофилы, состоящая из сложного глаза и лежащей под ним оптической доли, является отличной моделью для изучения развития и функционирования нейронных цепей. В последние годы зрительная доля, в частности, стала мощной системой для изучения процессов развития нервной системы, таких как нейрогенез и проводка цепей ^{1,2,3,4,5,6,7,8}. Он состоит из четырех нейропил: пластинки, мозгового вещества, дольки и дольной пластинки (последние две составляют дольочный комплекс)1,2,3,4,5,6. Фоторецепторы глаза, нацеленные на нейроны пластинки и мозгового вещества, которые обрабатывают зрительные входы и ретранслируют их в нейропилы комплекса дольки 1,2,3,4,5,6. Проекционные нейроны в дольковом комплексе впоследствии посылают визуальную информацию в обрабатывающие центры высшего порядка в центральном мозге^{мозга 1,5,9}. Сложная организация зрительной доли, вызванная необходимостью поддержания ретинотопии и обработки различных типов визуальных стимулов, делает ее привлекательной системой для изучения того, как собираются сложные нейронные цепи. Примечательно, что мозговое вещество имеет поразительное сходство как в своей организации, так и в развитии с нейросетчаткой, которая долгое время была моделью^{развития нейронных} цепей позвоночных^.

Развитие зрительной доли начинается во время эмбриогенеза, со спецификацией ~35 эктодермальных клеток, которые образуют оптический плакод 2,4,5,6,7,8. После вылупления личинок оптический плакод подразделяется на две отдельные зачатки: 1) внешний центр пролиферации (OPC), который генерирует нейроны пластинки и наружного мозгового мозга, и 2) внутренний центр пролиферации (IPC), который генерирует нейроны комплекса внутреннего пролифера и дольки 4,5,6,10 . У личинки позднего второго возраста нейроэпителиальные клетки OPC и IPC начинают трансформироваться в нейробласты, которые впоследствии генерируют нейроны через промежуточные ганглиозные материнские клетки 4,5,11,12. Невобласты зрительных долей структурированы пространственно и временно ограниченными факторами транскрипции, которые действуют вместе, создавая нейронное разнообразие в их потомстве 11,12,13,14. В куколке цепи нейропилей зрительной доли собираются посредством координации нескольких процессов, включая запрограммированную гибель клеток^11,15, миграцию нейронов^12,16, аксональное/дендритное нацеливание^10,17, образование синапсов^18,19 и вращения нейропилей ^10,17.

В этой статье мы описываем методологию, с помощью которой мозг личинок и взрослых особей препарируется, окрашивается под иммунитет и монтируется для визуализации зрительной доли. Учитывая ее сложную трехмерную организацию, анализ оптической доли требует понимания того, как ее взрослые нейропилы и личиночные прародители расположены относительно друг друга и центрального мозга. Таким образом, мы уделяем особое внимание тому, как ориентация крепления связана с пространственной организацией структур оптических лепестков. Мы описываем три стратегии крепления для мозга личинок (переднюю, заднюю и латеральную) и три для мозга взрослых (переднюю, заднюю и горизонтальную), каждая из которых обеспечивает оптимальный угол для визуализации конкретной популяции предшественников оптической доли или нейропиля.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка мозга личинок к конфокальной визуализации

1. Вскрытия
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом вскрытия приготовьте растворы фикса (4% формальдегида в фосфатно-солевом буфере (PBS)) и PBT (0,1-0,3% Triton in PBS). Раствор фиксатора следует положить на лед во время вскрытия. Хотя в этом протоколе используется фиксатор параформальдегида (PFA), для конкретных эпитопов были описаны альтернативные стратегии фиксации (с использованием PLP²⁰ или PEM²¹). Для вскрытия личинок необходимы две пары щипцов (Дюмон #5 или #55s). Более подробную информацию см. в Таблице материалов.
   1. Начните с заполнения каждой лунки чашки для препарирования 400 μл 1x PBS. С помощью щипцов аккуратно оберите блуждающих личинок третьего возраста, ползающих по внутренней стороне флакона. Поместите личинок в первую лунку посуды, наполненной PBS.
   2. Возьмите одну личинку и перенесите ее в середину лунки. Используя недоминантную руку, удерживайте тело личинки внизу у основания лунки.
   3. Доминирующей рукой аккуратно возьмитесь за крючок для рта личинки и оттяните от тела. Мозг личинки должен быть прикреплен к крючку для рта и другим вспомогательным тканям и будет отрываться по мере того, как ткань будет оттянута.
   4. Удалите добавочные имагинальные диски и перенесите мозг личинки в третью лунку чашки для вскрытия. Имагинальные диски представляют собой эпителиальные ткани, окружающие мозг личинки, которые генерируют взрослые структуры, такие как антенны, глаза, ноги и крылья²⁰. Если имагинальные диски остаются на ткани, они могут препятствовать правильному иммуноокрашиванию мозга личинок.
      1. Чтобы удалить имагинальные диски, используйте пару щипцов, чтобы прочно захватить мозг через вентральный нервный канатик. С помощью еще одной пары щипцов аккуратно оторвите диски.
      2. Снимайте глазной диск осторожно, так как он обхватывает поверхность долей мозга. Чтобы удалить глазной диск, используйте пару щипцов, чтобы прижать мозг к основанию посуды. Вместо того, чтобы удерживать мозг через вентральный нервный канатик, используйте щипцы, чтобы слегка захватить долю мозга, стараясь не сдавливать долю. С помощью другой пары щипцов аккуратно оторвите глазной диск.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Имагинальный диск глаза в конечном итоге дает начало фоторецепторам сетчатки. Для тех, кто заинтересован в изучении нейронных связей между сетчаткой и зрительной долей, глазной диск может быть оставлен в мозге. Тем не менее, для тех, кто интересуется исключительно структурами зрительной доли, рекомендуется удалить глазной диск, так как он может ухудшить качество изображения из-за своего расположения на поверхности мозга.
   5. Повторяйте шаги 1.1.2\u20121.1.4 до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество мозгов (или не истечет 30 минут времени вскрытия). Рассечение не должно длиться более 30 минут, чтобы целостность ткани не была нарушена.
   6. По окончании периода расслоения с помощью пипетки P200 осторожно удалите PBS из третьей лунки. Следите за тем, чтобы в лунке оставался небольшой объем жидкости, чтобы мозг оставался погруженным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы мозг был погружен в жидкость на всех этапах протокола. Если ткань высыхает, качество пятна может быть нарушено из-за нежелательной аутофлуоресценции в конфокальном изображении.
   7. В третью лунку добавьте 500 μL раствора холодного фиксатора. С помощью щипцов осторожно перемешайте жидкость, позволяя мозгу вращаться в чашке. Накройте тарелку предметным стеклом и поставьте ее на лед на 30 минут, чтобы обеспечить фиксацию тканей.
   8. Удалите фиксирующий раствор и промойте мозги 400 μL PBT, 5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тритон - это моющее средство в PBT, которое предотвращает прилипание мозга друг к другу или к блюду и подготавливает ткань к оптимальному проникновению антител.
2. Иммуногистохимия
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько первичных антител, доступных в Банке гибридомных исследований развития (DSHB), которые могут быть использованы для маркировки конкретных структур оптических долей или типов клеток. DE-Cadherin маркирует нейроэпителию IPC и OPC, Bruchpilot (Brp) – развивающийся нейропиль, а Dachshund – нейроны пластинки и дольки (а также небольшое подмножество нейронов мозгового вещества). Кроме того, Elav можно использовать для маркировки нейронов, Prospero — для маркировки ганглиозных материнских клеток, а Repo — для идентификации глии.
   1. Готовят первичный раствор антител путем добавления антител в ПБТ в общем объеме до 100 мкл. Блокатор (10% нормальной козьей сыворотки) может быть использован для предотвращения неспецифического связывания между первичным антителом и тканью 20,22,23. Антитела, используемые в этом протоколе, специфически маркируют ткани мозга без необходимости использования блокаторов.
   2. Удалите окончательную промывку после фиксации и добавьте первичный раствор антител. Перед добавлением раствора антител убедитесь, что в лунке имеется лишь небольшое количество ПБТ. После добавления раствора аккуратно перемешайте мозги щипцами 5\u201210 раз. Накрыть предметным стеклом, закрыть лабораторной пленкой и выдерживать при температуре 4 °C в течение ночи.
      1. В качестве альтернативы, если имеется охлаждаемый орбитальный шейкер, поместите тарелку на шейкер, чтобы оптимизировать ночную инкубацию.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Первичная инкубация антител и все последующие этапы могут быть выполнены в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Объем первичной и вторичной инкубации может оставаться 100 мкл, но этапы промывки следует выполнять с 800 мкл или более PBT.
   3. После инкубации первичные антитела вымывают с помощью ПБТ, как на шаге 1.1.8 предыдущего раздела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичный раствор антитела следует сохранять и хранить при температуре 4 °C, так как его можно повторно использовать для последующих экспериментов. Многие первичные антитела могут быть повторно использованы до четырех раз.
   4. Добавьте 400 μL PBT в мозги для окончательной промывки. Накройте чашку предметным стеклом, запечатайте лабораторной пленкой и поместите ее на орбитальный шейкер на низкой скорости (100 об/мин) и комнатной температуре (RT) на ~4 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Мозги можно оставить в промывке на 2\u20123 дня при температуре 4 °C.
   5. Приготовьте вторичный раствор антитела в общем объеме 100 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе все вторичные антитела используются в разведении 1:500, без блокирующих агентов.
   6. Извлеките промывку PBT из лунки и добавьте вторичный раствор антител. Смешайте ткань в растворе с помощью пары щипцов. Накройте чашку предметным стеклом и лабораторной пленкой. Поместите чашку на орбитальный шейкер в режим RT на минимальный инкубационный период 2 часа. Так как вторичные антитела содержат светочувствительные флуорофоры, накройте чашку алюминиевой фольгой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Мозг можно оставить во вторичном растворе антител на ночь при температуре 4 °C.
   7. Промойте вторичные антитела, как описано в шаге 1.2.3. Добавьте 400 μL PBT в мозги для окончательной промывки. Накройте посуду горкой, запечатайте лабораторной пленкой и фольгой. Поместите мозги на шейкер в режим RT на 4 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Мозги можно оставить в промывке на 2\u20123 дня при температуре 4 °C.
3. Установка
   1. Удалите окончательную смывку PBT и замените ее двумя каплями флуоресцентного монтажного материала. Поместите каплю монтажного носителя на центр предметного стекла.
   2. Перенесите мозги из колодца в каплю на предметное стекло с помощью щипцов. Чтобы не повредить зрительные доли, мозг может удерживаться вентральным нервным канатиком во время переноса на предметное стекло.
   3. Установите мозги в соответствии с приведенными ниже стратегиями монтирования (рис. 1A).
      1. Передней стороной вверх
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для тех, кто заинтересован в визуализации переднего мозгового вещества, пластинки или дольной пробки, эта ориентация монтажа является идеальной. Лучший способ отличить переднюю и заднюю вершины — изучить положение вентрального нервного канатика относительно долей мозга.
         1. Используйте переднюю ориентацию, чтобы увидеть, как вентральный нервный канатик выступает над долями (рис. 1B).
      2. Задней стороной вверх
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ориентация рекомендуется для тех, кто заинтересован в визуализации задних кончиков OPC (pOPC) или IPC ^10,11.
         1. Используйте заднюю ориентацию, чтобы увидеть вентральный нервный канатик, выступающий из-под долей мозга (рисунок 1C).
      3. Вид сбоку
         ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация бокового монтажа используется для визуализации полумесяца нейронов пластинки, мозгового вещества или дольки как в дорсально-вентральной, так и в передне-задней осях в одной плоскости (Рисунок 1G).
         1. Для бокового крепления разделите доли мозга друг от друга, чтобы они упали на бок, пластинка и пробка дольки обращены вверх.
         2. С помощью двух пар острых щипцов разрежьте вентральный нервный канатик пополам, начиная с того места, где канатик прикрепляется к долям. Обратите внимание, что эти две доли уже отделены друг от друга, а вентральный нервный канатик удерживает их в целости и сохранности. Таким образом, следует разделить вентральный нервный канатик вниз от точки расщепления между долями, чтобы отделить их. Затем переверните каждую долю мозга и прикрепленный вентральный нервный канатик на бок боковыми поверхностями вверх.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Для крепления бокового вида рекомендуется использовать вольфрамовую иглу с тонким наконечником, чтобы ориентировать долю мозга на бок. Для четкой визуализации ориентации долей и направления вентрального нервного канатика при монтаже освещение микроскопа можно регулировать. При использовании светодиодного источника света гусиная шея должна быть расположена параллельно поверхности горки для хорошей видимости. Кроме того, интенсивность освещения может быть увеличена или уменьшена для усиления контраста между структурами мозга и обеспечения четкости при монтаже.
   4. Поместите небольшую каплю PBS по обе стороны от монтажного материала, содержащего мозги. Положите по одному покровному листу на каждую каплю, а последний — на мозги. Правый и левый края верхнего покровного стекла должны опираться на два других покровных стекла (Рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тем, как надеть покровную крышку на мозги, необходимо построить мост. Мозг личинок имеет толщину около 200 мкм, и, таким образом, для сохранения целостности ткани создается мостик, который увеличивает расстояние между покровным стеклом и поверхностью предметного стекла.
   5. Заклейте края моста лаком для ногтей, чтобы закрепить смонтированные мозги.
   6. Визуализируйте мозг с помощью конфокальной микроскопии.

2. Подготовка взрослого мозга к конфокальной визуализации

1. Вскрытия
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытие мозга взрослого человека является более сложным процессом, чем вскрытие мозга личинок, и требует осторожного обращения. Настоятельно рекомендуется использовать хотя бы одну пару ультратонких щипцов (Dumont #55) для этой части протокола.
   1. Обезболите мух CO₂ с помощью иглы или накладки и положите их на лабораторную салфетку или бумажное полотенце поверх льда (чтобы они находились под наркозом).
   2. Добавьте 400 μL PBS во все три лунки стеклянной посуды. С помощью щипцов осторожно возьмите одну взрослую муху за крылья и поместите ее в первую лунку посуды.
   3. Используйте пару щипцов, удерживаемых в недоминантной руке, чтобы прижать грудную клетку мухи к основанию лунки. Доминирующей рукой аккуратно оторвите голову от остального тела.
   4. Переложите голову во вторую лунку. Часто голова будет плавать в PBS, и с ней может быть трудно обращаться. С помощью щипцов прижмите его к дну лунки за хоботок.
   5. Отклейте участок кутикулы между глазами с помощью обоих щипцов. Поскольку мозг находится прямо под кутикулой, будьте как можно мягче, чтобы не повредить подлежащие ткани. Продолжайте отслаивать кутикулу по одному кусочку за раз, пока мозг не обнажится. Удалите все вспомогательные ткани (например, сетчатку, трахею, воздушные мешочки), которые могут оставаться прикрепленными к мозгу.
      Примечание: Удаление сетчатки было описано в предыдущих протоколах^22,24, но пластинка также может быть отделена от остальной части зрительной доли. Это полезно для тех, кто хочет изучить комплекс мозгового или долькового мозга, поскольку пластинка находится на поверхности и может препятствовать визуализации этих других нейропилей зрительной доли при визуализации. Чтобы удалить пластинку, с помощью пары острых щипцов аккуратно потяните за углубление между пластинкой и нейропилем мозгового вещества. Пластинка начнет медленно отслаиваться от мозгового вещества. Повторяйте это движение до тех пор, пока не будет удалена вся пластинка. Во время этого процесса важно сохранять твердый контроль над мозгом. Используйте еще одну пару щипцов, чтобы прижать мозг к основанию чашки, расположив ее так, чтобы верхняя и нижняя части центрального мозга идеально помещались между кончиками щипцов. Крепкая хватка вокруг центрального мозга предотвратит нежелательное повреждение зрительной доли.
   6. Перенесите чистый мозг в третью лунку. Повторяйте шаги 2.1.2\u20122.1.6 до тех пор, пока не будет получено достаточное количество мозгов или не истечет максимальный период диссекции в 30 минут.
   7. Удалите PBS в третьей лунке и добавьте 500 μL раствора фиксатора. Следите за тем, чтобы мозг не пересыхал здесь или во время любых этапов промывки, так как это приведет к фоновой флуоресценции на конфокальных изображениях. Накройте чашку предметным стеклом и дайте мозгу инкубироваться в фиксации в течение 20 минут при RT.
   8. После фиксации промойте мозг 400 мкл ПБТ, 5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Мозги можно накрыть предметным стеклом и лабораторной пленкой и оставить в промывке на 2\u20123 дня при температуре 4 °C. Для исследователей, плохо знакомых с системой, может быть проще оставить вспомогательную ткань на мозге до и во время фиксации. Это позволит исследователям максимально увеличить количество образцов мозга, полученных за заданный период вскрытия. После того, как ткань будет зафиксирована и промыта, мозг можно тщательно очистить перед добавлением первичного раствора антител. Мозг взрослого человека с придаточными тканями имеет тенденцию плавать, и поэтому рискует высохнуть. В результате, рекомендуется использовать пару щипцов, чтобы аккуратно собрать все мозги в центр чашки после добавления раствора фиксации, и очистить мозги сразу после фиксации.
2. Иммуногистохимия
   1. Проведите иммуногистохимию, как описано в разделе 1.2 для мозга личинок.
   2. К полезным первичным антителам из ДШБ относятся те, которые упомянуты в протоколе иммуногистохимии личинок в разделе 1.2. Полный список антител и соответствующих разведений см. в Таблице материалов .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо проявлять особую осторожность на этапах промывки мозга взрослого человека, так как он может всплыть на поверхность промывочного раствора и рискует высохнуть на стенках лунки при удалении раствора (что приведет к фоновой флуоресценции). Хорошей практикой является держать пипетку в одной руке, чтобы добавлять или оттягивать жидкость, и пару щипцов в другой, чтобы мозг оставался погруженным.
3. Установка
   1. Перед этапом монтажа выполните окончательную промывку с помощью PBS (вместо PBT). PBS приводит к тому, что мозг становится слегка липким, что позволяет ему оставаться в нужной ориентации во время монтажа.
   2. Удалите окончательную промывку и замените ее тремя каплями флуоресцентного монтажного материала. Поместите каплю монтажного материала на центр предметного стекла микроскопа.
   3. Перенесите мозги из колодца в каплю на предметное стекло с помощью щипцов. Чтобы не повредить зрительные доли и предотвратить высыхание тканей, осторожно извлекайте мозг с помощью капилляров. Медленно сомкните пару щипцов вокруг мозга, пока между кончиками не наберется небольшой объем жидкости, содержащей мозг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе мозга на предметное стекло будьте осторожны и не закрывайте щипцы, так как это может повредить мозг. В качестве альтернативы для переноса мозга можно использовать пипетку P200. Отрежьте конец кончика, чтобы расширить отверстие, и предварительно промойте PBT, чтобы мозги не прилипли к внутренней стороне кончика.
   4. Установите мозг в соответствии со следующими стратегиями (рис. 2A).
      1. Передней стороной вверх
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуализировать нейроны пластинки и мозгового мозга, ориентируйте мозг передней стороной вверх (рис. 2B). Этого можно достичь, изучив анатомию и кривизну центральных долей усиков.
         1. С помощью щипцов аккуратно переверните мозг на бок, чтобы осмотреть как переднюю, так и заднюю стороны. Обратите внимание, что с передней стороны выражено искривление мозга и доли усиков немного выступают наружу от центра.
      2. Задней стороной вверх
         1. Расположите мозг задней (плоской) стороной вверх, а долями усиков вниз (рисунок 2C).
            ПРИМЕЧАНИЕ: Это приблизит дольку и дольковую пластину к поверхности визуализации и идеально подходит для тех, кто заинтересован в визуализации сложных нейронов дольки.
      3. Горизонтальный вид
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуализировать все нейропилы зрительной доли одновременно, используйте стратегию горизонтального монтажа (Рисунок 2G). В этой ориентации тела нейронных клеток, аксональные траектории и дендритные арборизации могут быть визуализированы в одной плоскости.
         1. Первоначально ориентируйте мозг передней стороной вверх. С помощью вольфрамовой иглы осторожно наклоните мозг на 90° вверх так, чтобы он сидел на спинной стороне с долями усиков наружу. Убедитесь, что в этой ориентации видны как передняя, так и задняя стороны мозга.
   5. Вместо моста скольжения крышки используйте глину, чтобы поднять крышку с горки. Использование глины позволяет повторно монтировать мозг после визуализации (описано в разделе обсуждения).
      1. Положите небольшой кусочек глины на каждый угол покровного листа. Следите за тем, чтобы каждый кусок глины был относительно одинаковой толщины. Толщина кусочков глины должна составлять от 0,5 до 1 мм. Аккуратно наденьте покровный стекло на мозги и слегка надавите на углы. Покровное стекло должно сразу же захватывать жидкость и образовывать уплотнение. Теперь предметное стекло готово для визуализации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения предметного стекла рекомендуется заклеить покровное стекло лаком для ногтей и хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Конфокальные изображения личиночных и взрослых зрительных долей, установленных в ориентациях, описанных в протоколе, представлены на рисунках 1 и 2.

На рисунке 1 показаны схемы и репрезентативные конфокальные срезы мозга л...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем метод иммуноокрашивания мозга личинок и взрослых дрозофил и их установки в нескольких направлениях. В то время как методы окрашивания мозга личинок и взрослых особей были описаны ранее 22,23,24,27,28, стратегиям монтажа для оптимальной визуализации специф?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps - #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps - #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506