JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель этой процедуры состоит в том, чтобы вскрыть спинной продольной мышцы (DLM) ткани для оценки структурной целостности DLM нервно-мышечных соединений (NMJs) в моделях нейродегенеративных заболеваний с использованием Drosophila melanogaster.

Аннотация

Дрозофила служит полезной моделью для оценки синаптической структуры и функции, связанной с нейродегенеративными заболеваниями. Хотя большая работа была сосредоточена на нервно-мышечных соединений (NMJs) в личинках дрозофилы, оценки синаптической целостности у взрослых Drosophila получил гораздо меньше внимания. Здесь мы предоставляем простой метод для вскрытия спинных продольных мышц (DLMs), которые необходимы для полета способности. В дополнение к полету в качестве поведенческого считывания, это вскрытие позволяет как DLM синапсов и мышечной ткани, чтобы быть податренным для структурного анализа с использованием флуоресцентно помечены антитела для синаптических маркеров или белков, представляющих интерес. Этот протокол позволяет для оценки структурной целостности синапсов у взрослых Drosophila во время старения для моделирования прогрессивной, возрастной зависимости от большинства нейродегенеративных заболеваний.

Введение

Синаптическая дисфункция является одним из самых ранних известных признаков большинства основных нейродегенеративных заболеваний1,,2,,3,,4,,5,,6. Тем не менее, очень мало известно о том, как эти структурные и функциональные нарушения относятся к более поздним стадиям прогрессирования заболевания. Drosophila зарекомендовала себя как полезная модельная система для понимания роста и развития синапса с использованием личинок NMJs7,,8,9. Тем не менее, третья личинотка instar этапе длится всего несколько дней, ограничивая их полезность в изучении прогрессивных, возрастных нейродегенерации. Альтернативой оценке личинок NMJ является изучение синаптических структур у взрослыхдрозофилы, таких как синапсы, образуюющиеся на продольных мышцах спинного мозга (DLM), которыенеобходимы для полета 10,,11,,12,,13,,14,,15,,16. Эти трехсторонние синапсы структурно организованы по аналогии с синапсамимлекопитающих 17,обеспечивая уникальное преимущество для оценки моделей нейродегенеративных заболеваний.

Здесь мы описываем простой метод для анализа структурной целостности взрослых NMJs в модели Drosophila нейродегенерации. Предыдущие методы и исследования DLM вскрытия подчеркнули важность сохранения мышечнойткани для различных применений 18,,19,,20,,21,,22,,23. Наш протокол предоставляет комплексный метод сохранения как нейронной, так и мышечной ткани для исследования нейродегенеративных заболеваний. Другим важным компонентом изучения этих заболеваний является способность понимать потерю нейронов в возрастной зависимости. Предыдущая работа обеспечивает критическое и глубокое понимание того, как DLM NMJs формируются во время метаморфозыв раннем взрослом возрасте 11,,12,,14,,15,,16,24. Наш протокол устанавливает метод, чтобы опираться на эту работу, чтобы исследовать DLM NMJs в возрастной зависимости от старения и нейродегенеративных заболеваний.

протокол

1. Поколение трансгенных мух

  1. Для генерации трансгенных мух для этого эксперимента, собирать OK371-Gal425 девственных самок мух и самцов UAS-TDP-43M337V 26 (Рисунок 1A) путем обезболиив мух с CO2 на площадке для сортировки.
  2. Сортировать анестезированных мух во флаконы со стандартными Drosophila средств массовой информации для креста. Поместите помеченные флаконы при 25 градусов по Цельсию для следующего поколения, чтобы выйти.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очистить взрослых от флаконов до потомства возникают для обеспечения надлежащего генотипа.
  3. Как только потомство появится, собирать трансгенных мух во флаконы и сортировать по полу, чтобы начать старение для экспериментальных условий.
  4. После того, как мухи собраны, передача мух на свежие продукты питания каждые 2 дня, пока мухи 21 дней.

2. Подготовка к вскрытию

  1. Чтобы подготовиться к вскрытиям, получить комнатную температуру фосфат буфера солевого раствора (1x PBS), 10 см рассечения блюдо покрыто силиконовым ерастомером, прямой край рассечения ножницы, один набор тупых миппов вскрытия, P200 пипетки и пипетки советы, 2,0 мл микроцентрифуг трубки, стандартные офисные ножницы, 70% этанола, 6 см Петри блюдо, и 32% формальдегида разбавленной до 4% с 1x PBS.
  2. Этикетка трубки для каждого генотипа или состояния и добавить 900 йл 1x PBS (комната темп) и 150 МКЛ 32% формальдегида для каждой трубки. Носите перчатки и защитные очки при подготовке 4% формальдегид фиксации.
  3. Обезболивать 6'u201210 мух на группу непосредственно из флакона с CO2 и погрузить мух в 6 см Петри блюдо с 70% этанола. Нажмите летит вниз в этанол с помощью кисти краски, чтобы убедиться, что образцы полностью погружены. Это позволит удалить слой масла на внешней кутикулы.

3. Изоляция и фиксация торакса

  1. Прежде чем вскрыть каждый экземпляр, добавьте приблизительно 7'u201210 мл 1x PBS к блюду для вскрытия, покрытому силиконовым еластомером. Этот объем должен гарантировать, что образцы тканей полностью погружены.
  2. Перенесите одну муху в блюдо для вскрытия из 70% этанола, используя тупые типсы и хватаясь за крылья или ноги.
  3. Сосредоточьте образец в рассечении под рассечением микроскопа. Затем погрузим образец в 1x PBS и аккуратно удалите крылья, используя тупые типсы dumont #5 тонкие миппы.
  4. Использование Vannas прямой край пружинного вскрытия ножницами, удалить ноги, создавая небольшой разрез в брюшной стороне кутикулы. В шаге 3.8, этот разрез позволит формальдегиду проникнуть в ткань.
  5. Возьмите ножницы в одной руке и держите типсы в другой, чтобы распоставить муху брюшной стороны вверх. Удерживая образец на месте тупыми типсами, снимите голову и живот ножницами для вскрытия.
  6. Перенесите изолированную грудную клетку с помощью модифицированного наконечника пипетки в помеченную трубку из шага 3.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите пипетки до 40 МКЛ, чтобы избежать добавления дополнительных 1x PBS к фиксатору.
  7. Повторите шаги 3.2'u20123.6 выше для каждого образца.
  8. Исправить образцы в течение 30 минут при комнатной температуре.
  9. Удалите исправление с помощью трубы Pasteur и выбросить его в надлежащий контейнер отходов под капотом дыма. Промыть образцы три раза с 1,5 мл 1x PBS каждый с помощью трубы Pasteur. Завершите четвертое полоскание, используя только 750 МКЛ и оставьте ткани в 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент образцы тканей могут оставаться на уровне 4 градусов по Цельсию в течение 3 дней, прежде чем приступить к следующим шагам.

4. Вспышка замораживания и биекции грудной клетки

  1. Перед началом раздвоения заполните колбу Dewar жидким азотом в надлежащих криозащитных перчатках и защитных очках. Получить лезвие выключатель, перо лезвия, одна пара тонких типсов, лед, ледяной 1x PBS, и криогенные пинцет.
  2. Подготовка льда ведро держать 1x PBS ледяной.
  3. Используйте выключатель лезвия, чтобы захватить перо лезвие под углом, и согнуть лезвие для того, чтобы разорвать небольшой кусок. Выключатель лезвия может зафиксировать лезвие в положении для использования в качестве небольшого скальпеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одно лезвие должно длиться для всех групп. Переключитесь, если лезвие ломается или становится скучным.
  4. Добавьте чистый наконечник пипетки в P200 и удалите1/5 тыс. наконечника для транспортировки образцов.
  5. Подготовьте новую трубку микроцентрифуга для каждой группы и добавьте 200 МКЛ 1x PBS к каждой трубке. Эта вторая трубка будет использоваться для сбора окончательных DLM preps.
  6. Удалите все 1x PBS из труб с помощью пипетки Pasteur.
  7. Нося надлежащее защитное оборудование, погружайте трубку в жидкую азотную колбу на 10 с криогенными пинцетами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трубы должны быть плотно закрыты, чтобы держать трубку от взрыва.
  8. Снимите трубку с жидкого азота и добавьте около 300 МКЛ ледяной 1x PBS в образцы с пипеткой Pasteur. Храните образцы на льду.
  9. Добавьте ледяной 1x PBS к 10-сантиметровому рассечению тарелки, покрытой силиконовым елатомером, и раздайте первую грудную клетку с модифицированной трубкой 200 МКЛ.
  10. Поместите вентральную сторону грудной клетки вверх. В одной руке использовать скучную пару типсов для положения грудной клетки, а в другой использовать тонкую пару типсов, чтобы удалить некоторые из грудной ганглиона подвергать средней линии грудной клетки.
  11. Используйте середину грудной клетки в качестве руководства, чтобы сделать мелкий разрез через 1/3rd грудной клетки с лезвием.
  12. Снимите лезвие с грудной клетки и распоимить грудную клетку под углом 45 градусов тупыми типсами. Переустановьте лезвие и вырежьте прямо вниз по средней линии грудной клетки. Это приведет к двум гамиторам.
  13. Возьмите один гамиторакс за один раз и удалить избыток ткани под DLM мышечного волокна F (Рисунок 1B), наиболее брюшного волокна. Используйте лезвие, чтобы тщательно сделать один или два разреза, чтобы удалить избыток ткани, не повреждая DLMs.
  14. После изоляции перенесите гемиторакс в правильную трубку с помощью 1x PBS.
  15. Повторите шаги 4.6'u20124.14 до тех пор, пока не будет сделано 10 рассеченных гемитора на группу.

5. Структурное окрашивание

  1. После двухразделивания образцов грудной клетки поместите ткань в блокирующий буфер (1x PBS с 0,1% нормальной козьей сыворотки и 0,2% Triton X-100 при рН 7.4) для пронизывания тканей и предотвращения неспецифического окрашивания. Используйте пипетку Pasteur, чтобы удалить избыток 1x PBS и добавить 1,5 мл блокирующего буфера к каждой трубке. Блок тканей, по крайней мере 1 ч при 4 градусов по Цельсию.
  2. Подготовка образцов для структурного окрашивания с использованием флуоресцентно спряженных антител, пероксидазы хрена 488 (анти-HRP-488) при разбавлении 1:200 и фаллоидин-647 при разбавлении 1:1000 в блокировании буфера для окрашивания моторных нейронов и мышечной ткани, соответственно. Сделайте достаточно пятна, чтобы иметь 150 йл на трубку. Храните пятно при 4 градусах цельсия, покрытых фольгой или в темной коробке до готовности к окрашивания.
  3. После блокировки удалите избыточный блокирующий буфер стеклянной пипеткой Pasteur.
  4. Перед дозированием структурного пятна, вихрь пятно. Добавьте 150 мкл пятна в каждую трубку. Поместите образцы в темную коробку на ротатор при комнатной температуре 2 ч.
  5. Удалить пятно и мыть ткани четыре раза в 1,5 мл комнаты темп 1x PBS с 0,3% Triton X-100 в течение 5 минут на ротатор в темной коробке. Образцы теперь готовы к монтажу на слайде.

6. Монтаж тканей

  1. После мытья образцов в PBST, подготовить слайд микроскопа для установки ткани для окрашивания. Подготовьте дополнительные материалы, включая стеклянные крышки скользит, P200 пипетки, 200 йл пипетки советы, ножницы, четкие подкрепления, прямые миппы края, анти-fade флуоресцентные монтажные средства, лак для ногтей, и темная коробка для покрытия слайдов.
  2. Наклеьте этикетку слайд, чтобы определить образцы и очистить слайд с кимвипей, чтобы убедиться, что нет пятен.
  3. Чтобы убедиться, что образцы гамиторакса не повреждены крышкой скольжения, построить "мост" с использованием арматуры этикетки. Возьмите одну этикетку подкрепления, разрежьте ее пополам, и поместите каждую половину примерно на 15 мм друг от друга. Это расстояние должно быть меньше, чем ширина крышки скольжения. Повторите этот шаг четыре раза, чтобы завершить "мост", который составляет 5 этикеток высотой.
  4. Возьмите P200 пипетку и изменить наконечник, отрезав1/5 тыс. наконечника для передачи образцов на слайд. Образцы должны быть перенесены на горку в центре моста.
  5. Возьмите край лаборатории протрите и удалите излишки PBST. Используя типсы, организовать DLMs таким образом, что все образцы сталкиваются мышечной стороне вверх и кутикулы вниз.
  6. Используя стандартный наконечник пипетки P200, нанесите на слайд 70 МКЛ монтажных средств массовой информации, избегая пузырьков воздуха. Распределять средства массовой информации по круговой схеме внутри подкрепления, начиная с внешней стороны в центр.
  7. Поместите крышку скольжения над подкреплением.
  8. Используйте лак для ногтей, чтобы покрыть внешние края по периметру крышки. Нанесите щедро, чтобы сформировать полную печать ткани.
  9. Поместите слайд на плоскую поверхность в темноте, что позволяет по крайней мере 10 минут, чтобы высохнуть и предотвратить фото-отбеливания или потери флуоресценции. Слайды теперь могут быть использованы для визуализации немедленно, или иным образом храниться в папке слайда при -20 градусов по Цельсию для более длительного просмотра.

7. Альтернатива: Окрашивание первичными антителами

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел является необязательным и должен использоваться непосредственно между разделами 4 и 5 при желании.

  1. Чтобы окрашивать ткани первичными антителами, погрузите ткань в блокирующий буфер не менее 1 ч.
  2. Подготовье первичного антитела с надлежащим разбавлением в блокирующий буфер. Как минимум, подготовить достаточно смеси антител, чтобы иметь 150 йл в группе. Обратите внимание, что образцы хранятся на месте. Хранить при 4 градусов по Цельсию до готовности к использованию.
  3. Удалите избыточный блокирующий буфер с помощью пипетки Pasteur. Кратко вихрь первичного антитела и добавить 150 ЗЛ смеси антител к каждой группе и место образцов на 4 градусов по Цельсию в одночасье.
  4. На следующий день, удалить первичные антитела и мыть ткани 4 раза с PBST в течение 5 минут каждый на ротатор.
  5. Подготовь вторичное пятно в блокируя буфере. Добавить вторичное пятно в образец, а затем держать его комнатной температуры в течение 2 ч в темной коробке на ротатор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное окрашивание может также включать HRP и фаллоидин.
  6. После 2 ч инкубации, чтобы удалить вторичное пятно мыть ткани 4 раза в течение 5 мин с PBST и приступить к монтажу.

Результаты

Поколение трансгенных мух, выражаюющих человеческий tar-Binding Protein 43 kDa mutant (TDP-43M337V), представлено схемой(рисунок 1A). Это демонстрирует применение двоичной системы Gal4/UAS в Drosophila27. На иллюстрации изображен гемиторакс с шестью мышечными волокнами, A'u2012F переход от самого спинного волокна А к самому брюшной F (Рисунок 1B)11,12. Для оценки синаптической целостности, NMJs были окрашены HRP и фаллоидин(рисунок 1C'u2012E). Моторные нейроны в TDP-43M337V мутантов (Рисунок 1F) имеют практически нет HRP окрашивания на день 21, в то время как WT (Орегон-R) остается нетронутым (Рисунок 1C). Есть никаких видимых различий в окрашивание мышц(рисунок 1D,G). Изменения в валовой морфологии наблюдается в TDP-43M337V мутантов показывает, как синаптической целостности могут быть вовлечены в нейродегенеративных заболеваний модели бокового амиотрофического склероза (ALS) с помощью модели DLM взрослых. В дополнение к структурному окрашивания, окрашивание DLM NMJs может также обеспечить оценку синаптической целостности с пресинаптическими(рисунок 2A'u2012R) и после синаптических (Рисунок 2 S'u2012XS‒X) маркеров. Вместе эти результаты иллюстрируют, как этот протокол вскрытия может быть применен к изучению ткани DLM при нейродегенеративных заболеваниях.

Одним из ключевых аспектов этого вскрытия является применение жидкого азота для вспышки заморозить ткани, чтобы сделать бисекцию легче. Полезность жидкого азота продемонстрирована у мух WT с жидким азотом, где мышечная ткань не имеет повреждений или nicked волокон (рисунок 3A'u2012C).Figure 3 Без жидкого азота, ткань может быть более трудно вскрыть. Например, после этого протокола и пропуская жидкий азот флэш замораживания шаг позволяет ткани, чтобы быть более восприимчивыми к повреждению от вскрытия инструментов, таких как поврежденные нейроны (Рисунок 3D) или поврежденных мышечных волокон (Рисунок 3E). Применение жидкого азота помогает предотвратить повреждение тканей, которое может произойти при работе с тканью DLM независимо от генотипа образца(рисунок 3C и 3F).

figure-results-2770
Рисунок 1: Прогрессивная денервация DLM синапсов в модели Drosophila ALS. (A)Поколение трансгенных мух ALS, выражаюх человеческую мутантную форму Tar-Binding Protein 43 kDa (TDP-43), показано в схеме. (B)Иллюстрация изображает форму и ориентацию гемиторакса у взрослого Дрозофилы. Используя протокол, мы можем наблюдать прогрессивную потерю синаптической целостности DLM NMJ синапсов через структурное окрашивание моторных нейронов с HRP (зеленый) и мышечной ткани с фаллоидином (пурпурный). Наша модель изображает потерю синаптической целостности во взрослой модели ALS через поколение взрослых мух, выражают мутанта из человека TDP-43M337V в моторных нейронах (Рисунок 1F'u2012H) по сравнению с WT (Рисунок 1C'u2012E) летит в мышечном волокне C. Стрелки выделить примеры Синапсе WT (Рисунок 1C) и пример потери синаптической целостности. Масштабная планка 20 мкм при увеличении в 63x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4171
Рисунок 2: Оценка синаптической целостности с помощью пресинаптических маркеров у взрослых NMJ. Синаптическая целостность также может быть оценена с помощью пресинаптических и постсинаптических маркеров в WT мух, которые 14 дней в мышечных волокон С. Пресинаптические маркеры Synapsin(B), Синтаксин(H), и Bruchpilot (BRP)(N) являются совместно окрашенные с HRP (A, G, M). Окрашивание изображает локализацию этих маркеров на пресинаптических терминалах(C, I, O). При более высоком увеличении, изображения иллюстрируют локализацию Synapsin ( E ),Синтаксин(K), и BRP(q ) с HRP (D, J, и P) более подробно(рисунок F, L, и R). Мы также показываем постсинаптический маркер Glutamate Receptor III (GluRIII) (T) совместно окрашенные с HRP (S). Совместное окрашивание демонстрирует полезность этих маркеров (U). При более высоком увеличении репрезентативные изображения иллюстрируют локализацию(X) GluRIII (W )и HRP(V) к постсинаптической мышечной ткани и пресинаптических терминалов, соответственно. Масштабная планка для панелей A'u2012C, G-I, M'u2012O, S'u2012U представляет собой 20 мкм при увеличении в 63x. Шкала бар для панелей D'u2012F, 2J-2L, 2P-2R, и 2V-2X представляют собой 10 мкм при 63x увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-6109
Рисунок 3: Полезность жидкого азота для рассечений DLM. Чтобы продемонстрировать полезность жидкого азота для рассечений DLM, мы показываем сравнение 21-го дня ВТ мух с жидким азотом и без него из мышечного волокна С. С жидким азотом фаллоидин(B) остается нетронутым и не ставит под угрозу окрашивание HRP (A, C). Без жидкого азота, мышечная ткань становится тягучим и трудно раздектить (E) и HRP окрашивания (D, F) становится скомпрометирована из-за технической ошибки. Белые стрелки показывают область без повреждения мышц жидким азотом(В) и поврежденноймышечной тканью(E). Масштабная планка 20 мкм при увеличении в 63x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Используя методы, описанные в этом протоколе, мы предоставляем простой подход для вскрытия ткани DLM и продемонстрировать, как это может быть применено для оценки синаптической целостности путем структурного окрашивания и синаптических маркеров у взрослых дрозофилы. Одним из важнейших шагов в протоколе, который делает DLM ткани легче вскрыть это вспышка замораживания с жидким азотом. Без этого шага, ткань является менее твердой и труднее сократить точно, как это наблюдается на рисунке 3. Этот протокол основывается на предыдущих методах вскрытия, позволяющих сохранить как моторные нейроны, так и мышечную ткань18,,19,,20,,21,,22,,23. Одним из ограничений этого протокола является то, что при сокращении средней линии для биекции, это может быть трудно получить два чистых preps на грудную клетку. Один из способов обеспечить по крайней мере один гамиторакс на лету, вы можете намеренно отрезать в одну сторону грудной клетки, чтобы получить один чистый подготовки. С помощью этой модификации, можно также необходимо удалить дополнительные избыточные ткани из разреза, чтобы очистить образец с лезвием выключатель. Для тех, кто нов к этому методу, с продолжением практики, точность bisection будет увеличиваться.

Описанный здесь метод позволяет исследователям легко оценить структурную целостность взрослых DLM NMJs в любое время на протяжении всей их жизни. Основным преимуществом этого протокола является возможность доступа к синаптической целостности в моделях нейродегенеративных заболеваний с помощью синаптических маркеров. Мы демонстрируем, что это приложение может помочь визуализировать изменения в валовой морфологии соструктурным окрашивание(рисунок 1C'u2012H). Кроме того, синаптической целостности могут быть оценены с окрашивание пресинаптических маркеров, включая, но не ограничиваясь Synapsin28 ( Рисунок2 A'u2012FA‒F), Синтаксин29 (Рисунок 2G'u2012L) и BRP30 (Рисунок 2 M'u2012RM‒R). Постсинаптической мышечной ткани также могут быть оценены с помощью глутамата Рецептор IIIсубъединит антитела 31 (Рисунок 2 S'u2012XS‒X), демонстрируя полезность этого протокола.

Исследователи могут также использовать этот метод вскрытия в дополнение к функциональным данным для всестороннего изучения структурной целостности синапсов, связанных с широким спектром заболеваний. Эти синапсы также позволяют для функционального анализа с помощьюэлектрофизиологических,записей 32 , 33,34 и полет анализа10. Этот протокол может также обеспечить легкий доступ к ткани для многих приложений и анализов. Будущие исследования, например, может использовать этот протокол для количественной оценки синаптических изменений путем количественной оценки плотности иколичества синапсов 15,16. Хотя протокол, описанный здесь конкретно рассматривает синаптической целостности моторных нейронов, дополнительные протоколы для оценки потери мышечных клеток также может быть выполнена с этим вскрытием с помощью TUNELокрашивания 35. Для изучения потери нейронов, вскрытие грудной ганглия36 также может быть использован с TUNEL окрашивания. Мы ожидаем, что описанное здесь вскрытие будет иметь больше применений к будущим исследованиям, оценивающих возрастные патологии, а также нейродегенеративные заболевания.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, чтобы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01 NS110727) в D.T.B.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
32% FormaldehydeElectron Microscopy Sciences15714Tissue preservation
Alexa Fluor 568 goat anti mouseFisher ScientificA11031Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.
Alexa Fluor 568 goat anti rabbitFisher ScientificA11036Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration.
anti- Bruchpilot (BRP) antibodyDevelopmental Studies Hybridoma BankNC82Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration.
anti-GluRIII antibodyGift from Aaron DiAntonioN/ALabels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration.
anti-Synapsin antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank3C11Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration.
anti-Syntaxin antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank8C3labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration.
BenchRockerGenesee Scientific31-302Rotating samples during staining
Blade BreakerFine Science Tools10053-09Used for holding feather blade
cover slipsFisher Scientific12548AFor mounting tissue
cryogenic glovesVWR97008-198protect hands from liquid nitrogen
cryogenic tweezersVWR82027-432Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen
dewar flask-1900 mLThomas Scientific5028M54Hold liquid nitrogen
Feather BladesElectron Microscopy Sciences72002-01Scalpel Blades
Fine Forecps x 2Fine Science Tools11252-20One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone.
FITC-conjugated anti HRPJackson Laboratories123-545-021Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration
freezer box (Black)Fisher Scientific14100FProtects samples from light
glass pasteur pipettesVWR14637-010Used to transfer samples
glass slidesFisher Scientific12550143For mounting tissue
mounting media (vectashield) anti-fadeVWR101098-042Mounting media retains fluorescent signaling
nail polishElectron Microscopy Sciences72180Seals microscope slides
normal goat serumFisher ScientificPCN5000Prevents non-specific binding of antibodies
paint brushGenesee Scientific59-204Transferring flies
PBSFisher Scientific10-010-023Saline solution for dissecting and staining
Phalloidin 647AbcamAB176759Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration
plastic petri dish (100 mm)VWR25373-100Dissection dish
reinforcement labelsW.B. MasonAVE05722Provides support for glass coverslip over the mounted tissue
sharpening blockGrainger1RDF5Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair
slide folderVWR10126-326Sample storage
standard office scissorsW.B. MasonACM40618Cutting reinforcement labels
Sylgard 184Electron Microscopy Sciences24236-10Coating for dissection dish
Triton-X-100Electron Microscopy Sciences22140Helps to permeabilize tissue
Vannas Disssection SissorsFine Science Tools1500-00Ued for removing fly legs and making an incision on thorax

Ссылки

  1. Casas, C., Manzano, R., Vaz, R., Osta, R., Brites, D. Synaptic failure: focus in an integrative view of ALS. Brain Plasticity. 1, 159-175 (2016).
  2. Lodato, M. A., et al. Aging and neurodegeneration are associated with increased mutations in single human neurons. Science. 359, 555-559 (2018).
  3. López-Erauskin, J., et al. ALS/FTD-linked mutation in FUS suppresses intra-axonal protein synthesis and drives disease without nuclear loss-of-function of FUS. Neuron. 100, 816-830 (2018).
  4. Munsie, L., et al. Retromer-dependent neurotransmitter receptor trafficking to synapses is altered by the Parkinson's disease VPS35 mutation p. D620N. Human Molecular Genetics. 24, 1691-1703 (2015).
  5. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Aβ and synaptic dysfunction. Neuron. 39, 409-421 (2003).
  6. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease is a synaptic failure. Science. 298, 789-791 (2002).
  7. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 17, 35-42 (2007).
  8. Jan, L., Jan, Y. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. The Journal of Physiology. 262, 189-214 (1976).
  9. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
  10. Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. , e51223 (2014).
  11. Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
  12. Fernandes, J., VijayRaghavan, K. The development of indirect flight muscle innervation in Drosophila melanogaster. Development. 118, 215-227 (1993).
  13. Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
  14. Fernandes, J. J., Keshishian, H. Nerve-muscle interactions during flight muscle development in Drosophila. Development. 125, 1769-1779 (1998).
  15. Hebbar, S., Fernandes, J. J. Pruning of motor neuron branches establishes the DLM innervation pattern in Drosophila. Journal of Neurobiology. 60, 499-516 (2004).
  16. Hebbar, S., Fernandes, J. J. A role for Fas II in the stabilization of motor neuron branches during pruning in Drosophila. Developmental Biolology. 285, 185-199 (2005).
  17. Danjo, R., Kawasaki, F., Ordway, R. W. A tripartite synapse model in Drosophila. PloS One. 6, (2011).
  18. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nature Protocols. 8, 2496-2501 (2013).
  19. Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of Visualized Experiments. , e2438 (2010).
  20. Llamusi, B., et al. BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Disease Models & Mechanisms. 6, 184-196 (2013).
  21. Pantoja, M., Fischer, K. A., Ieronimakis, N., Reyes, M., Ruohola-Baker, H. Genetic elevation of sphingosine 1-phosphate suppresses dystrophic muscle phenotypes in Drosophila. Development. 140, 136-146 (2013).
  22. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464, 287-291 (2010).
  23. Viswanathan, M. C., Blice-Baum, A. C., Schmidt, W., Foster, D. B., Cammarato, A. Pseudo-acetylation of K326 and K328 of actin disrupts Drosophila melanogaster indirect flight muscle structure and performance. Frontiers in Physiology. 6, 116 (2015).
  24. Hebbar, S., Fernandes, J. J. Glial remodeling during metamorphosis influences the stabilization of motor neuron branches in Drosophila. Developmental Biology. 340, 344-354 (2010).
  25. Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6, 299-309 (2006).
  26. Ritson, G. P., et al. TDP-43 mediates degeneration in a novel Drosophila model of disease caused by mutations in VCP/p97. Journal of Neuroscience. 30, 7729-7739 (2010).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  28. Klagges, B. R., et al. Invertebrate synapsins: a single gene codes for several isoforms in Drosophila. Journal of Neuroscience. 16, 3154-3165 (1996).
  29. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 7929-7933 (1982).
  30. Wagh, D. A., et al. a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
  31. Marrus, S. B., DiAntonio, A. Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release. Current Biology. 14, 924-931 (2004).
  32. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e2412 (2011).
  33. Maccioni, R., et al. Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS. Scientific Reports. 8, 16002 (2018).
  34. Siddiqi, O., Benzer, S. Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).
  35. Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation. Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).
  36. O'Sullivan, A., et al. Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight. Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159DLMsNMJIHCDrosophila

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены